來曲唑在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物中的應用的製作方法

2023-04-26 11:40:01

專利名稱：來曲唑在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的激素誘導犢牛卵泡發育方法，具體地說，涉及來曲唑在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物中的應用，可用於利用激素誘導後採集的卵母細胞生產轉基因克隆家畜、家畜育種及瀕危物種的保護。屬於應用型胚胎生物技術領域。
背景技術：
激素誘導犢牛卵泡發育的理論基礎來源於成年母牛超排技術，即通過外源促性腺激素處理犢牛誘導卵巢卵泡發育，增加可利用的卵母細胞數，同時結合活體採卵技術體外生產高發育能力的胚胎，並通過胚胎移植技術植入發情成年受體母牛，附植後成功經歷全期發育並產犢。此項技術具有獨特的技術優勢，能夠超常規快速擴繁重要稀缺品種，突破國外對相關種質資源的壟斷；大幅度縮短家畜品種培育時間，快速改變我國自主培育品種缺少的局面；充分挖掘種畜生殖潛力，迅速擴大良種覆蓋率；降低良種成本，有效促進農民增收，減少飼養總量，切實緩解生態壓力。此項技術國外研究較早，始於上世紀40年代。隨著超聲波等活體採卵技術的應用、犢牛卵母細胞體外培養體系的建立與完善，此項技術得到迅猛的發展。目前為止，國內外學者已從供體的選擇、超排年齡、激素處理方案、激素處理後卵巢反應、重複超排、卵母細胞發育能力、胚胎冷凍及遺傳等角度進行了研究。實踐證明:經過激素處理犢牛能夠獲得大量的卵母細胞，卵母細胞在體外受精後能夠形成具有發育能力的胚胎，且一些研究證明，體外生產的胚胎經移植後獲得了健康的後代。但是由於誘導選用的激素種類、供體牛的年齡、體況、生理狀態、環境及營養等因素的影響，激素處理後的卵巢反應同成年牛一樣，個體間差異很大，尚缺少高效、穩定的激素誘導方案，逐漸成為該項技術推廣應用的瓶頸因素。自然條件下，犢牛出生後5d新生卵巢含有75000到300000個卵母細胞，發育至2月齡階段卵巢有腔卵泡數量可達50個，但在整個生命階段經自然發情排出的卵子數量很少，大量的卵泡都在發育的不同階段閉鎖退化，導致卵泡遺傳資源的巨大浪費。利用激素誘導促使犢牛卵巢卵泡發育，同時結合體外胚胎生產技術體系，可以加快良種擴繁速度，大幅縮短世代間隔。目前使用的犢牛激素誘導方案仍然借鑑於成年牛的超排方案，主要是卵泡刺激素(FSH)遞減劑量連續注射2-3d ;基於犢牛的體重低於成年牛，同時考慮其卵巢內部對促性腺激素的反饋抑制機制的形成尚未建立，一般FSH的使用劑量低於成年牛。綜合現有文獻結果表明:犢牛在2-3月齡激素誘導能夠獲得較好的卵巢反應，且一些研究在使用陰道栓製劑(CIDR)的同時，連續2d使用FSH(40，30，30，30mg)獲得了較多的卵母細胞，但個體間差異依然很大。因此，激素誘導犢牛卵泡發育亟需新型的高效、穩定的方案來克服個體差異大的瓶頸因素，充分挖掘良種犢牛在卵泡閉鎖前豐富的種質資源。來曲唑(LE)為非留體類第三代芳香化酶抑制劑，最早應用於人絕經期乳腺癌的臨床治療。近年來動物實驗和臨床研究 表明LE具有促排卵作用。促排機理可能通過抑制芳香化酶的活性，阻礙雄激素向雌二醇的轉化，降低機體內雌激素水平，從而解除雌激素對下丘腦和(或)垂體的負反饋作用，使垂體促性腺激素分泌增加，促進卵泡的發育和排卵；另外卵巢內雄激素暫時性的增多，從而增加卵巢內卵泡對FSH的敏感性，同時卵巢內雄激素的增加能夠刺激胰島素樣生長因子I(IGFl)以及內分泌、旁分泌因子與FSH協同作用促進卵泡發育和排卵。LE為口服劑型，生物利用度高達99.9%，具有高度選擇性，可阻斷98%以上的芳香化酶活性，半衰期較短，代謝速度快，無副作用。大量的研究表明，LE與FSH聯合使用提高了超排效率，是一種新型的促排卵藥物，目前已廣泛應用於人的促排卵治療及實驗動物研究，但是在犢牛激素誘導卵泡發育的方案改進方面尚無應用報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種來曲唑在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物及輔助藥物中的應用。