脯氨酸蓄積能力高的稻科植物及其生產方法

2023-04-26 05:00:41

專利名稱：脯氨酸蓄積能力高的稻科植物及其生產方法
技術領域：
本發明涉及脯氨酸蓄積能力高、耐鹽性、耐乾燥性、耐冷性都很高的稻科植物及其生產方法。
人們已知在包括鹽生植物在內的幾種植物中，植物如果受到高鹽脅迫和乾燥脅迫，細胞內就會蓄積脯氨酸(胺基酸的一種)。蓄積的脯氨酸能夠調節植物細胞內的滲透壓和抑制由於脅迫造成的功能蛋白質的變性。植物內的脯氨酸是在Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)兩個酶的催化下由穀氨酸合成的。而脯氨酸在脯氨酸脫氫酶(ProDH)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶(P5CDH)兩個酶的催化下可分解為穀氨酸。
上述植物如果受到高鹽脅迫或乾燥脅迫等水脅迫(難吸收水的狀態)，P5CR活性及其基因表達水平都升高，P5CS被激活，但P5CR活性及其基因表達仍處於一定的低水平。另外代謝體系的基因表達和酶活性也變成了被抑制的狀態。可是一旦水脅迫被解除，合成體系的基因表達和酶活性被抑制，ProDH基因表達被快速誘導，酶活性也提高，蓄積在細胞內的脯氨酸也快速代謝為穀氨酸。
從以上代謝過程可以認為水脅迫時脯氨酸合成中P5CS成了限速酶，而水脅迫解除後的脯氨酸代謝中ProDH成了限速酶(Yoshiba等，植物細胞生理學(Plant Cell Physiol.)381095-1102(1997))。

發明內容
隨著地球環境的惡化，乾燥和半乾燥造成的鹽類土壤的增加以及由於人口增加造成的食物供應不足狀況越來越嚴重。所以耐高鹽脅迫、乾燥脅迫以及低溫脅迫(難吸收水狀態)的作物的育種在解決世界的糧食問題中起著重要的作用，現在從各個方面在進行研究，有希望取得成果。
本發明的目的在於著眼於植物脯氨酸合成和分解代謝過程中的限速酶Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脫氫酶(ProDH)的重要性，通過基因重組技術對這些酶基因的表達進行控制，提供脯氨酸蓄積能力高，因而耐鹽性、耐乾燥性、耐冷性都提高的稻科植物及其生產方法。
可以通過導入脯氨酸合成體系中的P5CS基因使其表達過量，或是導入分解代謝體系中的ProDH基因的反義(帶有反向鹼基序列)基因來抑制脯氨酸的分解，或是同時導入P5CS基因和ProDH基因，一方面抑制了脯氨酸的分解，而另一方面又促進脯氨酸合成等手段使得水稻和稻科植物的細胞內蓄積高濃度的脯氨酸。
本發明通過蓄積高濃度的脯氨酸，可以在分子水平上對具有耐鹽性、耐乾燥性或耐冷性的水稻和稻科植物進行育種(分子育種)。
到目前為止有關通過促進合成或抑制分解來提高作為抗滲透溶質的脯氨酸濃度還沒有報導。本發明的發明人著眼於P5CS基因和ProDH基因的重要性，為了解決以前沒有解決的新的技術課題，對容易進行基因導入的水稻品種的選定、提高愈傷組織形成速度、水稻用基因導入載體的構建等各個方面進行了研究，開發出新的技術，直至完成本發明。
在本發明中提供了分別或聯合導入來自水稻或Arabidopsis thaliana的脯氨酸的合成基因、脯氨酸分解基因的反義基因，然後進行轉化的稻科植物及其生產方法。
在本發明的稻科植物中導入了編碼脯氨酸合成酶的基因、或是導入了脯氨酸分解酶的反義基因、或是同時導入了這兩個基因。通過這樣構建，可以培養出耐鹽性、耐乾燥性和耐冷性都提高的稻科植物。另外，從本發明的稻科植物收穫的成熟種子，特別是水稻種子歷經數代仍具有保持高的脯氨酸蓄積能力的特點。
本發明雖然是以水稻或稻科食物作為對象，但只要是屬於稻科植物並沒有特別限定。屬於稻科的植物有水稻、玉米、小麥、大麥、黑麥、矮草、穀子和稗子等。本發明特別優選適合於水稻。


圖1A-
圖1D表示重組了脯氨酸合成體系酶P5CS基因和脯氨酸分解代謝酶ProDH基因及其反義基因的水稻用載體。
圖2表示通過基因操作導入了
圖1A-
圖1D給出的載體的水稻沒有表現出脅迫的脯氨酸蓄積量。
圖3表示重組了圖2給出的與脯氨酸相關基因的基因重組水稻的耐鹽性。
具體實施例方式
在本發明的實施例的稻科植物中，導入了來自水稻或Arabidopsisthaliana的脯氨酸(抗滲透溶質)的合成基因、脯氨酸分解基因的反義基因中的任一個或將兩者都導入後進行轉化。
向本發明實施例的稻科植物導入一種基因的例子有(1)含有序列號1記載的序列(鹼基序列和胺基酸序列)的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、(2)含有序列號2記載的序列(鹼基序列和胺基酸序列)的Arabidopsis thaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、(3)含有序列號3記載的序列(鹼基序列和胺基酸序列)的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向鹼基序列)基因。
