治療中風的影響的方法

2023-05-10 08:05:01

治療中風的影響的方法
【專利摘要】本發明提供了在患有中風的受試者中改善大腦功能或預防大腦功能喪失和/或治療或預防運動障礙和/或使大腦神經元再生的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
【專利說明】治療中風的影響的方法
[0001]相關申請
[0002]本申請要求於2012年6月3日提交的名稱為「治療中風的影響的方法」的美國專利申請號61/493，057的優先權。所述申請的全部內容通過引用併入本文。
[0003]序列表
[0004]序列表是與本申請一起以電子形式提交。所述序列表的全部內容通過引用併入本文。
[0005]領域
[0006]本發明涉及治療受試者的中風的影響的方法。
[0007]背景
[0008]在澳大利亞，中風是繼心臟病之後的第二大死亡原因和殘疾的主要原因。在美國，它是死亡的第三大主要原因，每年有超過140，000的人死於中風。在美國，它還是嚴重的長期殘疾的主要原因。在美國，從2005年至2050年期間，中風的計劃花費為2.2萬億美元。
[0009]殘疾影響了 75%的中風後存活者，而足以降低他們的就業能力。中風可以在身體上、精神上、情緒上或以這三種的組合形式來影響受試者。
[0010]中風所可能導致的一些肢體殘疾包括肌無力、麻木、褥瘡、肺炎、尿失禁、失用(不能進行學習到的運動)、開展日常活動困難、食慾喪失、失語、視力喪失以及疼痛。如果中風足夠嚴重，或在某個部位如腦幹部分，那麼可能導致昏迷或死亡。
[0011]由中風引起的情緒問`題可能是由對腦部的情緒中樞的直接損傷或由適應新的限制的挫折或困難所造成。中風後的情感障礙包括抑鬱、焦慮、恐慌發作、情感貧乏(不能表達情感)、躁狂症、情感淡漠以及精神病。
[0012]由中風引起的認知缺陷包括感知障礙、語言障礙、痴呆以及注意力和記憶力的問題。中風患者可能不知道他或她自己的殘疾，一種名為疾病感缺失的病狀。在一種名為偏側空間忽視症的病狀中，病人無法參加與受損半球空間相反的一側上的任何事。
[0013]所有中風患者中高達10%發展成癲癇發作，最常見的是在事件後的星期內。中風的嚴重性增加了癲癇的可能性。
[0014]中風是由於腦供血的幹擾而引起的快速發展的腦功能的喪失。這可以是由於堵塞(血栓形成、動脈栓塞)或出血(血液滲漏)引起的缺血(血流量不足)。因此，腦部受影響的區域不能起作用，這可能導致受試者不能移動軀體一側的一個或多個肢體，不能理解或表述語言，或不能看見視野的一側。中風經常造成神經元細胞死亡或可能導致死亡。
[0015]有兩種常見類型的中風:(i)缺血性中風，這是由供給腦部的血流的暫時或永久性閉塞引起的，並且佔中風病例的85%，以及(ii)出血性中風，這是由破裂的血管引起的，並且佔大多數其餘病例。缺血性中風最常見的原因是大腦中動脈(頸內動脈下遊的顱內動脈)的閉塞，這損害了大腦(例如，大腦皮層)，例如腦部的運動和感覺皮層。所述損害導致偏癱、偏側感覺缺失以及取決於所損害的大腦半球的語言或者視覺空間缺陷。
[0016]目前對缺血性中風的治療已集中於對缺血半暗帶的救治，即，保持結構完整性但是失去電功能的腦部的適度低灌注區。目前，只有四種臨床上證明的治療來改善中風後的預後:
[0017].阿司匹林，以預防進一步中風，
[0018].用組織型纖溶酶原激活劑的急性血栓溶栓，以逆轉閉塞，
[0019]?中風單元的管理，以及
[0020].偏側顱骨切除術，以降低顱內壓。
[0021]然而，所述治療僅試圖減輕持續的神經損傷，並且不恢復丟失的神經元或腦功能。
[0022]已測試了一些神經保護劑治療中風的功效，並且已經失敗，包括N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、納美芬、蘆貝魯唑、氯美噻唑、鈣通道阻滯劑(包括a-氨基-3-羥基-5-甲基異噁唑-4-丙酸拮抗劑、血清素受體激動劑(例如，瑞比諾坦)以及跨膜鉀通道調節劑)、替拉扎特、抗ICAM-1抗體、人抗白細胞抗體(Hu23F2G)、抗血小板抗體(例如，阿昔單抗)、胞磷膽鹼(胞苷-5』-二磷酸膽鹼的外源性形式)以及鹼性成纖維細胞生長因子。
[0023]從上述內容可明顯看出，在本領域中需要用於中風的治療。一種所希望的治療將修復由中風引起的至少一些神經損傷和/或恢復中風所致的至少一些腦功能喪失。
[0024]概述
[0025]本發明是基於發明人對對於治療中風的影響有用的細胞群的鑑定。如本文所例示，發明人已示出了 STRO-1+細胞和/或其子代和/或由其分泌的因子能夠恢復中風後喪失的腦功能。示例性STRO-1+細胞是獲自骨髓和/或牙髓並且可以在其用於療法中之前培養和/或儲存。發明人使用缺血性中風(例如，影響大腦)的一種已接受的動物模型來闡述細胞和/或分泌的因子治療中風的影響的功效。
[0026]例如，發明人示出了它們可以在中風後恢復大腦功能和/或治療運動障礙。發明人還示出了 STRO-1+細胞分泌因子(例如，SDF-1)，其引起神經元的軸突的生長。不受任何理論或作用模式的束縛，發明人提出這些因素可能有助於神經保護、血管生成、免疫調節和/或神經可塑性。
[0027]發明人還示出了 STRO-1+細胞能夠分化成神經元樣細胞。然而，在注射至患有中風的受試者的腦部之後，這些細胞有很少存活超過數周。這些結果表明STRO-1+細胞和/或其子代和/或由其分泌的因子有助於中風後受試者自身的神經元的存活和/或再生。
[0028]本文中呈現的這些研究結論提供了用於治療中風的一種或多種影響的方法的基礎。例如，所述方法包括對患有中風的受試者施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0029]本發明提供了在患有中風的受試者中改善大腦功能或預防大腦功能喪失的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0030]在一個實施例中，改善受試者的大腦功能改善了受試者的運動障礙。在一個實施例中，大腦功能是大腦皮層功能，如運動皮層功能和/或感覺皮層功能。
[0031]本發明額外或可選地提供了一種治療或預防患有中風的受試者的運動障礙的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0032]在本文描述的方法的一個實施例中，運動障礙是麻痺、部分麻痺、言語不清、動作不協調、肌無力、張力減退、張力亢進或不自主的異常運動。[0033]本發明額外地提供了一種使患有中風的受試者的大腦神經元再生的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO--1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0034]本發明額外地提供了一種治療、減輕或預防患有中風的受試者的腦萎縮的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO--1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。在一個實施例中，所述萎縮是在胼胝體中。
[0035]在一個實施例中，通過執行本發明的方法而再生的大腦神經元是在大腦皮層中，例如，在運動皮層和/或感覺皮層中。
[0036]一個實施例中，所述中風是缺血性中風。
[0037]本發明所涵蓋的示例性中風是由受試者的大腦中動脈閉塞引起的缺血性中風。
[0038]在一個實施例中，本發明的方法包括在中風後I小時與I個月之間，例如在I小時與2周之間，如在I小時與I周之間對所述受試者施用富含STRO--1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。例如，在中風後約72小時內施用富含STRO--1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。例如，在中風後約48小時內施用富含STRO- 細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0039]在另一個實施例中，所述方法包括在中風後24小時內對所述受試者施用富含STRO--1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。例如，在中風後約24小時時施用富含STRO--1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0040]在一個實施例中，所述方法包括施用富含STR0-1胃細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。在一個實施例中，所述子代額外地富含STRO-1s細胞。
[0041]示例性細胞和/或子代額外地表達組織非特異性鹼性磷酸酶(TNAP)和/或熱休克蛋白 90 β (HSP90 β )和 / 或 CD146。
[0042]在一個實施例中，細胞群來源於骨髓或牙髓。
[0043]在一個實施例中，富含STRO--1細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用。
[0044]在一個可選的實施例中，富含STRO--1細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是局部地施用於受試者的腦部。例如，富含STRO--1細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是局部地施用於受試者的大腦。在一個實施例中，所述群和/或子代和/或可溶性因子是額外地(或可選地)施用於受試者的紋狀體。
[0045]在一個實施例中，富含STRO--1細胞的群和/或其子代是施用於遠離中風部位並且遷移至中風部位的部位，例如，施用於缺血性梗塞或圍繞缺血性梗塞的邊界區。
[0046]本文中根據任何實施例描述的示例性方法包括施用足以改善大腦功能和/或使大腦神經元再生的劑量的所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子。
[0047]在一個實施例中，所述方法包括施用有效劑量或治療有效劑量的所述群和/或子代和/或可溶性因子。
