一種提高低溫保存後毛桐種子胚活力的方法與流程
2023-05-09 23:56:41 3
本發明屬於植物種質資源保存技術領域，具體地，涉及一種提高低溫(-18℃至-20℃)保存後毛桐種子胚活力的方法。
背景技術：
毛桐(mallotusbarbatus(wall.)muell.arg.)是大戟科(euphorbiaceae)野桐屬(mallotuslour.)小喬木樹種。分布於亞洲東部和南部各國。國內主要產於雲南、四川、貴州、湖南、廣東和廣西等。生於海拔400-1300米林緣或灌叢中。
莖皮纖維可作製紙原料；木材質地輕軟，可制器具；種子油可作工業用油。目前未見毛桐種子萌發及儲藏方面研究報導。
將正常型種子乾燥後低溫(-18℃至-20℃)保藏可以極大的延長其壽命，這在國際上已經形成共識，並且基於這一理論建立了多個農作物及野生植物種子庫；但一些植物的種子在冷藏後胚的活力會發生變化，從而導致種子活力下降，影響庫存質量。因此提高及改善低溫冷藏後種子胚的活力對於長期高效保存及合理利用植物種質資源有著重要的意義。
目前對種子進行活力檢測的方法主要有萌發及氯化三苯基四氮唑(ttc)染色法(也叫tz染色法)。在保存實踐中本發明發現冷藏後毛桐種子幾乎不能萌發，對其進行ttc染色後發現，只有少數種子的胚可以染色，幾乎全部種子的胚乳均不能染色；結合該屬其他類群(如白背葉、白楸及尼泊爾野桐，均另案報導)中的發現本發明判斷可能是由於胚及胚乳在冷藏過程中發生某種變化而導致的活力下降，進而影響種子的整體活力及萌發率；為此發明了本發明的方法，用以提高胚的活力。對於該物種低溫冷藏後的種子，目前尚無有效方法使其萌發，因此胚活力的評價採用ttc染色法。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術中在低溫(-18℃至-20℃)保存一段時間後的毛桐種子胚活力大幅下降甚至幾乎完全喪失的技術難題，提供一種簡便高效提高低溫保存後毛桐種子胚活力的方法。為實現該物種的長期有效保存及利用提供技術支持。
為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：
一種提高低溫保存後毛桐種子胚活力的方法，包括如下步驟：
(1)將在-18℃至-20℃冷藏保存後的種子連同其密閉容器取出，在溫度為15℃、相對溼度15％的環境中放置24小時回溫；
(2)將回溫後的種子從密閉容器中取出，放置在溫度為45℃的培養箱中，熱處理6小時後取出；
(3)將步驟(2)處理後的種子取出，待種子溫度恢復到室溫後放置於1％的瓊脂培養基上，放置於20℃培養間24小時；
(4)將上述步驟(3)處理後的種子切破種皮及胚乳；
(5)將上述步驟(4)處理後的種子浸泡於1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置於30℃黑暗條件下48小時；
(6)將上述步驟(5)處理後的種子切開觀測胚染色情況，具有活力的胚顯示均勻的紅色。
根據所述的一種提高低溫保存後毛桐種子胚活力的方法，其中所述步驟(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的種子是採集成熟飽滿的種子，先將種子置於溫度為15℃、相對溼度15％的環境中直到種子的平衡相對溼度達到15％(此時種子的含水量通常低於10％)，然後再將種子放入密閉容器中，保存於-18℃至-20℃。
本發明為一種提高低溫保存後毛桐種子胚活力的方法，更具體的步驟是：
採集成熟飽滿的種子，將種子置於溫度為15℃、相對溼度15％的環境中，至種子的平衡相對溼度達到15％時，將種子放入密閉容器，保存於-18℃至-20℃中，以上為國際通用的正常型種子保存方法。種子保存一段時間後，將裝有種子的密閉容器取出，在溫度為15℃、相對溼度15％的環境中放置24小時回溫；隨後將種子從容器中取出，放置在培養箱溫度為45℃的培養箱中，熱處理6小時後取出，待種子溫度恢復到室溫後放置於1％的瓊脂培養基上，放置於20℃培養間24小時；處理後的種子切破種皮及胚乳，浸泡於1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置於30℃黑暗條件下48小時；取出種子切開觀測胚染色情況，具有活力的胚顯示均勻的紅色。
具體實施方式
下面用本發明實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本發明。
實施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2013年7月，廣西防城港市上思縣南屏鄉常隆村採集成熟的新鮮毛桐(mallotusbarbatus)種子。採集後運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1乾燥冷藏及冷藏後的回溫：將1.1步驟採集到的種子置於15℃，15％相對溼度的乾燥間中乾燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對溼度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對溼度進行測定，待平衡相對溼度達到15％後裝入密閉的容器中。2014年11月11日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏處理2年1個月後將裝有種子的密閉容器取出。放入15℃，15％相對溼度的乾燥間中24小時回溫後打開裝有種子的容器，根據實驗需要隨機取出相應數量的種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組(冷藏後無處理組)和冷藏後熱處理組；熱處理溫度設置為45、60和70℃，時間設置6個小時。每個處理3個重複，每個重複20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養箱，培養箱溫度設定為45、60和70℃。處理6小時後隨機取出60粒種子用於檢測胚活力。