本發明的另一目的是提供一種誘導犢牛卵泡發育的方法。為了實現本發明目的，本發明提供來曲唑(LE)在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物及輔助藥物中的應用。本發明來曲唑與卵泡刺激素(FSH)聯合用於製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物。本發明研究人員經過研究發現，來曲唑(LE)可提高卵母細胞獲取效率，增加可利用的卵母細胞數量，且半衰期較短，代謝速度快，無副作用。本發明利用LE對內分泌及旁分泌的影響及卵巢卵泡募集的作用，在常規激素誘導方法使用FSH的同時結合LE，促進犢牛卵泡發育，通過採卵技術提高卵母細胞獲取效率，充分挖掘良種牛在卵泡閉鎖前豐富的種質資源，加速良種選育及擴繁技術體系，大幅度提高育種效率和技術水平。本發明提供一種誘導犢牛卵泡發育的方法，包括如下步驟:I)卵泡同期化發育處理:將犢牛經孕酮持續處理8天；2)卵泡刺激素、來曲唑聯合處理 第6天開始每間隔12小時使用一次卵泡刺激素，連續2天，在第7天後聯合使用來曲唑。其中，所述來曲唑的用量為10_80mg/頭，優選為20mg/頭。所述卵泡刺激素使用4次,用量為30_40mg/頭。所述孕酮的用量為320_350mg/頭,在使用最後一次卵泡刺激素停止。本發明通過針對外源FSH注射犢牛後活化芳香化酶活性，增加雌激素的產量，導致負反饋作用於下丘腦和(或)垂體，使內源FSH分泌下降，影響了激素誘導效果的問題，在注射FSH後使用LE抑制芳香化酶活性。LE是一種強效的芳香化酶抑制劑，其選擇性抑制雌激素的合成，顯著降低血清中雌激素水平，解除雌激素對下丘腦和(或)垂體的負反饋作用，使內源垂體促性腺激素分泌增加，促進卵泡的發育，增加可利用的卵母細胞數量；另外其半衰期較短，代謝速度快，無副作用，能夠成為犢牛激素誘導輔助藥物在畜牧業生產上推廣應用。
具體實施例方式以下實施例用於說明 本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1
本實施例採用實踐證明的使用FSH的較好的激素誘導方案同時口服LE，通過口服不同劑量的LE確定最佳誘導犢牛卵泡發育的LE使用劑量。犢牛在第Od早8:00插入陰道栓製劑(CIDR)，第8d最後I次FSH注射後12h取出；第6d開始注射FSH，FSH連續注射2天，每天2次，時間為早晨8:00，晚上8:00 ;在第I次FSH注射24h後，即第3針FSH注射時使用不同劑量的LE，LE處理劑量分別為10mg、20mg、40mg及80mg，同時以未處理為對照。本實施例採用FSH、LE誘導後取卵觀察卵巢卵泡數量，然後採集卵母細胞。卵母細胞採集後經過體外培養，受精後7d胚胎發育到囊胚階段，通過胚胎移植技術植入經過同期發情處理後具有明顯發情的表現的成年受體牛，胚胎附植後經過全期發育產犢。通過觀測的卵泡數，採集的顆粒細胞基本包裹卵母細胞、胞質均勻的卵母細胞數量(A和B級卵母細胞)，體外生產的胚胎數及移植後產犢數確定最佳LE使用劑量。具體地說，使用本發明來曲唑的牛的激素誘導卵泡發育方案:(1)卵泡同期化發育處理:選擇體況良好、體重均一的2-3月齡犢牛(10頭，60kg)，在第O天早晨8:00插入陰道孕酮栓製劑(CIDR，紐西蘭)，孕酮量為330mg，處理8d，最後I次FSH注射後12h取出。(2) FSH, LE處理 第6d開始間隔12h連續注射FSH(加拿大，Folltropin) 2d，早8:00，晚8:00，劑量為40，30，30，30mg，在第7d早8:00第3次注射FSH後口服LE, LE處理劑量分別為10mg、20mg、40mg及80mg,同時以未處理為對照。(3)活體採卵:犢牛被固定，手術前中腹側速眠新麻醉；手術後計數大於2mm卵泡數，採用18號針頭的IOml注射器抽卵，吸卵液為D-PBS，補充100IU/ml的青黴素、100ug/ml的鏈黴素、3mg/ml的BS A及60IU/ml肝素鈉；採集液過濾後注入滅菌的IOml離心管內37°C放置，D-PBS洗滌3次，轉入35mm滅菌平皿中，體視鏡下根據形態分類，確定各類卵母細胞數量。