[0048]在一個實施例中，所述方法包括施用每公斤0.1 X IO6至5X IO6之間個STRO--1細胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用每公斤0.3X IO6至2X IO6之間個STRO--1細胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用每公斤0.5X IO6至2X IO6之間個STRO--1細胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用每公斤0.5X IO6至1.5X IO6之間個STRO--1細胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用每公斤約5 X IO5個STRO-1細胞和/或其子代或每公斤約1.5X IO6個STRO-1細胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用每公斤約1.8X IO6個STRO-1細胞和/或其子代。
[0049]在一個實施例中，本文中根據任何實施例描述的方法包括施用低劑量的STRO-1細胞和/或其子代。例如，低劑量的STRO-1細胞和/或其子代包括每公斤0.1XlO5與0.5X IO6之間個STRO-1細胞和/或其子代。
[0050]在一個實施例中，所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子施用多次。例如，所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子是每四周或更多周施用一次。[0051]在一個實施例中，在施用後28天少於25%的STRO-1細胞和/或其子代保留在受試者的腦(例如，大腦)中。例如，在施用後28天少於10%的STRO-1細胞和/或其子代保留在受試者的腦(例如，大腦)中。例如，在施用後28天少於5%或3%的STRO-1細胞和/或其子代保留在受試者的腦(例如，大腦)中。
[0052]在一個實施例中，富含STRO-1細胞的群和/或子代細胞是自體的或異體的和/或可溶性因子可以從自體或異體細胞得到。在一個實施例中，本文中根據任何實施例描述的方法包括分離或富集所述群和/或子代和/或分離所述可溶性因子。
[0053]在本文中根據任何實施例描述的方法的實施例中，富含STRO-1細胞的群和/或子代細胞已在施用之前和/或在獲得所述可溶性因子之前經過培養擴增。在一個實施例中，本文描述的方法額外地包括培養所述群和/或子代。在一個實施例中，所述方法額外地包括儲存所述群和/或子代。
[0054]在一個實施例中，所述群和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子以包含所述STRO-1細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子和載體和/或賦形劑的組合物的形式來施用。在一個實施例中，本文中根據任何實施例描述的方法額外地包括將所述群和/或子代和/或可溶性因子與載體和/或賦形劑一起配製。
[0055]在一個實施例中，本文中根據任何實施例描述的方法額外地包括測試治療後受試者的大腦功能。例如，所述方法額外地包括測試受試者的運動和/或力量和/或語言和/或力量。在一個實施例中，如果受試者的大腦功能與施用所述群和/或子代和/或可溶性因子之前相比沒有顯著提高，那麼所述方法包括施用另一個劑量的所述群和/或子代和/或可溶性因子。
[0056]在一個實施例中，被治療的受試者是哺乳動物，如靈長類，例如人。
[0057]本發明還提供了富含STRO-1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子，其用於改善中風後的受試者的大腦功能或治療中風後的受試者的運動障礙或使中風後的受試者的大腦神經元再生。
[0058]本發明額外地提供了富含STRO-1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的用途，其用於製造用於改善中風後的受試者的大腦功能或治療中風後的受試者的運動障礙或使中風後的受試者的大腦神經元再生的藥物。
[0059]本發明還提供了一種包含富含STRO-1細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的試劑盒，其與本文中根據任何實施例描述的方法的使用說明書一同包裝。
[0060]例如，本發明提供了一種包含含有所述群和/或子代和/或可溶性因子的組合物的試劑盒，其與指示在本文中根據任何實施例描述的方法中使用組合物的產品信息一同包裝。
[0061]本發明還提供了一種用於分離或培養STRO-1+細胞和/或其子代的試劑盒，其與本文中根據任何實施例描述的方法的使用說明書一同包裝。
[0062]本發明還提供了一種方法，包括用在本文中根據任何實施例描述的方法的使用說明書提供富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
[0063]本發明還提供了一種方法，包括分離或提供來分離或儲存或提供來儲存富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子用於稍後在本文中根據任何實施例描述的方法中使用。
[0064]本文描述的方法應在作了必要修改的情況下適用於降低進一步中風的風險的方法。 [0065]附圖簡述
[0066]圖l.TNAP(STR0_3)和間充質前體細胞標誌物STR0-1胃在成人骨髓單核細胞(BMMNC)中的共表達。通過孵育MACS選擇的BMMNC並用與FITC偶合的山羊抗鼠類IgM抗體間接標記的STR0-1 (X軸)和用與PE偶合的山羊抗鼠類IgG間接標記的STR0-3mAb(鼠類IgGl) (y軸)進行雙色免疫螢光和流式細胞術。點陣直方圖表示以列表模式數據形式收集的5X IO4個事件。垂直線和水平線設定為小於用在相同條件下處理的同種型匹配對照抗體1B5 (IgG)和1A6.12 (IgM)獲得的平均螢光的1.0%的反應性水平。結果表明STRO-1s細胞的較小群體共表達TNAP (右上象限)，而其餘STRO-1+細胞未能與STR0-3mAb反應。
[0067]圖2.培養的和擴增的STR0-1 *MPC的STRO-l** STR0-1 ?子代的基因表達譜。通過胰蛋白酶/EDTA處理製備離體擴增的骨髓MPC的單細胞懸浮液。將細胞用STR0-1抗體染色，所述STR0-1抗體隨後通過與山羊抗鼠類IgM-異硫氰酸螢光素一起孵育加以顯現。螢光活化細胞分選(A)後，由經過純化的STR0-1 ?或STRO-1s表達細胞的群製備總細胞RNA。使用RNAzolB提取方法和標準程序，從各子群分離總RNA並且用作cDNA合成的模板。使用如先前所描述的標準方案(Gronthos等J Cell Sc1.77(5:1827-1835，2003)通過PCR擴增評定各種轉錄物的表達。此研究中所用的引物組在表2中示出。擴增後，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對各反應混合物進行分析，並且通過溴化乙錠染色進行觀測(B)。使用ImageQant軟體參考持家基因GAPDH的表達來評定各細胞標誌物的相對基因表達(C)。
[0068]圖3.培養的和擴增的STRO-1+MPC的STR0-1 *子代表達高水平的SDF-1，STR0-1暗子代則不能。(A)使用FACS根據區域STR0-1亮和STR0-1 ?7 *將通過MACS分離的StRO-1+BMMNC製備物劃分為不同的STR0-1子集。從各STR0-1子群體製備總RNA並且用於構建STR0-1胃消減雜交文庫(B-C)。複製已經用由經過STR0-1胃消減cDNA轉化的細菌克隆擴增的代表性PCR產物點印的硝化纖維素過濾器。所述過濾器接著用[32P]三磷酸脫氧胞苷(dCTP)標記的STR0-1 * (B)抑或STR0-1 ?/s (C)消減cDNA探測。箭頭指示含有對應於人SDF-1的cDNA片段的I個克隆的差異表達。(D)逆轉錄酶(RT)-PCR分析顯示由在培養前通過MACS/FACS新鮮分離的BMMNC STR0-1群體製備的總RNA中SDF-1和甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH)轉錄物的相對表達。bp表示鹼基對。
[0069]圖4.人DPSC分化成神經元樣細胞。(A)顯微照片的複本示出了人包皮成纖維細胞(HFF)在體外對神經元誘導培養基無反應。(B)顯微照片的複本示出了 hDPSC在體外在神經元誘導培養基中分化成神經元表型。(C)圖形表示示出了響應於持續30ms、跨度範圍為-44mV至36mV、步幅10mV，在分化的DPSC中記錄的Na+電流跡線的代表性實例。(D)圖形表示示出了響應於電壓跨度(voltage step)在分化的(D)和未分化的(N.D.)DPSC中獲得的Na+電流峰值的平均1-V繪圖。
[0070]圖5.—系列表示描繪了用於治療中風模型的過程。圖A示出使用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色的代表性大鼠腦部冠狀切片來使大腦中動脈閉塞(MCAo)後I天的梗塞(白色)組織可視化。圖B示出了使用抗人線粒體抗原抗體和蘇木精染色的代表性大鼠腦部冠狀切片。圖A和B中的黑點表示位於相對於前囟的前側-後側-0.40mm,內側-外側-4.00mm，距離硬腦膜背側-腹側_5.50mm的第一紋狀體注射部位，和位於距離硬腦膜背偵卜腹側-1.75mm的第二皮層注射部位。圖C示出了治療方案的圖解表示，其中動物在MCAo前訓練3天(表示為第O天)，並且第三段用作術前基線(第-1天)。在MCAo後24小時將動物隨機分配以接受人DPSC或單獨的培養基。在MCAo後第I天、第7天、第14天、第21天、第28天由不知道治療分組的研究者來執行行為評估。在實驗期間，所有動物都接受每天皮下注射10mg/kg的環孢菌素A。將動物處死，並且在神經行為學研究結束時對它們的腦部進行免疫組織化學處理。比例尺=2mm(A，B)。縮寫:Cx，大腦皮層；DPSC，牙髓幹細胞；MCAo，大腦中動脈閉塞；Str，紋狀體。