向本發明實施例的稻科植物導入兩種基因的例子有(1)含有序列號1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因或含有序列號2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因與含有序列號3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向鹼基序列)基因的兩種基因。(2)含有序列號1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因或含有序列號2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因與含有序列號3記載的序列的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向鹼基序列)基因一前一後地(串聯)連接的兩種基因。
在本發明實施例使用的載體中插入了含有序列號1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、含有序列號2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因、含有序列號3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向鹼基序列)基因中的任一個基因，或是插入了水稻或Arabidopsis thalianaP5CS基因與上述的反義基因一前一後地連接的兩個基因。
本發明實施例的稻科植物可以通過以下的任一操作獲得。(1)將上述載體導入來自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖後從愈傷組織再分化植物體。(2)將上述載體導入來自稻科植物的原生質體，從使該原生質體增殖後的集群中使植物體再分化。(3)與通過基因操作導入上述載體後獲得的稻科植物進行雜交。
作為本發明實施例的稻科植物的生產方法有諸如以下的一些例子。(1)利用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)將上述載體導入來自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖後，使植物體再分化。(2)通過電穿孔將上述載體導入取自稻科植物的原生質體，從使該原生質體增殖後的集群中使植物體再分化。(3)與通過基因操作導入上述載體後獲得的稻科植物進行雜交。
在這些生產方法中提供了脯氨酸蓄積能力高而且耐鹽性、耐乾燥性和耐冷性提高的稻科植物的生產方法。
另外，從本發明實施例的稻科植物收穫的成熟種子，特別是水稻種子歷經數代仍保持高的脯氨酸蓄積能力。
以下通過以水稻為例按照步驟詳細說明實現本發明實施例的稻科植物及其生產方法的例子。不用說以下說明的步驟無論是原來步驟還是變更過的步驟也都適用於水稻以外的稻科植物。
(基因的克隆)最開始是從水稻幼苗提取mRNA，利用該mRNA合成cDNA。將該cDNA與由質粒或嗜菌體構建的載體連接，導入宿主微生物(E.coli)中，製備重組DNA。導入該重組DNA的轉化體通過使用Arabidopsis thalianaP5CS基因作為探針的蝕斑雜化技術進行篩選。由於水稻以及Arabidopsisthaliana P5CS基因的序列已有報導(Yoshiba等人，植物學(Plant.J).(1995)7751-760、Igarashi等人，植物分子生物學(PlantMol.Biol.)(1997)33857-865)，以這些序列作為基礎設計引物，然後利用PCR進行篩選，篩選出目的轉化體。從得到的轉化體分離出目的質粒，如果需要，可以用限制性內切酶切，然後通過對質粒載體亞克隆使其克隆。Arabidopsis thaliana P5CS基因也用與水稻克隆化同樣的方法進行克隆。但是，提取mRNA的樣品可以是從通常環境下培育的，但最好是實施高鹽脅迫(浸在250mM NaCl溶液中)或乾燥脅迫處理的樣品。因為這樣操作可以誘導對高鹽脅迫或乾燥脅迫應答的P5CS基因(Yoshiba等人，植物(Plant.J).(1995)7751-760、Igarashi等人，PlantMol.Biol.(1997)33857-865、Yoshiba等人，細胞生理學(Plant CellPhysiol.)(1997)381095-1102)。