分類標準:A級,卵丘細胞緻密含有3層以上顆粒細胞,細胞質均勻出級,卵丘細胞1-3層，基本包裹卵母細胞，胞質均勻的卵母細胞；(:級，卵丘細胞較少或卵丘細胞擴散的卵母細胞；D級，卵丘細胞全部脫落的裸卵、變形卵，包括退化卵。(4)體外胚胎生產:活體採集的A、B級卵母細胞進行成熟培養，採用四孔板500ul成熟培養液培養，培養液含有FSH 10ug/ml, LH (黃體生成素)lug/ml，E2 (雌二醇)lug/ml的TCM199(組織培養液)；培養條件為含5% CO2的空氣，溫度38.5°C，飽和溼度，培養時間為24h。體外受精採用BO液，將成熟的卵母細胞在受精液中清洗2-3次後放入平衡好的受精液中；然後採用上浮法處理精液後離心2次(1500轉，離心5min)，離心後調整精子濃度添加入已放入卵母細胞的受精液中，最終受精液精子濃度為IX 106/ml ;培養條件為5% CO2的空氣，溫度38.5°C，飽和溼度，受精時間為8h。受精後的合子在發育液清洗3次放入平衡2h的IOOul前期發育液中，培養2d後計數卵裂胚胎後移入IOOul後期發育液培養5天，間隔兩天半量換液，胚胎發育第7天計數囊胚；培養條件為5% CO2的空氣，溫度38.5°C，飽和溼度。(5)胚胎移植:選擇體況良好，通過直腸檢查結合B超診斷確定卵巢具有功能性黃體，符合胚胎移植受體要求的受體母牛；經過同期發情處理後，按胚胎移植操作規程對供體牛進行保定，清除直腸糞便，清洗並清毒外陰後，將新鮮胚胎移植到受體牛子宮角基部(黃體的卵巢同側)。(6)獲取卵母細胞及胚胎數量
實驗結果顯示，LH聯合FSH使用促進了卵泡發育，卵泡數量、可用卵母細胞數量及囊胚數量均高於未經LE處理的對照。其中LE20mg處理效果最好，每頭犢牛卵泡數(55.9vs39.4)、可用卵母細胞數(42.3vs 28.3)及囊胚數(5.9vs 3.1)均顯著(P < 0.05)高於對照，具體見表I。表ILE聯合FSH處理對犢牛卵泡發育、卵母細胞數及胚胎數量的影響(平均數土標準誤，η= 10)
權利要求
1.來曲唑在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物及輔助藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述來曲唑與卵泡生成素聯合使用。
3.一種誘導犢牛卵泡發育的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)卵泡同期化發育處理:將犢牛經孕酮持續處理8天； 2)卵泡刺激素、來曲唑聯合處理:第6天開始每間隔12小時使用一次卵泡刺激素，連續2天，在第7天後聯合使用來曲唑。
4.根據權利要求3所述的誘導犢牛卵泡發育的方法，其特徵在於，所述來曲唑的用量為 10-80mg/頭。
5.根據權利要求4所述的誘導犢牛卵泡發育的方法，其特徵在於，所述來曲唑的用量為20mg/頭。
6.根據權利要求3-5任意一項所述的誘導犢牛卵泡發育的方法，其特徵在於，所述卵泡刺激素使用4次,用量為40-30mg/頭。
7.根據權利要求3-6任意一項所述的誘導犢牛卵泡發育的方法，其特徵在於，所述孕酮用量為320-350mg/頭。
8.根據權 利要求3-7任意一項所述的誘導犢牛卵泡發育的方法，其特徵在於，所述孕酮在使用最後一次卵泡刺激素停止。
全文摘要
本發明提供了來曲唑在製備激素誘導犢牛卵泡發育藥物及輔助藥物中的應用。本發明利用LE對內分泌及旁分泌的影響及卵巢卵泡募集的作用，在常規激素誘導方法使用FSH的同時結合LE，促進犢牛卵泡發育，提高卵母細胞獲取效率，充分挖掘良種牛在卵泡閉鎖前豐富的種質資源，加速良種選育及擴繁技術體系，大幅度提高育種效率和技術水平。
文檔編號A61P15/08GK103169698SQ20111043483
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者田見暉, 賈振偉, 吳中紅, 張家新, 安磊 申請人:中國農業大學