[0071]圖6.—系列圖形表示示出了人DPSC治療對MCAo後神經行為結果的效果。在MCAo之後，所有動物在所有的行為測試(第I天或第7天對第-1天)中都表現出功能缺陷。圖A示出了在移植後4周時，與媒介物治療的動物相比DPSC治療的動物顯示了總神經評分的明顯改善(P < 0.018組X天相互作用，重複測量的方差分析[AN0VA];在第21天和第28天在治療組之間分別為P < 0.05和P 0.05,重複測量的AN0VA)。由於盤旋行為，中風動物在MCAo後I天時不能完成平衡木行走任務。已將數據標繪為箱線圖來使值的分布可視化。箱中的中央星號表示中值，並且箱表示值的中間50%(即，它的範圍為第25百分位至第75百分位)。觸線(whisker)示出了數據的範圍，極端觀測值由外圍圓圈呈現。縮寫:DPSC，牙髓幹細胞；MCAo，大腦中動脈閉塞。
[0072]圖7.攝影表示的複本示出了在缺血後的腦中存活的DPSC的分布。代表性大鼠腦部冠狀切片示出了移植後4周時移植的DPSC(單個細胞指示為黑點)的存活和遷移模式。針對人線粒體抗原染色切片以檢測來自大鼠腦組織中的人細胞。注意到，DPSC的靶標遷移朝向中風損傷並且最終圍繞閉塞積累。比例尺=2mm。縮寫:B，前囪；CC，胼胝體；Cx，大腦皮層；DG，背側海馬齒狀回；LV，側腦室；Str，紋狀體。
[0073]圖8.攝影表示的複本示出了在中風後28天時植入的人DPSC的形態。在大腦中動脈閉塞後4周的齧齒動物腦中的人DPSC的高倍放大圖(人線粒體抗原陽性細胞染深灰色，圖的右手邊)描繪了在緊鄰梗塞核心內的積累(圖A)和明顯的沿CC的遷移(圖B)。注意到，DPSC在注射和中風部位對側的大腦半球內的稀疏分布。圓點指示單個的人DPSC。圖C示出了一些獲自DPSC的細胞似乎植入大腦血管壁內，形態外觀與內皮細胞(箭狀物)、周皮細胞或平滑肌細胞(箭頭)一致。圖D示出了獲自DPSC的細胞的形態提示星形膠質細胞(箭狀物)和神經元(箭頭)。比例尺=2mm(圖A、圖B)和25 μ m(圖C、圖D以及圖
A、圖B中的=40倍放大插圖)。縮寫:B，前囪；CC，胼胝體。
[0074]圖9.一系列表示示出了 DPSC治療對健側CC萎縮的效果。圖A示出了在前囪水平處的代表性大鼠腦切片，其中指示了在同側和對側兩個半球中用於測量在腦中線處(LI)和在側腦室側緣處(L2)的CC厚度的兩個部位。圖B示出了在移植後4周時，與媒介物治療的動物相比，DPSC治療的動物的健側半球中有胼胝體萎縮減少的趨勢。L2(同側)針對LI(中線)CC測量的正常化不能達到統計顯著性(P>0.05)。在治療組之間的對側CC厚度測量值不存在差異。數據顯示為平均值土 SEM。比例尺=100 μ m。縮寫:CC，胼胝體；Contra，對側；Cx，大腦皮層；DPSC，牙髓幹細胞；Ipsi，同側；LV，側腦室。
[0075]圖10.圖形表示示出了使用利用山羊抗鼠類IgM或IgG綴合的FITC 二次抗體檢測時相對於同種型(IgM、IgG2a以及IgGl)陰性對照(虛線)具有間充質幹細胞標誌物STRO-USTR0-4以及⑶146 (實線)陽性細胞表面表達的培養擴增骨髓來源的食蟹獼猴MPC的單細胞懸浮液所產生的代表性流式細胞術直方圖。代表性直方圖還示出了食蟹獼猴MPC缺乏單核細胞/巨噬細胞(CD14)、造血幹/祖細胞(CD34)以及成熟白細胞(CD45)的細胞表面標誌物表達。與同種型對照相比大於1%的突光水平表不為陽性。
[0076]序列表注釋
[0077]SEQ ID NO:1—用於擴增編碼GAPDH的核酸的寡核苷酸。
[0078]SEQ ID NO:2—用於擴增編碼GAPDH的核酸的寡核苷酸
[0079]SEQ ID NO:3—用於擴增編碼SDF-1的核酸的寡核苷酸
[0080]SEQ ID NO:4—用於擴增編碼SDF-1的核酸的寡核苷酸
[0081]SEQ ID NO:5—用於擴增編碼IL-1 β的核酸的寡核苷酸
[0082]SEQ ID Ν0:6—用於擴增編碼IL-1 β的核酸的寡核苷酸
[0083]SEQ ID NO:7—用於擴增編碼FLT-1的核酸的寡核苷酸
[0084]SEQ ID Ν0:8—用於擴增編碼FLT-1的核酸的寡核苷酸
[0085]SEQ ID NO:9—用於擴增編碼TNF_a的核酸的寡核苷酸
[0086]SEQ ID NO: 10—用於擴增編碼TNF_a的核酸的寡核苷酸
[0087]SEQ ID NO: 11—用於擴增編碼KDR的核酸的寡核苷酸
[0088]SEQ ID NO: 12—用於擴增編碼KDR的核酸的寡核苷酸
[0089]SEQ ID NO: 13—用於擴增編碼RANKL的核酸的寡核苷酸
[0090]SEQ ID NO: 14—用於擴增編碼RANKL的核酸的寡核苷酸
[0091]SEQ ID NO: 15—用於擴增編碼瘦蛋白的核酸的寡核苷酸
[0092]SEQ ID NO: 16—用於擴增編碼瘦蛋白的核酸的寡核苷酸
[0093]SEQ ID NO: 17—用於擴增編碼CBFA-1的核酸的寡核苷酸
[0094]SEQ ID NO: 18—用於擴增編碼CBFA-1的核酸的寡核苷酸
[0095]SEQ ID NO: 19—用於擴增編碼PPAR Y 2的核酸的寡核苷酸
[0096]SEQ ID NO: 20—用於擴增編碼PPAR Y 2的核酸的寡核苷酸
[0097]SEQ ID NO:21—用於擴增編碼OCN的核酸的寡核苷酸[0098]SEQ ID NO:22—用於擴增編碼OCN的核酸的寡核苷酸
[0099]SEQ ID NO: 23—用於擴增編碼MyoD的核酸的寡核苷酸
[0100]SEQ ID NO: 24—用於擴增編碼MyoD的核酸的寡核苷酸
[0101]SEQ ID NO:25—用於擴增編碼SMMHC的核酸的寡核苷酸
[0102]SEQ ID NO:26—用於擴增編碼SMMHC的核酸的寡核苷酸
[0103]SEQ ID NO:27—用於擴增編碼GFAP的核酸的寡核苷酸
[0104]SEQ ID NO:28—用於擴增編碼GFAP的核酸的寡核苷酸
[0105]SEQ ID NO:29—用於擴增編碼巢蛋白的核酸的寡核苷酸
[0106]SEQ ID NO:30—用於擴增編碼巢蛋白的核酸的寡核苷酸
[0107]SEQ ID N0:31—用於擴增編碼S0X9的核酸的寡核苷酸
[0108]SEQ ID N0:32—用於擴增編碼S0X9的核酸的寡核苷酸
[0109]SEQ ID NO: 33—用於擴增編碼X型膠原的核酸的寡核苷酸
[0110]SEQ ID NO: 34—用於擴增編碼X型膠原的核酸的寡核苷酸
[0111]SEQ ID N0:35—用於擴增編碼聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸
`[0112]SEQ ID N0:36—用於擴增編碼聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸
[0113]詳細描述
[0114]通用技術和選定的定義
[0115]在本說明書中，除非另有特別說明或上下文另有要求，否則提及單個步驟、物質的組合物、步驟的組或物質組合物的組應視為包括那些步驟、物質組合物、步驟的組或物質組合物的組中的一個或多個(即，一個或多個)。
[0116]除非特別聲明，否則本發明的每個實施例在作必要的修改的情況下適用於各個和每個其它實施例。
[0117]本領域的技術人員應了解，本發明容許具體描述的內容以外的變化和修改。應理解，本發明包括所有這些變化和修改。本發明還包括在本說明書中個別地或共同地提及或指示的所有的步驟、特徵、組合物和化合物，以及所述步驟或特徵的任何和所有組合或其任何兩者或更多者。
[0118]本發明的範圍不受本文描述的具體實施例限制，所述實施例意圖只是用於示例的目的。功能上等同的產物、組合物和方法清楚地在本發明的範圍內。
[0119]除非另有指示，否則在不進行過度實驗的情況下使用分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術、溶液相肽合成、固相肽合成以及免疫學的常規技術來執行本發明。所述程序描述於以下文獻中，例如Sambrook, Fritsch和Maniatis, MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 第二版(1989),卷 1、II 以及 III 全部；DNA Cloning:A Practical Approach,卷 I 和II (D.N.Glover 編著，1985)，IRL Press, Oxford,全文；Oligonucleotide Synthesis: APractical Approach (M.J.Gait 編著,1984) IRL Press, Oxford,全文，以及尤其是其中Gait的論文，第1-22頁；Atkinson等，第35-81頁；Sproat等，第83-115頁；以及 Wu 等，第 135-151 頁；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach (B.D.Hames 和 S.J.Higgins 編著，1985) IRL Press, Oxford,全文；Immobilized Cellsand Enzymes: A Practical Approach (1986) IRLPress, Oxford, 全文；Perbal, B.，APractical Guide to Molecular Cloning(1984) ；Methods In Enzymology(S.Colowick和 Ν.Kaplan 編著，Academic Press, Inc.)，全系列；J.F.Ramalho Ortigaoj "TheChemistry of Peptide Synthesis"見:Knowledge database of Access to VirtualLaboratory website (Interactiva, Germany) ；SakakibarajD.，TeichmanjJ.，Lien, E.Land Fenichelj R.L (1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342 ；Merrifield, R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154 ;Barany，G.和 Merrifieldj R.B.(1979)見 ThePeptides (Gross, E.和 Meienhofer，J.編著)，卷.2，第 1-284 頁，Academic Press, NewYorkl2.Wiinschj E.編著(1974) Synthese von Peptiden in Houben-ffeyls Metoden derOrganischen Chemie (Miller, E.編著),卷 15，第 4 版，第 I 和 2 部分,Thieme, Stuttgart ；Bodanszky1M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag, Heidelberg ；Bodanszky, M.和 Bodanszky, A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg ；Bodanszky, M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474 ;Handbook of Experimental Immunology,卷 1-1V(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 編著，1986，Blackwell Scientific Publications);以及 Animal Cell Culture:PracticalApproach,第 3 版(John R.ff.Masters 編著，2000)，ISBN0199637970,全文。