另外Arabidopsis thaliana ProDH基因(序列已經由Kiyosue等人報導過植物細胞(Plant Cell)(1996)81323-1335)也可以利用上述方法進行克隆。但是提取mRNA的樣品最好是用給予乾燥脅迫(大約處理10小時)後，然後再浸入水中吸收水的樣品或者是浸入脯氨酸溶液吸收脯氨酸的樣品等。這樣做是由於ProDH基因受到水脅迫期間其表達受到抑制，而通過高濃度的脯氨酸又可誘導該基因的表達(Kiyosue等人Plant Cell)(1996)81323-1335、Yoshiba等人，植物細胞生理學(PlantCell Physiol.)(1997)381095-1102)。
如果使用以上樣品，P5CS基因和ProDH基因不僅可以從水稻或Arabidopsis thaliana分離出，也可以從其他稻科植物中分離出來。
(基因導入載體的構建)克隆的各個P5CS基因和ProDH基因用適當的限制性內切酶從質粒中切出，然後如
圖1A-
圖1D所示的那樣連接在將pBI載體改進的水稻用載體花椰菜花葉病毒的35S啟動子的後面。在
圖1A-
圖1D中，RB代表右邊界，35Spro代表花椰菜花葉病毒的啟動子、P5CS代表水稻或Arabidopsisthaliana的脯氨酸合成體系的酶基因、ProDH代表Arabidopsis thaliana的脯氨酸分解代謝體系的酶基因、Noster代表胭脂鹼合成酶基因的終止子、HTP代表潮黴素抗性基因、LB代表左邊界。而箭頭表示基因的有意義方向。
在
圖1A-
圖1D中，
圖1A表示構建的載體圖，載體中的序列依次為RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB。
圖1B與上述A相比，RB-35SPro-P5CS-Noster-35Spro-HTP-Noster-LB的次序與
圖1A的構建相同，但基因P5CS序列為反義序列。
圖1C替換了上述
圖1A構建的基因P5CS，基因ProDH換成反義序列，構建成的載體中基因的次序為RB-35SPro-35SProDH(反義)-Noster-35Spro-HTP-Noster-LB。
圖1D是在上述A的構建中基因ProDH為反義序列、而將上述C給出的構建一前一後地連接，構建的載體為RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-ProDH(反義)-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB。
眾所周知35S啟動子是強力啟動子，是無論在哪種組織中都能穩定誘導基因表達的啟動子。而插入基因的方向對於P5CS是有義方向，而對於ProDH是反義方向連接。
連接了基因的載體利用電穿孔技術導入根癌土壤桿菌EHA101菌中。導入各個構建載體(
圖1A-
圖1D)的根癌土壤桿菌通過含有細菌培養用腖(10g/l)、細菌培養用酵母提取物(10g/l)、氯化鈉(5g/l)、1M氯化鎂(2ml/l)、潮黴素B(50mg/l)的YEP培養基於28℃下培養，使其增殖。用導入了構建載體(
圖1A-
圖1D)的根癌土壤桿菌感染水稻愈傷組織進行基因導入。構建載體D是按照將兩個基因(P5CS基因和ProDH基因)一前一後地連接之後同時導入那樣設計的，而如果將構建載體A和C混合共感染也可獲得與構建載體D感染同樣的效果。
另外，雖然在各個構建載體中都連接了HPT(潮黴素)基因，但由於它是用來作為解析導入基因的效果的基礎研究用，為的是更有效地選擇轉化的細胞和植物體，所以在實際的鹽害地或乾燥地栽培時不必插入它。
(基因導入用水稻愈傷組織的誘導)成熟的水稻種子剝去殼之後，放置於70％乙醇10分鐘，3％次氯酸鈉1小時進行殺菌。殺菌後，用滅菌水將種子洗3次，然後放置在含有1g/l的酪蛋白胺基酸、30g/l的蔗糖、2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸、2g/l脫乙醯吉蘭糖膠的pH5.8的N6培養基(2N6培養基)上，於28℃在黑暗條件下培養3～5周。
(向水稻愈傷組織導入基因)上述誘導的直徑為1～3mm的水稻愈傷組織載置於2N6培養基，於28℃在黑暗條件下培養3～4日。通過這樣培養可以提高愈傷組織細胞的分裂活性。通過將培養的愈傷組織與在YEP培養基中增殖的導入了各個構建載體的根癌土壤桿菌液(菌濃度OD660nm測定值為0.1)混合使其感染進行基因導入。然後愈傷組織於25℃在黑暗條件下培養3天。培養後，用1mg/4ml濃度的頭孢噻肟水溶液將附著在愈傷組織表面上多餘的菌洗幾次進行殺菌，用滅菌的一次性紙巾等擦過後，放置在含有250mg/l的頭孢噻肟、10mg/l的潮黴素B的2N6培養基(一次選擇培養基)上，於28℃在黑暗條件下培養1周。
