與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記及其用法的製作方法

2023-05-10 04:15:46 1

專利名稱：與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記及其用法的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物分子育種技術領域，具體涉及一種與小麥抗白粉病基因PmLK906 連鎖的PCR標記及其用法。
背景技術：
小麥是世界上第二大糧食作物，是我國最重要的農作物，僅河南省每年播種面積 就達7000萬畝以上。病害是造成小麥減產的主要原因之一，小麥銹病、紋枯病、赤黴病、黑 穗病、黃矮病等在黃淮麥區均有發生，而白粉病則是發病最早、持續時間最長、危害最嚴重 的病害，其發病範圍廣、危害嚴重，呈上升趨勢。1990年白粉病發病面積達1800萬ha2，約 佔我國小麥麵積的1/2，為1981年的3. 6倍。白粉病一般可造成13% 34%的產量損失， 嚴重年份減產高達30% 50%，並嚴重影響小麥的品質。從2009年4月初開始，白粉病在 河南省大面積流行，嚴重程度為近年罕見。而大面積推廣品種均感白粉病，無法控制白粉病 流行。雖然藥物對小麥白粉病有一定的防治作用，但存在以下不足，首先是藥物防治不 能杜絕病害流行；第二是白粉病發病周期短，僅5 7天，在小麥白粉病流行期間要控制發 病程度需要噴灑藥物3 4次；第三是藥物防治增加成本，按3次施藥，每畝要增加人力、藥 物投入約50元；第四是藥物防治影響小麥品質；第五是藥物殘留不利於環境保護和小麥的 綠色生產。2009年在豫北麥區調查結果表明，藥物防治白粉病效果下降。目前，國際上已經正式命名了 39個小麥抗白粉病基因，但大多已喪失抗性，因 此，尋找有效抗病基因，培育抗病小麥新品種是小麥育種家的重要任務之一。小麥「蘭 考90(6)，，是沈天民研究員選育的抗白粉病品系(王祖華，牛吉山，郭天財，張麗娜，沈天 民.2004.小麥主栽品種中的IRS分布和蘭考90(6)系列白粉病新抗源.西北植物學 報，24:1216-1220)。我們的研究表明，「蘭考90 (6) 」攜帶1對隱性抗白粉病基因，命名 為PmLK906，是目前我國少數有效的抗白粉病基因之一(牛吉山，王映紅，周益林，段霞 瑜，沈天民.2006.普通小麥「蘭考90(6)」品系白粉病抗性遺傳.植物病理學報，36 (6) 528-533)。

發明內容
本發明的目的在於提供一種與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記及其用法。本發明的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記，命名為Xgdm93_122，是由 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴增。與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記引物的用法以待測小麥基因DNA 作為模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作為引物1，以SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列 作為引物2進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有122bp片段特異帶，能擴增出122bp片段 特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴增出122bp片段特異帶的單株不攜帶抗病基因 PmLK906。所述PCR擴增反應體系PCR試劑組成為H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ LdNTP(25mmol/L) 1.6μ L引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ LTaq 酶(20u/yL) 0. 16 μ L模板DNA (50ng/ μ L) l.OyL總體積20.0yL，PCR擴增程序為先在94°C預變性4分鐘；接35個循環的94°C變性30秒，50°C復 性45秒，72°C延伸30秒；最後在72°C延伸10分鐘，4°C保存待檢測。所述檢測擴增產物方法為擴增產物在6%的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳上進行分 離，然後用銀染法進行顯色。本發明通過抗病品系「蘭考90(6) 」與感病品種「中國春」雜交建立了 F3代分離群 體，用分池法建立抗、感DNA池，篩選出與抗病基因PmLK906連鎖的分子標記Xgdm93_l22，發 展出能在不同小麥遺傳背景下跟蹤檢測PmLK906的PCR分子標記輔助選擇技術。本發明與現有技術相比較的優點及有益效果如下本發明提供了小麥抗白粉病基因PmLK906的PCR分子標記Xgdm93_122，該標記與 PmLK906基因緊密連鎖，PmLK906基因是目前我國少數有效的抗白粉病基因之一，可以對抗 病基因PmLK906進行分子標記輔助選擇，從而實現與其它有效抗病基因的累加，延長品種 的抗病性。利用這種方法，不僅克服了常規育種方法所需時間周期長等缺點，有目標地將抗 病基因快速轉入感病品種，而且可有目的地聚合多個有效抗白粉病基因，培育出具有穩定、 持久抗性的小麥新品種。