[0120]在本說明書中，除非全文另有要求，否則詞語「包括(comprise)」，或變化形式如「包括(comprises) 」或「包括(comprising) 」,將被理解為意指包括所述步驟或要素或整數或者步驟或要素或整體的組，但是不排除任何其它的步驟或要素或整數或者要素或整數的組。
[0121]如本文中所用的，術語「來源於」應意味指示指定的整數可從特定的來源來獲得，即使不一定直接來自該來源。在由STRO-T細胞和/或其子代細胞得到的可溶性因子的上下文中，這個術語應意味一種或多種因子，例如蛋白質、肽、碳水化合物等等是在體外培養STRO-1+細胞和/或其子代細胞期間產生。
[0122]本文中所用的術語「中風」應意味著腦功能的喪失，通常快速進展，這是由於對通向腦部或腦幹的血流的幹擾。這種幹擾可以是由例如血栓形成或栓塞引起的缺血(缺少血)，或可以是由於出血。在一個實施例中，腦功能喪失伴隨著神經元細胞死亡。在一個實施例中，中風是由來自(至)大腦或其一個區域的血液的幹擾或損失所造成。在一個實施例中，中風是持續超過24小時或在24小時內因死亡而中斷的腦血管原因的神經功能缺失(如世界衛生組織所定義)。症狀持續超過24小時將中風與短暫性腦缺血發作(TIA)區分開，在TIA中症狀持續少於24小時。中風的症狀包括偏癱(身體一側麻痺)；輕偏癱(身體一側虛弱)；面部肌無力；麻木；感覺減退；嗅覺、味覺、聽覺或視覺改變；嗅覺、味覺、聽覺或視覺喪失；眼瞼下垂(上瞼下垂)；可檢測的眼部肌無力；咽反射減少；吞咽能力降低；瞳孔對光反應性下降；面部感覺減退；平衡下降；眼球震顫；呼吸頻率改變；心率改變；胸鎖乳突肌無力伴隨頭部偏向一側的能力下降或無能；舌頭無力；失語症(不能說話或理解語言)；失用症(隨意運動改變)；視野缺損；記憶缺失；半側忽視或半側空間忽視(對損害對側的視野空間的注意力的缺失)；思維瓦解；混亂；性慾過度姿勢的發展；疾病失認症(持續否認缺失的存在)；行走`困難；運動協調改變；眩暈；平衡失調；意識喪失；頭痛；和/或嘔吐。
[0123]技術人員將知道「大腦」包括大腦皮層(或大腦半球皮層)、基底神經節(或基底核）以及邊緣系統。
[0124]術語「大腦功能」包括：
[0125]?推理、計劃，言語、動作、情緒以及解決問題的部分（與額葉相關）；
[0126]?刺激的移動、定位、識別、感知（與頂葉相關）；
[0127]?視覺處理（與枕葉相關);以及
[0128]?感知和識別聽覺刺激、記憶以及語言（與顳葉相關)。
[0129]本文所用的術語「運動障礙」應意指與中風之前相比，受試者運動能力的任何改 變。示例性運動障礙包括麻痺、部分麻痺、言語不清、動作不協調、肌無力、張力減退、張力亢 進或不自主的異常運動。
[0130]本文所用的使神經元「再生」應意指受試者的內源性神經元被誘導生長（例如，生 長軸突）和/或分裂和/或內源性神經幹細胞被誘導生長和/或分裂和/或分化來產生新 的神經元。這與施用的分化產生神經元的細胞不同。這個術語不意指使神經元再生的方法 不能額外地包括施用的細胞分化成神經元或其它細胞類型。
[0131]本文所用的術語「有效量」應意指足以誘導患有中風的受試者的大腦神經元再生 和/或分化成受試者的神經元的富含STR0-1+細胞的群和/或其子代細胞和/或由其得到 的可溶性因子的量。有效量不一定要足以提供其自身的治療效益，例如，多次施用有效量的 群和/或細胞和/或可溶性因子可以提供治療效益。
[0132]本文所用的術語「治療有效量」應意指足以在患有中風的受試者中改善大腦功能 和/或治療運動障礙和/或使大腦神經元再生的富含STR0-1+細胞的群和/或其子代細胞 和/或由其得到的可溶性因子的量。
[0133]本文所用的術語「低劑量」應理解為意指STR0-1+細胞和/或其子代的量少於 1 X 106個，但仍然足以是如本文定義的「有效量」和/或如本文定義的「治療有效量」。例 如，低劑量包括0. 5X106個或更少的細胞，或0. 4X106個或更少的細胞或0. 3X106個或更 少的細胞或0. 1X106個或更少的細胞。
[0134]本文所用的術語「治療（treat) 」或「治療（treatment) 」或「治療（treating) 」應 理解為意指施用一定量的可溶性因子和/或細胞並且降低運動障礙的嚴重性。
[0135]本文所用的術語「預防（prevent)」或「預防（preventing)」或「預防 (prevention) 」應理解為意指施用一定量的可溶性因子和/或細胞並且停止或阻止或延遲 中風後運動障礙的發展或進展和/或大腦功能的喪失。因此，本發明的方法應意味著在作 了必要修改的情況下適用於預防患有中風的受試者的運動障礙或大腦功能喪失的方法。
[0136]本文所用的術語「可溶性因子」應理解為指可溶於水的由STR0-1+細胞和/或其 子代產生的任何分子，例如蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。所述可 溶性因子可以在細胞內和/或由細胞分泌。所述可溶性因子可以是複雜混合物（例如上清 液）和/或其組分和/或可以是純化的因子。在本發明的一個實施例中，可溶性因子是上 清液或含於上清液內。因此，本文涉及施用一種或多種可溶性因子的任何實施例應理解為 在作了必要的修改的情況下適用於施用上清液。
[0137]本文所用的術語「上清液」指的是在合適的培養基（如，液體培養基)中體外培養 STR0-1+細胞和/或其子代後產生的非細胞物質。通常，上清液由在適宜的條件和時間下在 培養基中培養細胞，隨後通過如離心等過程去除細胞物質後所產生。在施用之前，上清液可能會或可能不會經受進一步的純化步驟。在一個實施例中，上清液包含少於IO5個，更多，例如，少於IO4個，如少於IO3個並且例如，無活細胞。
[0138]本文所用的術語「正常或健康個體」應意指不患有中風的受試者。
[0139]在本說明書中，術語「中風的影響」將被理解為包括並且為以下一項或多項提供文字支持:改善大腦功能、治療或預防運動障礙和/或使大腦神經元再生。
[0140]STRO-r細胞或子代細胞，和由其得到的上清液或者一種或多種可溶性因子
[0141]STRO-i細胞為在骨髓、血液、牙髓細胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結、胸腺、骨、韌帶、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中發現的；並且能夠分化成生殖系如中胚層和/或內胚層和/或外胚層的細胞。STRO-i細胞的示例性來源是獲自骨髓和/或牙髓。
[0142]在一個實施例中，STRO-i細胞是多能細胞，其能夠分化成大量細胞類型，包括但不限於脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織和纖維結締組織。這些細胞所進入的特定譜系決定和分化路逕取決於來自機械影響和/或內源性生物活性因子(如生長因子、細胞因子)和/或由宿主組織建立的局部微環境條件的各種影響。STRO-i多能細胞因此為非造血祖細胞，其分裂產生子細胞，所述子細胞為幹細胞或適時不可逆分化產生表型細胞的前體細胞。
[0143]在一個實施例中，STRO-i細胞能夠分化成神經元或神經元樣細胞。
[0144]在一個實施例中，STRO-i細胞分泌一種或多種誘導或促進神經元軸突生長的因子。
[0145]在一個實施例中，STRO-i細胞是從由受試者(例如欲治療的受試者或相關受試者或不相關受試者(無論是相同物種抑或不同物種))獲得的樣本富集而來。術語「富含」或其變形在本文中用於描述一種細胞群體，其中當與細胞的未處理群體(例如處於天然環境中的細胞)相比較時，一種特定細胞類型的比例或者多種特定細胞類型的比例增加。在一個實施例中，富含STRO-i細胞的群包含至少約0.1%或0.5%或1%或2%或5%或10%或15%或20%或25%或30%或50%或75%的STR0_l+_細胞。在這方面，術語「富含STRO-i細胞的細胞群」將被理解為為術語「包含X%STR01+細胞的細胞群」提供明確的支持，其中X%是本文列舉的百分比。在某些實施例中，STRO-i細胞可以形成無性系的集落，例如，CFU-F(成纖維細胞)或其亞群(例如50%或60%或70%或70%或90%或95%)可以具有這種活性。
[0146]在一個實施例中，細胞群是富含包含處於可選擇的形式的STRO-r細胞的細胞制齊?。在這方面，術語「可選擇的形式」將被理解為意指細胞表達允許選擇STRO-r細胞的標誌物(例如，一種細胞表面標誌物)。標誌物可以是STR0-1，但不一定是。例如，如本文描述的和/或例證的，表達STR0-2和/或STR0-3 (TNAP)和/或STR0-4和/或VCAM-1和/或⑶146和/或3G5的細胞(例如MPC)也表達STR0-1 (並且可以是STR0-1胃)。因此，表明細胞是STRO-i並不意指細胞由STR0-1表達來選擇。在一個實施例中，細胞是基於至少表達STR0-3來選擇，例如，它們是STR0-3+ (TNAP+)。