(轉化愈傷組織的選擇和植物體的再分化)將在含有頭孢噻肟培養基中培養的愈傷組織置於含有30mg/l的潮黴素B的培養基(二次選擇培養基)中，於28℃在黑暗條件下培養3周。然後將愈傷組織移到含有30g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇、酪蛋白胺基酸2g/l、MES緩衝液11g/l、萘乙酸(NAA)2mg/l、kinetin 1mg/l、頭孢噻肟250mg/l、潮黴素B 30mg/l、脫乙醯吉蘭糖膠4g/l的pH5.8的MS培養基(再分化誘導培養基)，於28℃在亮處培養3周。導入了基因的愈傷組織形成綠色斑點，從該斑點分化出芽和根。將分化的愈傷組織再移到含有蔗糖30g/l蔗糖、頭孢噻肟250mg/l、潮黴素B 30mg/l、瓊脂8g/l的去除了植物激素的pH5.8的MS培養基(植物體形成培養基)中，通過於28℃在亮處培養數周使植物體培育得更大些。
(轉化水稻植物體的培育和種子形成)再分化的水稻於培養皿內培育到高度大約4～5cm後移入加入了育苗用土壤的花盆中，在照度大約為2萬流明的人工氣象培育箱內於28℃的溫度條件下一直培育到從第4個葉長到第5個葉為止。將幼苗移到加了含有適量肥料的黑土的盆中，於溫室內培育到種子成熟。再分化的當代的植物體是T0代，從該植物體收穫的種子培育為T1代，一直培育到T2～T3代。在實際農田栽培時，要對各代多次進行各種安全性評價實驗，確認安全之後再推向市場。
(從轉化水稻提取脯氨酸和濃度測定)脯氨酸從T2代或T3代的轉化水稻幼苗(第4葉展開後的幼苗)的葉提取。將在人工氣象培育箱中培育的水稻幼苗的葉用剪刀等剪成大約200mg大小的片，然後在研缽內加入液氮研磨到成粉末狀為止。粉末樣品加入純水再用勻漿器研磨粉碎。粉碎了的樣品於97℃加熱6分鐘後進行冰冷，然後於4℃，17000G條件下離心10分鐘，分離出上清。向得到的上清中加入氯乙酸(最終濃度為5％)混合，離心10分鐘(4℃，17000G)，使蛋白質沉澱。作為抗滲透溶質的脯氨酸包含在離心後的上清中，其濃度可以通過高效液相色譜(HPLC)測定。脯氨酸的定性定量首先要通過HPLC測定濃度一定的各種胺基酸的標準樣品，以他們的保留時間作為基礎進行換算，來定量實際的基因重組水稻葉所含有的脯氨酸的量。
圖2表示的是導入各種基因的重組水稻沒有給予脅迫時的脯氨酸含量。圖中左側空白部位為沒有重組與脯氨酸相關的基因的對照，而右側5個塗黑的條塊圖分別表示插入了與脯氨酸相關的基因的基因重組水稻的各個體系。可以看出脯氨酸的量由於導入的基因的種類不同而不同。
左數第2列是反義導入水稻P5CS基因(OsP5CS)(
圖1B)的水稻幾乎沒有蓄積脯氨酸。左數第3列是有義導入Arabidopsis thaliana P5CS基因(AtP5CS)(
圖1A)的水稻，與對照相比，能看出脯氨酸蓄積量在增加。同樣左數第4列和第5列反義導入Arabidopsis thaliana ProDH基因(AtProDH)的水稻(
圖1C)和有義導入水稻P5CS基因(OsP5CS)(
圖1A)的水稻，分別與對照相比，能看出脯氨酸蓄積量在增加。與此相對應，右端的有義導入水稻P5CS基因(OsP5CS)、反義導入Arabidopsisthaliana ProDH基因(AtProDH)的水稻與上述導入一種基因的水稻相比，可以確認蓄積的脯氨酸量要高得多(最高的比對照高100倍以上)。而且可以看出就有義導入基因的水稻來說，在脯氨酸蓄積方面導入OsP5CS(左數第5列)要比導入AtP5CS(左數第3列)效果稍微好些。
(耐鹽性試驗和基因重組水稻的耐鹽性的提高)圖3表示的是使用圖2右側4列給出的幾個可確認有脯氨酸蓄積的基因重組水稻體系，於250mM濃度(大約是海水鹽濃度的一半)進行耐鹽性實驗的結果。空白部分為沒有插入與脯氨酸相關的基因的對照，塗黑的部分代表基因重組水稻。耐鹽性實驗按照以眾所周知的存活率為指標的實驗方法(特開平09-266726號，發明的名稱植物耐鹽性的簡易評價方法)進行。沒有導入與脯氨酸相關的基因的對照在鹽處理3天後都枯死了，而與此相反，蓄積脯氨酸的重組水稻在鹽處理的第3天存活率為95％，即使處理5天存活率仍高達65％。由此看出，通過利用基因重組提高水稻蓄積脯氨酸的能力可以使耐鹽性提高。
因此，利用本發明培育的稻科作物進一步進行安全性評價等詳細解析，使之品種化，將來有可能在鹽類集積的土壤或沙化土壤中栽培，有望提高糧食生產。另外，對於應付處於發展中國家出現的人口增加也帶來了很大的希望。
利用本發明可以培育成使脯氨酸蓄積能力提高的基因重組稻科植物。另外，由於利用本方法培育的稻科植物的脯氨酸蓄積量提高，所以提高植物的耐鹽性成為可能。
序列表110Hitachi，LTD.