圖1是引物gwm265擴增結果；其中，Pk是「蘭考90(6)21_12」;PS是「中國春」;BK是純合抗病DNA池；BS是純合感 病DNA池；S是純合感病植株；R是純合抗病植株；H是雜合植株。圖2引物gdm93擴增結果；其中，Pk是「蘭考90 (6) 21-12」 ;BE是純合抗病DNA池；BS是純合感病DNA池；S是 純合感病植株；R是純合抗病植株；H是雜合植株。圖3分子標記Xgdm93-122與抗白粉病基因PmLK906的連鎖關係。圖4用標記Xgdm93_122檢測回交轉育抗病品系後代；其中，1 「蘭考90(6)21-12」 ；2 「周麥18」 ；R 抗病植株；S 感病植株。
具體實施例方式實施例中未註明材料來源者均購自於國家種子資源庫。1.本發明的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記引物(Xgdm93_122)的篩選過程標記篩選基本過程是提取抗病池DNA和感病池DNA ；選取均勻分布在每條小麥染 色體上的120個SSR引物對，用這些引物在抗、感DNA池中擴增，初步獲得具有多態性產物 的引物對；根據初篩結果提示，確定抗病基因所在的染色體及染色體臂。在此基礎上再選用 更多的抗病基因所在染色體臂上的SSR引物進行篩選，獲得抗病基因連鎖標記。具體步驟 如下(1)植物材料感病親本「中國春」，抗病親本「蘭考90(6)21-12」。配置雜交組合 「中國春」 / 「蘭考90 (6) 21-12」，獲得F1代、F2代分離群體和139個F2:3家系分離群體。同 時還配置了「蘭考90 (6)」 X 「豫麥21」、「蘭考90 (6)」 X 「濮麥9號」、「蘭考90 (6) 」 X 「白 硬冬2號」等抗、感小麥雜交組合，獲得了不同組合的F1代、F2代、F2:3家系，用於標記驗證。(2)白粉病抗性鑑定採用離體葉段培養法接種小麥白粉病菌鑑定親本及雜交後 代材料的抗病性。選用合適的培養皿，放置一層中性濾紙，用40mg/L的6-苄氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine 6-BA)充分溼潤濾紙。待幼苗第一片葉完全展開後，截取3 4cm 葉段，按編號放在濾紙上。接種小麥白粉病菌，用本實驗室通過連續單孢子堆分離純化的 2個白粉病菌株，採用輕拂法人工接種，24小時後再重複接種1次。在光照培養箱內培養， 18°C，每天光照12小時，在感病對照充分發病的情況下(7 10天)按照0 4級反應型 記錄白粉病發病情況，48小時後再重複觀察一次。(3)抗、感病DNA池的構建在「中國春，，/ 「蘭考90 (6) 21_12」雜交F3株系中選擇 10個純合抗病家系構建抗病池，10個純合感病家系構建感病池。(4)小麥葉片基因組DNA的提取參照Sambrook等(1989)編著的《Molecular cloning :a laboratory manual》(Sambrook L, Fritsch EF, Manniatis Τ.Molecular cloning :a laboratory manual. Second Edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York :1989.)進行小麥基因組 DNA 的提取。(5) PCR擴增程序PCR擴增反應在PE9600PCR儀上進行，首先在94°C預變性4分； 94°C變性30秒，根據每對引物的特徵在50 60°C復性45秒，72°C延伸30秒，35個循環； 72°C延伸10分。取出置於4°C冰箱待檢測。(6)擴增產物檢測採用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離技術檢測擴增產物。(7)多態性標記的篩選選取均勻分布在每條小麥染色體上的120個SSR引物對， 在抗、感DNA池中擴增，初步獲得具有多態性產物的引物對gwm265(圖1)。根據初篩結果提 示，抗病基因在2AL染色體臂上。再選用小麥遺傳圖中gwm265附近的SSR引物進行擴增篩 選，發現gdm93能擴增出多態帶。在抗、感親本和抗、感DNA池中擴增出一致多態性條帶的 引物gwm265和gdm93，再在139個F3分離群體中進行擴增，計算連鎖遺傳距離。最終證明 g碰265(圖1)和gdm93(圖2)引物對擴增的條帶與PmLK906基因緊密連鎖(表1)。(8)連鎖分析採用Joinmap3. 0軟體進行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析， 計算目的基因與分子標記的遺傳距離(圖3)。(9)獲得可以跟蹤PmLK906的共顯性分子標記Xgdm93_122，是由SEQ IDNo. 1所示 的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴增。表IF3分離群體的白粉病反應型和gwm265and gdm93引物擴增結果反應型 品係數
Xgdm93.
權利要求
一個與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記，命名為Xgdm93 122，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴增。
2.權利要求1所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記引物的用法，其特 徵在於以待測小麥基因組DNA作為模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作為引物1， 以SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列作為引物2進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有122bp 片段特異帶，能擴增出122bp片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴增出122bp 片段特異帶的單株不攜帶抗病基因PmLK906。
3.根據權利要求2所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記引物的用法， 其特徵在於所述PCR擴增反應體系PCR試劑組成為H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ L dNTP(25mmol/L) 1. 6μ L 引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L 引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ L Taq 酶(20u/ μ L) 0. 16 μ L 模板 DNA (50ng/ μ L) l.OyL 總體積20. OyL，PCR擴增程序為先在94°C預變性4分鐘；接35個循環的94°C變性30秒，50°C復性45 秒，72°C延伸30秒；最後在72°C延伸10分鐘，4°C保存待檢測。
4.根據權利要求2或3所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記引物的用 法，其特徵在於所述檢測擴增產物方法為擴增產物在6%的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳上 進行分離，然後用銀染法進行顯色。
全文摘要
一個與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標記及其用法，屬於植物分子育種技術領域。標記命名為Xgdm93-122，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴增。用法為以待測小麥基因組DNA作為模板，以Xgdm93-122的引物進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有122bp片段特異帶，能擴增出122bp片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴增出122bp片段特異帶的單株不攜帶抗病基因PmLK906。所述的分子標記可以在不同小麥遺傳背景中準確檢測PmLK906基因的存在，該技術可以加快PmLK906基因向小麥生產品種中的轉育速度。
文檔編號C12Q1/68GK101955986SQ20091006542
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優先權日2009年7月14日
發明者倪永靜, 尹鈞, 牛吉山, 王保勤, 王正陽 申請人:河南農業大學