[0147]提及選擇細胞或其群不需要從特定的組織來源進行選擇。如本文描述的，STRO-i細胞可以是從種類繁多的來源中進行選擇或分離或富集的。也就是說，在某些實施例中，這些術語為從任何包含STRO-i細胞(例如，MPC)的組織或血管化組織或包含周細胞(例如STRO-1+周細胞)的組織或本文描述的組織中的任何一種或多種中進行選擇提供支持。[0148]在一個實施例中，細胞表達一種或多種個別地或全體選自由以下組成的組的標誌物:TNAP+、VCAM-r、THY-r、STR0-2+、STR0-4+(HSP-90 β )、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任何組合。
[0149]在一個實施例中，細胞表達或細胞群富含表達STRO-r (或STR0-1胃)和⑶146+的間充質前體細胞。
[0150]「個別地」指本發明獨立地涵蓋所述標誌物或標誌物組，以及雖然個別標誌物或標誌物組可能未獨立地在本文中列出，但隨附權利要求書仍可彼此獨立地和分開地定義所述標誌物或標誌物組。
[0151]「全體」指本發明涵蓋任何數量的所述標誌物或肽組或其組合，以及雖然所述數量的標誌物或標誌物組或其組合可能未在本文中具體列出，但隨附權利要求書仍可將所述組合或子組合與標誌物或標誌物組的任何其它組合獨立地和分開地定義。
[0152]在一個實施例中，STRO-r細胞是STR0-1* (與STRO-1blri同義).在一個實施例中，相對於STR0-1 @或STR0-1 細胞，Stro-1bri細胞優先富集。
[0153]例如，STR0-1*細胞另外是 TNAP+、VCAM-r、THY-r、STR0-2+、STR0-4+(HSP-90 β )和/或CD146+中的一種或多種。例如，細胞是為一種或多種的前述標誌物而選擇和/或顯示表達一種或多種前述標誌物。在這方面，顯示表達標誌物的細胞不需要被特別地測試，而是可以測試預先富集或分離的細胞並且隨後使用，可以合理地假設分離的或富集的細胞也表達同樣的標誌物。
[0154]在一個實施例中，間充質前體細胞是W02004/85630中所定義的血管周圍間充質前體細胞。例如，間充質前體細胞表達血管周圍細胞的標誌物，例如，細胞是STRO-r或STR0-1胃和/或3G5+。在一個實施例中，細胞是或以前是或是從血管化組織或器官或其部分中分離的子代細胞。
[0155]對於指定標誌物稱為「陽性」的細胞，其可能根據標誌物存在於細胞表面上的程度而表達低(1或暗)或高(亮、亮)水平的所述標誌物，其中所述術語涉及細胞分選過程中所用的螢光或其它標誌物的強度。1 (或暗或深)和亮的區別應放在所分選特定細胞群體上所用的標誌物的情形中加以理解。對於指定標誌物稱為「陰性」的細胞不一定完全不存在於所述細胞。所述術語指細胞表達所述標誌物的水平相對極低，並且當在可檢測標記時產生極低信號或者在背景水平以上不可檢測，例如使用同種型對照抗體檢測到的水平。
[0156]當在本文中使用時，術語「亮」是指細胞表面上的標誌物在可檢測標記時產生相對較高的信號。雖然不希望受理論限制，但提出「亮」細胞所表達的靶標誌物蛋白(例如由STR0-1識別的抗原)比樣本中的其它細胞多。例如，當用綴合FITC的STR0-1抗體標記時，如通過螢光活化細胞分選(FACS)分析所測定的STRO-1s細胞產生比非亮細胞((STRO-1i*7?)高的螢光信號。例如，「亮」細胞構成起始樣本中所含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1%。在其它實施例中，「亮」細胞構成起始樣本中所含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%或至少約2%。在一個實施例中，STR0-1 *細胞的STR0-1表面表達相對於「背景」(即STRO-r細胞)具有2個對數量級以上的表達。相比之下，STRO-1b^P /或STR0-1 細胞的STR0-1表面表達與「背景」相比具有小於2個對數量級的表達，通常與「背景」相比約I個對數以下。
[0157]本文所用的術語「TNAP」意圖涵蓋組織非特異性鹼性磷酸酶的所有亞型。例如，所述術語涵蓋肝亞型(LAP)、骨亞型(BAP)和腎亞型(KAP)。在一個實施例中，TNAP是BAP。在一個實施例中，如本文所用的TNAP是指可以結合由2005年12月19日根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規定以保藏編號PTA-7282保藏於ATCC的雜交瘤細胞系產生的STRO-3抗體的分子。
[0158]此外，在本發明的一個實施例中，STRO-1~細胞能夠產生克隆CFU-F。
[0159]在一個實施例中，大比例的STRO-1~多能細胞優選能夠分化成至少兩種不同生殖系。多能細胞可以發展成的譜系的非限制性實例包括骨前體細胞；肝細胞祖細胞，其具有膽道上皮細胞和肝細胞的多潛能；神經限制細胞，其可以產生會發展成少突膠質細胞和星形膠質細胞的神經膠質細胞前體；神經元前體，其會發展出神經元；心肌和心肌細胞、葡萄糖反應性胰島素分泌胰腺β細胞系的前體。其它譜系包括但不限於成牙質細胞、牙質產生細胞和軟骨細胞，以及以下的前體細胞:視網膜色素上皮細胞、成纖維細胞、皮膚細胞(諸如角化細胞)、樹突狀細胞、毛囊細胞、輸尿管上皮細胞、平滑肌和骨骼肌細胞、睪丸祖細胞、血管內皮細胞、肌腱、韌帶、軟骨、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓基質、心肌、平滑肌、骨骼肌、周細胞、血管、上皮、神經膠質、神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
[0160]在另一個實施例中，STRO-1+細胞在培養時不能產生造血細胞。
[0161]在一個實施例中，細胞是取自欲治療的受試者，使用標準技術在體外培養並且用於獲得上清液或可溶性因子或擴增細胞以自體或同種異體組合物形式施用至受試者。在可選實施例中，使用一種或多種已建立的人細胞系的細胞。在另一適用實施例中，使用非人動物的細胞(或者如果患者不是人，而來自於另一物種)。
[0162]本發明還涵蓋使用由自體外培養物產生的STRO-1~細胞和/或其子代細胞(後者也稱為擴增細胞)獲得或得到的上清液或可溶性因子。本發明的擴增細胞根據培養條件(包括培養基中刺激因子的數量和/或類型)、傳代次數等可以具有多種表型。在某些實施例中，子代細胞是在從親本群體傳代約2次、約3次、約4次、約5次、約6次、約7次、約8次、約9次或約10次後獲得。然而，子代細胞可以在從親本群體傳代任何次後獲得。
[0163]子代細胞可以通過在任何適合培養基中培養而獲得。如本文在提及細胞培養時使用的術語「培養基」包括細胞周圍環境的組分。培養基可以是固體、液體、氣態或相和材料的混合物。培養基包括液體生長培養基以及不供養細胞生長的液體培養基。培養基也包括膠狀培養基，諸如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原蛋白基質。示例性氣態培養基包括在皮氏培養皿(petri dish)或其它固體或半固體支持物上生長的細胞所暴露的氣相。術語「培養基」也指意欲用於細胞培養中的材料，即使其尚未與細胞接觸。換句話說，製備用於細菌培養的富營養液體是培養基。當與水或其它液體混合時變得適於細胞培養的粉末混合物可稱為「粉狀培養基」。
[0164]在一個實施例中，適用於本發明方法的子代細胞是通過使用經過STR0-3抗體標記的磁性珠粒從骨髓分離或富集TNAP+STRO-1~細胞，並接著培養擴增所分離的細胞來獲得(關於適合培養條件的實例，請參見Gronthos等Blood85:929-940，1995)。
[0165]在一個實施例中，所述擴增細胞(子代)(例如至少在5次傳代後)可以是TNAP_、CC9+、I+類 HLA、ir 類 HLA、CD14'CD19'CD3'CDlla-c'CD3r、CD86'CD34-和 / 或 CD80' 然而，在與本文所述不同的培養條件下，不同標誌物的表達有可能會變化。此外，雖然具有這些表型的細胞可在擴增細胞群體中佔優勢，但這並不指較小比例的細胞不具有此表型(例如，小百分比的擴增細胞可以是CC9—)。在一個實施例中，擴增細胞仍具有分化成不同細胞類型的能力。
[0166]在一個實施例中，用於獲得上清液或可溶性因子或細胞本身的擴增細胞群體包含其中至少25%(如至少50%的細胞)的細胞是CC9+。
[0167]在另一實施例中，用於獲得上清液或可溶性因子或細胞本身的擴增細胞群體包含其中至少40%(如至少45%的細胞)的細胞是STR0-1+。
[0168]在另一實施例中，擴增細胞可表達一種或多種全體或個別地選自由以下組成的組的標誌物:LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整聯蛋白 β 6-19、血栓調節蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦蛋白-R(STR0_2=瘦蛋白-R)、RANKL, STRO-4 (HSP-90P)、STR0-1胃和CD146或這些標誌物的任何組合。
[0169]在一個實施例中，子代細胞是如W02006/032092中所定義和/或所述的多能擴增STRO-1+多能細胞子代(MEMP)。製備可用於得到子代的STRO-1'多能細胞的富集群體的方法描述於W001/04268和W02004/085630中。在體外情形中，STRO-1'多能細胞極少以絕對純製備物形式存在，而是一般與作為組織特異性定向細胞(TSCC)的其它細胞一起存在。WOO1/04268提出以約0.1%至90%的純度水平從骨髓採集所述細胞。包含可得到子代的MPC的群體可直接從組織來源採集，或者其可為已在離體擴增的群體。
[0170]例如，子代可獲自大致上純化的STRO-1'多能細胞的已採集且未擴增的群體，其構成其所存在的群體總細胞的至少約0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或95%。此水平可以通過例如選擇對至少一種個別地或全體選自由TNAP、STRO-4 (HSP-90P)、STR0-1氣3G5+、VCAM-1、THY-1、CD 146和STR0-2組成的組的標誌物呈陽性的細胞來實現。