RIKEN日本農業科學國際研究中心生物技術高級研究所(BRAIN)120通過脯氨酸和它的產物的濃度蓄積研究發明的轉基因水稻植物及其耐環境脅迫的家族。130NT01P0353160321012112549212DNA213Oryza sativa L.220221CDS22299..2249300301Yumiko Igarashi，Yoshu Yoshiba，YukikaSanada，Kazuko Yamaguchi-Shinozaki，Keishiro Wada，Kazuo Shinozaki302Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的特徵以及該基因表達和在Oryza sativa L中耐鹽性之間的關係。303植物分子生物學30433306857-8653071996-12-03308D497143091995-03-164001gcggctgcgg cggcaaggcg gcgagacgtg ggagagggat ttacaggtag agggagaggg 60tggaggagga gaggctgagg ctaggaagcg gtttcgcc atg gcg agc gtc gac ccg 116Met Ala Ser Val Asp Pro1 5tcc cgg agc ttc gtg agg gac gtg aag cgc gtc atc atc aag gtg ggc 164Ser Arg Ser Phe Val Arg Asp Val Lys Arg Val Ile Ile Lys Val Gly10 15 20act gca gtt gtc tcc aga caa gat gga aga ttg gct ttg ggc agg gtt 212Thr Ala Val Val Ser Arg Gln Asp Gly Arg Leu Ala Leu Gly Arg Val25 30 35gga gct ctg tgc gag cag gtt aag gaa ctg aac tct tta gga tac gaa 260Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Glu Leu Asn Ser Leu Gly Tyr Glu40 45 50gtg att ttg gtc acc tca ggt gct gtt gga gtg ggg cga 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5 10 15gct ttt agc ccg gtg ggt cct ccc acc gtg act gct tcc acc gcc gtc214Ala Phe Ser Pro Val Gly Pro Pro Thr Val Thr Ala Ser Thr Ala Val20 25 30gtc ccg gag att ctc tcc ttt gga caa caa gca ccg gaa cca cct ctt262Val Pro Glu Ile Leu Ser Phe Gly Gln Gln Ala Pro Glu Pro Pro Leu35 40 45 50cac cac cca aaa ccc acc gag caa tct cac gat ggt ctc gat ctc tcc310His His Pro Lys Pro Thr Glu Gln Ser His Asp Gly Leu Asp Leu Ser55 60 65gat caa gcc cgt ctt ttc tcc tct atc cca ace tct gat ctc ctc cgt358Asp Gln Ala Arg Leu Phe Ser Ser Ile Pro Thr Ser Asp Leu Leu Arg70 75 80tcc acc gcc gtg ttg cat gcg gcg gcg ata ggt cct atg gtc gac cta406Ser Thr Ala Val Leu His Ala Ala Ala Ile Gly Pro Met Val Asp Leu85 90 95ggg acg tgg gtc atg agc tct aaa ctt atg gac gct tcg gtg acg cgt454Gly Thr Trp Val Met Ser Ser Lys Leu Met Asp Ala Ser Val Thr Arg100 105 110ggc atg gtt tta ggg ctt gtg aaa agt acg ttt tat gac cat ttt tgc502Gly Met Val Leu Gly Leu Val Lys Ser Thr Phe Tyr Asp His Phe Cys115 120 125 130gcc ggt gaa gat gcc gac gca gcc get gag cgc gtg aga agc gtt tat550Ala Gly Glu Asp Ala Asp Ala Ala Ala Glu Arg Val Arg Ser Val Tyr135 140 145gaa gct act ggt ctt aaa ggg atg ctt gtc tat ggc gtc gaa cac gcc598Glu Ala