1.2.4ttc染色：待熱處理後的種子溫度恢復到室溫，將種子放置於1％的瓊脂培養基上，放置於20℃培養間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，並將種子浸泡於1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置於30℃黑暗條件下48小時，染色完成後取出種子，用吸水紙吸乾表面殘餘溶液，將種子切開，觀測胚染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.5數據分析：利用spss16.0軟體對胚染色比例數據進行分析，採用one-wayanova進行方差分析，並用s-n-k法對不同處理時間的染色比例做多重比較。
2.結果
2.1熱處理方法對採自廣西防城港冷藏後的毛桐種子胚活力的影響：
表1不同溫度熱處理對冷藏後廣西防城港毛桐種子胚染色率(％)的影響
數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的胚染色率具有顯著差異
由表1可以看出，冷藏後未經處理的種子(對照組)的胚染色率為13.3％，而45、60及70℃熱處理後胚的染色率均上升到70％以上，與對照均有顯著差異；各個熱處理之間無顯著差異，說明種子胚對熱處理的溫度要求不嚴格；綜合能耗和效果，我們認為45℃處理6小時可以達到理想的效果，且能耗也較低。
實施例2：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2012年8月13日，重慶市涪陵區蕉石鎮採集成熟的新鮮毛桐(mallotusbarbatus)種子。採集後運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1乾燥冷藏及冷藏後的回溫：將1.1採集到的種子置於15℃，15％相對溼度的乾燥間中乾燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對溼度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對溼度進行測定，待平衡相對溼度達到15％後裝入密閉的容器中。2013年8月9日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏3年5個月後將裝有種子的容器取出。放入15℃，15％相對溼度的乾燥間中24小時回溫後打開裝有種子的容器，根據實驗需要隨機取出相應數量的種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組(冷藏後無處理組)和冷藏後熱處理組；熱處理溫度設置為45、60和70℃，時間設置6個小時。每個處理3個重複，每個重複20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養箱，培養箱溫度設定為45、60和70℃。處理6小時後隨機取出60粒種子用於檢測胚活力。
1.2.4ttc染色：待熱處理後的種子溫度恢復到室溫，將種子放置於1％的瓊脂培養基上，放置於20℃培養間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，並將種子浸泡於1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置於30℃黑暗條件下48小時，染色完成後取出種子，用吸水紙吸乾表面殘餘溶液，將種子切開，觀測胚染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.5數據分析：利用spss16.0軟體對胚染色比例數據進行分析，採用one-wayanova進行方差分析，並用s-n-k法對不同處理時間的染色比例做多重比較。
2.結果
2.1熱處理對重慶涪陵冷藏後毛桐種子胚活力的影響。
表2熱處理對冷藏後重慶涪陵毛桐種子胚染色率(％)的影響
註：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的胚染色率具有顯著差異
由表2可以看出，-20℃下冷藏3年5個月的毛桐種子，未經熱處理的種子胚染色率為21.7％；經45℃熱處理後，胚染色率提高到86.7％，60℃略有下降但與45℃無顯著差異；70℃與45℃相比顯著下降，但還是顯著高於對照；說明熱處理有效提高的-20℃冷藏後的種子胚活力。綜合能耗及效果，45℃處理6小時是節能有效的處理方式。
3、本發明的積極效果如下：
由於目前尚無有效萌發毛桐種子的方法，無法以萌發率進行佐證；但參考該屬其他種類(如白背葉、尼泊爾野桐及白楸)的情況，熱處理均有效提高了這三種野桐屬植物種子胚乳的活力以及種子的萌發率；且胚乳染色的變化規律與該種胚染色的變化規律一致。因此我們認為與現有技術相比，本發明有效提高了了不同產地(廣西及重慶)，乾燥後低溫(-18℃至-20℃)下儲存不同時間(2年1個月及3年5個月)的毛桐種子胚的活力。較好的解決了毛桐種子低溫保藏後胚活力大幅下降的問題，後續可嘗試採用活力提高的胚進行離體培養的方法得到新的植株，從而實現該種種質資源在低溫儲藏後的成功擴繁。