[0171]MEMPS與新鮮採集的STRO-1'多能細胞的區別之處可在於其對於標誌物STR0-1胃呈陽性且對於標誌物鹼性磷酸酶(ALP)呈陰性。相比之下，新鮮分離的STRO-1'多能細胞對於STR0-1胃和ALP兩者都呈陽性。在本發明的一個實施例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所施用細胞具有表型STR0-1氣ALP'在另一實施例中，MEMPS對於標誌物Ki67、CD44和/或⑶49c/⑶29、VLA-3、α 3 β I中的一種或多種呈陽性。在另一實施例中，MEMP不顯示TERT活性和/或對於標誌物⑶18呈陰性。
[0172]STRO-1'細胞起始群體可源自W001/04268或W02004/085630中所述的任一種或多種組織類型，即骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚，或許更廣泛來說來自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、胰、骨、韌帶、骨髓、肌腱和骨骼肌。
[0173]應理解，在進行本發明中所述的方法時，帶有任何指定細胞表面標誌物的細胞的分離可以通過多種不同方法來實現，然而，示例性方法依賴於結合劑(例如抗體或其抗原結合片段)與所關註標志物的結合，隨後分離顯示結合(為高水平結合或低水平結合)或不結合的那些細胞。最適宜結合劑為抗體或基於抗體的分子，例如單克隆抗體或基於單克隆抗體的分子(例如包含其抗原結合片段的蛋白質)，因為後面所說的這些結合劑具有特異性。抗體在兩個步驟中都可使用，然而也可以使用其它試劑，因此這些標誌物的配體也可以用於富集帶有所述標誌物或缺乏所述標誌物的細胞。
[0174]抗體或配體可連接至固體支持物以允許粗分離。在一個實施例中，分離技術最大程度地保持欲收集的部分的活力。具有不同功效的各種技術可用於獲得相對較粗的分離。所用特定技術將取決於分離效率、相關細胞毒性、執行的容易性和速度，以及複雜設備和/或技術技能的必要性。分離程序可包括但不限於使用塗有抗體的磁性珠粒的磁性分離、親和色譜和利用連接至固體基質的抗體的「淘選」。提供精確分離的技術包括但不限於FACS。執行FACS的方法對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。
[0175]針對本文所述的各標誌物的抗體可商購獲得(例如抗STR0-1的單克隆抗體可從R&D Systems, USA商購獲得)、從ATCC或其它保藏組織獲得和/或可使用業內公認的技術產生。
[0176]在一個實施例中，分離STRO-r細胞的方法例如包括第一步驟，其為利用例如識別STR0-1的高水平表達的磁性活化細胞分選(MACS)的固相分選步驟。接著必要時可進行第二分選步驟以得到更高水平的前體細胞表達，如專利說明書W001/14268中所述。此第二分選步驟可能涉及使用兩種或更多種標誌物。
[0177]獲得STRO-1+細胞的方法還可能包括使用已知技術進行第一富集步驟之前採集細胞來源。因此，組織將以手術方式移除。接著將構成來源組織的細胞分離為所謂單細胞懸浮液。此分離可以通過物理和或酶學方式達成。
[0178]一旦獲得了適合的STRO-1+細胞群體，就可以通過任何適合方式對其進行培養或擴增以獲得MEMP。
[0179]在一個實施例中，細胞是取自欲治療的受試者，使用標準技術在體外培養並且用於獲得上清液或可溶性因子或擴增細胞以自體或同種異體組合物形式施用至受試者。在可選實施例中，使用一種或多種已建立的人細胞系的細胞來獲得上清液或可溶性因子。在另一適用實施例中，使用非人動物的細胞(或者如果患者不是人，則來自另一物種)來獲得上清液或可溶性因子。
[0180]本發明可以使用來自任何非人動物物種的細胞加以實施，包括但不限於非人靈長類動物細胞、有蹄類動物、犬科動物、貓科動物、兔類動物、齧齒動物、鳥類動物和魚類動物細胞。可用於實施本發明的靈長類動物細胞包括但不限於黑猩猩、狒狒、食蟹獼猴和任何其它新世界或舊世界猴類的細胞。可用於實施本發明方法的有蹄類動物細胞包括但不限於牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛和野牛的細胞。可用於實施本發明方法的齧齒動物細胞包括但不限於小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠和沙鼠細胞。可用於實施本發明方法的兔類動物物種的實施例包括家兔、長腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。雞(原雞(Gallus gallus))為可用於實施本發明的方法的鳥類物種的一個實例。
[0181]在一個實施例中，細胞是人細胞。
[0182]適用於本發明方法的細胞在使用前或獲得上清液或可溶性因子前可儲存。保藏和儲存真核細胞和尤其哺乳動物細胞的方法和方案在本領域中是已知的(參見例如 Pollard, J.W.和 Walker, J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols,第二版，Humana Press, Totowa, N.J.；Freshney, R.1.(2000)Culture of Animal Cells,第四版，ffiley-Liss, Hoboken, N.J.)。維持所分離的幹細胞(諸如間充質幹細胞/祖細胞)或其子代的生物活性的任何方法都可以結合本發明來使用。在一個實施例中，通過使用低溫保減來維持和儲存細胞。
[0183]遺傳修飾細朐
[0184]在一個實施例中，對STRO-1+細胞和/或其子代細胞進行遺傳修飾，例如，以表達和/或分泌相關蛋白質。例如，細胞被工程改造來表達在治療運動障礙或其它中風的影響中有用的蛋白質，如例如在Meade等,J Exp Stroke TransI Med2:22-40，2009中描述的神經生長因子或多肽。
[0185]遺傳修飾細胞的方法對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。例如，使欲在細胞中表達的核酸可操作地連接至用於在細胞中誘導表達的啟動子。例如，將核酸連接至可在受試者的多種細胞中可操作的啟動子，諸如病毒啟動子，例如CMV啟動子(例如CMV-1E啟動子)或SV-40啟動子。其它適合啟動子在本領域中是已知的並且應理解為在作了必要修改的情況下適用於本發明的實施例。
[0186]在一個實施例中，核酸以表達構建體的形式提供。如本文所用，術語「表達構建體」是指具有在細胞中將表達賦予到可操作地連接的核酸(例如報導基因和/或可反選擇的報導基因)的能力的核酸。在本發明的上下文中，應了解，表達構建體可包含或為質粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組或基因組片段或能夠以可表達格式維持和/或複製異源DNA的其它核酸。
[0187]構建適用於實施本發明的表達構建體的方法對於本領域的技術人員來說將是顯而易見的並且描述於以下文獻中:例如Ausubel等(見:Current Protocols inMolecular Biology.Wiley Interscience, ISBN047150338, 1987)或 Sambrook 等(見:Molecular Cloning:MoIecuIar Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratories, New York,第三版2001)。例如,使用例如PCR從適合模板核酸擴增表達構建體的各組分並隨後克隆至適合的表達構建體(諸如質粒或噬菌粒)中。
[0188]適於所述表達構建體的載體在本領域中是已知的和/或在本文中描述。例如，適於哺乳動物細胞中的本發明方法中使用的表達載體為例如由Invitrogen供應的pcDNA載體套裝的載體、PCI載體套裝的載體(Promega)、pCMV載體套裝的載體(Clontech)、pM載體(Clontech)、pSI 載體(Promega)、VP16 載體(Clontech)或 pcDNA 載體套裝的載體(Invitrogen)。`
[0189]本領域的技術人員將認識到其它載體和所述載體的來源，諸如LifeTechnologies 公司、Clontech 或 Promega0
[0190]用於將分離的核酸分子或包含所述核酸的基因構建體引入細胞中用於表達的方式對於本領域的技術人員來說是已知的。用於指定生物體的技術取決於已知的成功技術。用於將重組DNA引入細胞中的方式包括顯微注射、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體(諸如使用 lipofectamine (Gibco, MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco, MD, USA))介導的轉染、PEG介導的DNA吸收、電穿孔和微粒轟擊(諸如使用塗有DNA的鶴粒子或金粒子(AgracetusInc.,WI1USA))以及其它方式。
[0191]或者，本發明的表達構建體是病毒載體。適合病毒在本領域中是已知的並且可商購獲得。用於遞送核酸和使所述核酸整合至宿主細胞基因組中的常規基於病毒的系統包括例如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體或腺相關病毒載體。或者，腺病毒載體適用於將保持游離形式的核酸引入宿主細胞中。病毒載體為靶細胞和組織中基因轉移的有效且通用的方法。另外，已在多種不同細胞類型和靶組織中觀察到高轉導效率。