Thr Gly Leu Lys Gly Met Leu Val Tyr Gly Val Glu His Ala150 155 160gat gac gct gta tct tgt gat gat aac atg caa caa ttc att cga acc646Asp Asp Ala Val Ser Cys Asp Asp Asn Met Gln Gln Phe Ile Arg Thr165 170 175att gaa gct gcc aaa tct tta cea aca tct cac ttt agc tca gtg gtt694Ile Glu Ala Ala Lys Ser Leu Pro Thr Ser His Phe Ser Ser Val Val180 185 190gtg aag ata act gcc att tgt cca att agt ctt ctg aaa cga gtg agc742Val Lys Ile Thr Ala Ile Cys Pro Ile Ser Leu Leu Lys Arg Val Ser195 200 205 210gat ctg ctg cgg tgg gaa tac aaa agt ccg aac ttc aaa ctc tca tgg790Asp Leu Leu Arg Trp Glu Tyr Lys Ser Pro Asn Phe Lys Leu Ser Trp215 220 225aag ctc aaa tcg ttt ccg gtt ttc tcc gaa tcg agt cct ctc tac cac838Lys Leu Lys Ser Phe Pro Val Phe Ser Glu Ser Ser Pro Leu Tyr His
230 235 240aca aac tca gaa ccg gaa ccg tta acc gcg gaa gaa gaa agg gag ctc886Thr Asn Ser Glu Pro Glu Pro Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Glu Leu245 250 255gaa gca gct cat gga agg att caa gaa atc tgt agg aaa tgc caa gag934Glu Ala Ala His Gly Arg Ile Gln Glu Ile Cys Arg Lys Cys Gln Glu260 265 270tcc aat gta cca ttg ttg att gat gcg gaa gac aca atc ctc caa ccc982Ser Asn Val Pro Leu Leu Ile Asp Ala Glu Asp Thr Ile Leu Gln Pro275 280 285 290gcg atc gat tac atg gct tat tca tcg gcg atc atg ttc aat gct gac1030Ala Ile Asp Tyr Met Ala Tyr Ser Ser Ala Ile Met Phe Asn Ala Asp295 300 305aaa gac cga cca atc gtt tac aac acg att cag gcg tac ttg aga gac1078Lys Asp Arg Pro Ile Val Tyr Asn Thr Ile Gln Ala Tyr Leu Arg Asp310 315 320gcc ggt gag aga ctg cat ttg gca gta caa aat gct gag aaa gag aat1126Ala Gly Glu Arg Leu His Leu Ala Val Gln Asn Ala Glu Lys Glu Asn325 330 335gtt cct atg ggg ttc aag ttg gtg aga ggg gct tac atg tct agc gaa1174Val Pro Met Gly Phe Lys Leu Val Arg Gly Ala Tyr Met Ser Ser Glu
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455 460 465cga cgc gct tat gag aac cgg gga atg atg gcc acc gga gct cat gac1558Arg Arg Ala Tyr Glu Asn Arg Gly Met Met Ala Thr Gly Ala His Asp470 475 480cgt caa ctc atg agg atg gaa ctt aag agg aga tta atc gcc ggg att1606Arg Gln Leu Met Arg Met Glu Leu Lys Arg Arg Leu Ile Ala Gly Ile485 490 495gcg taaagagaga gtatggagcc attaaatgaa attgggaaat gtagatgaat 1659Alaaaatttcttc tatgtagttt aagaaattga aaacaaaaaa ttataatata agaaatggag 1719taggtaagaa catttcctgt ggctaaatat ttttcatgag ggactatgtt tttactatca 1779atatatcatt cacaaatgta tattcacctt atcaataaaa atgcttttta cttt183權利要求