[0192]例如，逆轉錄病毒通常包含包裝能力高達6-10kb外來序列的順式作用長末端重複(LTR)。最小順式作用LTR就足以用於載體的複製和包裝，其接著用於將表達構建體整合至靶細胞中以提供長期表達。廣泛使用的逆轉錄病毒載體包括基於以下病毒的載體:鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其組合(參見例如Buchscher等，J Virol.56:2731-2739 (1992)；Johann 等，J.Virol.65:1635-1640(1992) ;Sommerfelt 等，Virol.76:58-59 (1990)；Wilson 等，J.Virol.63:274-2318(1989) ；Miller 等，J.Virol.65:2220-2224(1991) ；PCT/US94/05700 ；Miller 和 Rosman BioTechniques7:980-990，1989 ；Miller, A.D.Human GeneTherapy7:5-14, 1990 ;Scarpa等Virology75:849_852，1991 ;Burns等Proc.Natl.Acad.SciUSA90:8033-8037, 1993)。[0193]已開發各種腺相關病毒(AAV)載體系統用於核酸遞送。AAV載體可以使用本領域中已知的技術容易地構建。參見例如美國專利號5，173，414和5，139，941 ;國際公布號W092/01070 和 W093/03769 ；Lebkowski 等 Molec.Cell.Biol.5:3988-3996，1988 ；Vincent等(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter Current Opinionin Biotechnology5:533-539,1992 ；Muzyczka.Current Topics in Microbiol, andImmunol.755:97-129，1992 ;Kotin, Human Gene Therapy5:793-801, 1994 ；Shelling 和Smith Gene Therapy7:165-169,1994 ;和 Zhou 等 J Exp.Med.779:1867-1875，1994。
[0194]適用於遞送本發明的表達構建體的其它病毒載體包括例如來源於痘病毒家族的載體，諸如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或綴合病毒載體(例如Fisher-Hoch等，Proc.Natl Acad.Sc1.USA56:317-321, 1989 中所述的載體)。
[0195]細胞和可溶性因子的治療/預防潛能的測定
[0196]用於確定細胞或可溶性因子改善大腦功能和/或治療運動障礙和/或使大腦神經元再生的能力的方法對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。
[0197]例如，將細胞或可溶性因子與神經元一起培養，並且評估細胞或可溶性因子誘導軸突生長的能力，例如，顯微技術。類似的測定可以在體內通過注射細胞和/或可溶性因子至雞胚的腦中並且評估軸突的生長來進行,例如,如本文所例舉的。
[0198]在一個實施例中，在與細胞和/或可溶性因子一起培養時或之前將神經元暴露在氧和/或葡萄糖剝奪下。氧和葡萄糖剝奪是一種缺血模型。
[0199]在另一個實施例中，細胞在誘導神經元分化的條件下生長，例如包含叔丁基羥基茴香醚和丙戊酸或5-氮雜胞苷或吲哚美辛和異丁基甲基黃嘌呤和胰島素。分化成神經元的細胞被認為適用於治療。
[0200]在又一個實施例中，將細胞或可溶性因子(例如，(例如通過親和純化或色譜得到的)因子或單個因子或因子片段的混合物)施用於中風模型，並且對大腦功能、大腦神經元再生和/或運動障礙的影響進行評估。
[0201]存在各種已知的技術用於誘導非人動物受試者的缺血性中風，如，主動脈/腔靜脈閉塞、外頸部止血帶或箍、出血或低血壓、顱內高壓或頸總動脈閉塞、兩-血管閉塞和低血壓、四-血管閉塞、單側頸總動脈閉塞(僅在某些物種中)、內皮素-1誘導的動脈和靜脈收縮、大腦中動脈閉塞、自發腦梗塞(自發性高血壓大鼠)、巨球栓塞、血液凝塊栓塞或微球栓塞。出血性中風可以通過向腦部輸注膠原酶而建模。
[0202]在一個實施例中，中風模型包括大腦中動脈閉塞來產生缺血性中風。
[0203]為了測試群和/或子代和/或分泌因子治療中風的影響的能力，將群和/或子代和/或分泌因子在誘導中風之後施用，例如，在中風的I小時至I天內。在施用後對大腦功能和/或運動障礙進行幾次評估。
[0204]評估大腦功能和/或運動障礙的方法對於本領域的技術人員來說將是顯而易見的並且包括，例如轉棒、高架十字迷宮、開場實驗、Morris水迷宮、T-迷宮、八臂迷宮、運動評估(例如，在一定時間內覆蓋的面積)、甩尾或De Ryck』 s行為測試(De Ryck等.，Stroke.20:1383-1390, 1989)。額外的測試對於本領域的技術人員將是顯而易見的和/或是本文所描述的。
[0205]在另一個實施例中，群和/或子代和/或分泌因子對大腦的效果通過成像來評估。例如，細胞凋亡、自噬和神經血管單元可以通過體內光學成像來檢測(Liu等.，BrainRes.2011年4月27日)，並且可以使用PET、MRI或CT來評估各種因素，如梗塞的大小、半暗帶尺寸和/或腦損傷的程度。
[0206]還評估了群和/或子代和/或分泌因子對大腦神經元的效果。例如，將腦或其大腦的一個區域移除，並且評估或估計神經元的數目或神經元的子型。根據所使用的模型，這個數目可以與對照動物中的數目相比較，或者如果僅誘導了局灶性缺血，那麼與同一動物的腦部對照區域相比較。
[0207]細朐糹目合物
[0208]在本發明的一個實施例中，STRO-1+細胞和/或其子代細胞是以組合物形式施用。在一個實施例中，所述組合物包含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[0209]術語「載體」和「賦形劑」是指在本領域中常規用於促進活性化合物的儲存、施用和/或生物活性的物質的組合物(參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版，Mac Publishing Company(19 80)。載體還可減少活性化合物的任何不當副作用。適合載體例如是穩定的，例如不能與載體中的其它成分反應。在一個實施例中，載體在用於治療的劑量和濃度下在接受者體內不產生明顯的局部或全身性不良作用。
[0210]適用於本發明的載體包括那些常規使用的載體，例如水、鹽水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer’s solution)、緩衝溶液、透明質酸和二醇是示例性液體載體,特別是(當等滲時)對於溶液來說。適合藥用載體和賦形劑包括澱粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
[0211]在另一實施例中，載體是介質組合物，例如細胞在其中生長或懸浮的介質組合物。在一個實施例中，所述介質組合物不在其所施用的受試者中誘發任何不良作用。
[0212]示例性介質和賦形劑不會不利地影響細胞活力和/或細胞減少、預防或延遲中風的影響的能力。
[0213]在一個實施例中，載體或賦形劑提供緩衝活性以使細胞和/或可溶性因子維持在適合pH下，由此發揮生物活性，例如載體或賦形劑是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。PBS代表一種有吸引力的載體或賦形劑，因為其與細胞和因子相互作用的程度最低並且允許快速釋放細胞和因子，在這種情況下，可將本發明的組合物製造為用於例如通過注射直接施加至血流或組織或圍繞組織或與組織相鄰的區域中的液體。
[0214]STRO-1+細胞和/或其子代細胞也可以併入或包埋於與接受者相容並且降解為對接受者無害的產物的骨架中。所述骨架提供對欲移植到接受受試者體內的細胞的支持和保護。天然和/或合成生物可降解性骨架為所述骨架的實例。
[0215]多種不同的骨架可成功用於實施本發明。示例性骨架包括但不限於生物可降解的骨架。天然生物可降解骨架包括膠原蛋白、纖連蛋白和層連蛋白骨架。適用於細胞移植骨架的合成材料應能夠支持廣泛細胞生長和細胞功能。所述骨架也可被吸收。適合骨架包括聚乙醇酸骨架，例如如 Vacanti 等,J.Ped.Surg.23:3-91988 ；Cima 等,Biotechnol.Bioeng.35:1451991 ；Vacanti 等,Plast.Reconstr.Surg.88:153-91991 所述，或合成聚合物，諸如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。
[0216]在另一實施例中，細胞可在凝膠骨架(諸如來自Upjohn公司的Gelfoam)中施用。
[0217]適用於本文所述方法的細胞組合物可以單獨施用或作為與其它細胞的混合物施用。可結合本發明組合物施用的細胞包括但不限於其它多效或多能細胞或幹細胞，或骨髓細胞。不同類型的細胞可在臨施用前或施用前不久與本發明組合物混合，或者其可以在施用前一起共培養一段時間。
[0218]在一個實施例中，組合物包含有效量或治療或預防有效量的細胞。例如,組合物包含約I X 105個STRO-1+細胞/kg至約1X 107個STRO-1*細胞/kg或約1X 106個STRO-1*細胞/kg至約5X IO6個STRO-1*細胞/kg。有待施用的細胞的確切量取決於多種因素，包括患者的年齡、體重和性別以及中風的範圍和嚴重程度和/或中風的部位。
[0219]在一個實施例中，將低劑量細胞施用至受試者。示例性劑量包括每公斤約
0.1XlO4和0.5 X IO6之間個細胞，例如每公斤約0.1XlO5和0.5 X IO6之間個細胞，諸如每公斤約0.5 X IO5和0.5 X IO6之間個細胞，例如每公斤約0.1 X IO6和0.5 X IO6之間個細胞，例如每公斤約0.2 X IO6或0.3 X IO6或0.4X IO6個細胞。
[0220]在一些實施例中，細胞是含於不允許細胞離開進入受試者循環中，然而允許由細胞分泌的因子進入循環中的腔室中。以此方式，可通過允許細胞分泌因子進入受試者循環中來向受試者施用可溶性因子。所述腔室同樣可植入受試者的某一部位以增加可溶性因子的局部水平，例如在胰腺中或其附近植入
[0221]在本發明的一些實施例中，可不必或不需要在起始細胞組合物療法前對患者進行免疫抑制。因此，移植同種異體或者甚至異種的STRO-1*細胞或其子代在一些情況下可能是耐受:的。
[0222]然而，在其它情況下，在起始細胞療法前以藥理學方式對患者進行免疫抑制和/或針對細胞組合物減少受試者的免疫反應可能是需要或適當的。這可以通過使用全身性或局部免疫抑制劑來實現，或者這可以通過在囊封裝置中遞送細胞來實現。細胞可以囊封在細胞所需要的營養物和氧以及治療因子可透過，而細胞不可透過的膠囊中來免疫體液因子和細胞。在一個實施例中，囊封劑具有低變應原性，容易地且穩定地位於靶組織中，並且對所植入的結構提供附加保護。降低或消除對移植細胞的免疫反應的這些和其它方式在本領域中是已知的。作為替代，可對細胞進行遺傳修飾以降低其免疫原性。
[0223]可溶性因子的組合物
[0224]在本發明的一個實施例中，由STRO-1*細胞得到和/或由子代細胞得到的上清液或可溶性因子是以例如包含適合載體和/或賦形劑的組合物形式施用。在一個實施例中，載體或賦形劑不會不利地影響可溶性因子或上清液的生物學作用。