1.稻科植物，其特徵是，導入了含有序列號1記載的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因。
2.稻科植物，其特徵是，導入了含有序列號2記載的序列的Arabidopsisthaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因。
3.稻科植物，其特徵是導入了含有序列號3記載的序列的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脫氫酶)基因的反義(帶有反向鹼基序列)基因。
4.稻科植物，其特徵是，導入了含有序列號1記載的序列的水稻P5CS基因或含有序列號2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因與含有序列號3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因。
5.稻科植物，其特徵是，將含有序列號1記載的序列的水稻P5CS基因或含有序列號2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因與含有序列號3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因一前一後地連接後導入。
6.載體，其特徵是，插入了含有序列號1記載的序列的水稻P5CS基因、含有序列號2記載的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因、含有序列號3記載的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因中的任一個基因，或是將水稻或Arabidopsis thaliana P5CS基因與上述的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反義基因一前一後地連接後插入。
7.稻科植物，其特徵是將權利要求6記載的載體導入來自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖後從愈傷組織再分化植物體培育的。
8.稻科植物，其特徵是將權利要求6記載的載體導入來自稻科植物的原生質體，從使該原生質體增殖後的集群中使植物體再分化培育的。
9.稻科植物，其特徵是與通過基因操作將權利要求6記載的載體導入後獲得的稻科植物進行雜交得到的，導入了將權利要求6記載的載體。
10.權利要求1至9中任一項記載的稻科植物，是水稻。
11.稻科植物的種子，其特徵是從權利要求1至9中任一項記載的稻科植物收穫的。
12.稻科植物的種子，其特徵是權利要求1至9中任一項記載的稻科植物是水稻，種子是從上述水稻收穫的。
13.稻科植物的生產方法，其特徵是利用根癌土壤桿菌將權利要求6記載的載體導入來自稻科植物的愈傷組織，使該愈傷組織增殖後，從上述的愈傷組織使植物體再分化。
14.稻科植物的生產方法，其特徵是通過電穿孔將權利要求6記載的載體導入取自稻科植物的原生質體，從使該原生質體增殖後的集群中使植物體再分化。
15.稻科植物的生產方法，其特徵是與通過基因操作將權利要求6記載的載體導入後獲得的稻科植物進行雜交，導入了權利要求6記載的載體。
全文摘要
為了獲得通過提高脯氨酸蓄積能力來提高耐鹽性水平的轉化稻科植物，利用基因操作技術將水稻P5CS(Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶)基因或Arabidopsis thaliana P5CS基因與Arabidopsis thaliana ProDH基因(脯氨酸脫氫酶)的反義(帶有反向鹼基序列)基因導入到稻科植物中。
文檔編號A01H5/00GK1390939SQ0114407
公開日2003年1月15日 申請日期2001年12月28日 優先權日2001年6月8日
發明者吉羽洋周, 篠崎和子, 篠崎一雄 申請人:株式會社日立製作所, 獨立行政法人國際農林水產業研究中心, 理化學研究所, 生物系特定產業技術研究推進機構