[0225]在一個實施例中，組合物包含穩定可溶性因子或上清液組分(例如蛋白酶抑制劑)的物質的組合物。在一個實施例中，所包括的蛋白酶抑制劑的量不足以對受試者產生不良影響。
[0226]包含由STRO-1*細胞得到和/或由子代細胞得到的上清液或可溶性因子的組合物可製備為適當液體懸浮液，例如於培養基或於穩定載體或緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)中的懸浮液。適合載體在上文中描述。在另一實施例中，包含由STRO-1+細胞得到和/或由子代細胞得到的上清液或可溶性因子的懸浮液是用於注射的油性懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質體。欲用於注射的懸浮液也可含有增加懸浮液的粘度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。任選地，懸浮液也可含有適合的穩定劑或增加化合物的溶解度以允許製備高度濃縮溶液的試劑。
[0227]可以通過在具有上述成分之一或其組合的適當溶劑中併入所需量的上清液或可溶性因子，需要時隨後過濾滅菌來製備無菌注射溶液。
[0228]一般來說，通過將上清液或可溶性因子併入含有基本分散介質或來自以上列出成分的其它所需成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，示例性製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，此舉產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液的任何其它所需成分的粉末。根據本發明的替代方面，上清液或可溶性因子可以與一種或多種增強它的溶解度的其它化合物一起配製。
[0229]其它示例性載體或賦形劑描述於以下文獻中:例如Hardman等，(2001)Goodman 和 Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, NewYork,N.Y.；Gennaro (2000)Remington: The Science and Practice ofPharmacy, Lippincott, Williams 以及 Wilkins, New York, N.Y.;Avis 等，(編著)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY ；Lieberman等，(編著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets, Marcel Dekker, NY ；Lieberman等，(編著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems, Marcel Dekker, NY ；Weiner 和 Kotkoskie (2000)Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., NewYork, N.Y.。
[0230]治療組合物通常應無菌且在製造和儲存條件下穩定。組合物可配製成溶液、微乳液、脂質體或其它有序結構。載體可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其適合混合物的溶劑或分散介質。可例如通過使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液的情況下通過維持所需粒度和通過使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，希望在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬酯酸鹽和明膠)來達成。此外，可溶性因子可以於時間釋放製劑中施用，例如於包括緩慢釋放聚合物的組合物中施用。活性化合物可用保護化合物免於快速釋放的載體製備，諸如控制釋放製劑，包括植入物和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。多種用於製備所述製劑的方法已獲得專利或通常為本領域的技術人員所已知。
[0231]上清液或可溶性因子可與例如提供可溶性因子的緩慢釋放的適當基質組合施用。
[0232]組合物的附加組分[0233]STR0-1+細胞得到的上清液或可溶性細胞因子、STR0-1+細胞或其子代可以與其它 有益的藥物或生物分子（生長因子、營養因子）一起施用。當與其它藥劑一起施用時，它們 可以在單一藥物組合物中、或在分開的藥物組合物中、與其它藥劑同時或按序（在施用其 它藥劑之前或之後）一起施用。可以共施用的生物活性因子包括抗細胞凋亡劑（例如EP0、 EP0模擬體、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱氨酸蛋白酶抑制劑）；消炎藥（例如，p38MAPK 抑制劑、TGF-P 抑制劑、他汀類、IL-6 和 IL-1 抑制劑、PEMIROLAST、TRANLAST、REMICADE、 SIR0LIMUS,以及 NSAID (非類固醇消炎藥，例如 TEP0XALIN、T0LMETIN、SUPR0FEN);免疫抑制 /免疫調節劑（例如鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如環孢素、他克莫司；mT0R抑制劑（例如， SIR0LIMUS.EVER0LIMUS);抗增生劑（例如，咪唑硫嘌呤、黴酚酸酯）；皮質類固醇（例如，潑 尼松龍、氫化可的松）；抗體例如單克隆抗-IL-2a受體抗體（例如，巴利昔單抗、達克珠單 抗）、多克隆抗T細胞抗體（例如抗胸腺細胞球蛋白（ATG);抗淋巴細胞球蛋白（ALG);單克 隆抗T細胞抗體0KT3));抗血栓形成劑（例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack (右旋苯基 丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮）、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血 小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達莫、魚精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑和血小板抑制劑）； 和抗氧化劑（例如普羅布考、維生素A、抗壞血酸、生育酚、輔酶Q-10、穀胱甘肽、L-半胱氨 酸、N-乙醯半胱氨酸），以及局部麻醉劑。
[0234]在一個實施例中，如本文根據任何實施例描述的組合物包含用於改善大腦功能和 /或使大腦神經元再生和/或治療運動障礙的附加因子，例如，神經生長因子。
[0235]或者或另外，如本文根據任何實施例描述的細胞、分泌因子和/或組合物與中風 影響的已知治療組合，例如，物理療法和/或語言療法。
[0236]在一個實施例中，如本文根據任何實施例描述的藥物組合物包含用於治療中風的 影響的化合物。或者，如本文根據本發明的任何實施例描述的治療/預防的方法另外包括 施用用於治療中風的影響的化合物。示例性化合物在本文描述並且應理解為在作了必要的 修改的情況下適用於本發明的這些實施例。
[0237]在另一個實施例中，如本文根據任何實施例描述的組合物另外包含誘導或增強祖 細胞分化為血管內皮細胞的因子。示例性因子包括血管內皮生長因子（VEGF)、血小板衍生 生長因子（H)GF，例如TOGF-BB)以及FGF。
[0238]在另一個實施例中，如本文根據任何實施例描述的組合物另外包含組織特異性定 向細胞（TSCC)。在這方面，國際專利申請號PCT/AU2005/001445示範了施用TSCC和STR0-1+ 細胞可以使得TSCC的增殖增強。在一個實施例中，TSCC是血管細胞。對受試者施用所述 組合物可以導致血管的產生增加，例如導致被遞送至受影響的組織的營養成分增加。
[0239]醫療裝置
[0240]本發明還提供了用於使用或當在如本文根據任何實施例描述的方法中使用時的 醫療裝置。例如，本發明提供包含如本文根據任何實施例描述的STR0-1+細胞和/或其子 代和/或其可溶性因子和/或組合物的注射器或導管或其它合適的遞送裝置。任選地，注 射器或導管與如本文根據任何實施例描述的方法的說明書一起包裝。
[0241]在另一個實施例中 ，本發明提供包含如本文根據任何實施例描述的STR0-1+細胞 和/或其子代和/或其可溶性因子和/或組合物的植入物。任選地，植入物與如本文根據 任何實施例描述的方法的說明書一起包裝。合適的植入物可以形成為具有支架，例如如上文所述，和STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或其可溶性因子。
[0242]施用模式
[0243]由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代可手術植入、注射、遞送(例如藉助於導管或注射器)或以其它方式直接或間接施用至需要修復或增強的部位(例如器官)或施用至脂肪墊中。
[0244]在一個實施例中，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是遞送至受試者的血流中。例如，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是以腸胃外方式遞送。腸胃外施用的示例性途徑包括但不限於腹腔、腦室、腦室內、鞘內或靜脈內。在一個實施例中，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是動脈內遞送至主動脈中、心臟的心房或心室中或血管中，例如靜脈內。
[0245]在細胞遞送至心臟的心房或心室的情況下，可以將細胞施用至左心房或左心室以避免可能由細胞快速遞送至肺而引起的併發症。
[0246]在一個實施例中，群和/或子代和/或可溶性因子是施用至頸動脈內。
[0247]在一個實施例中，群和/或子代和/或可溶性因子是施用至受試者的腦中，例如，顱內。例如，將群和/或細胞和/或可溶性因子施用至大腦和/或任選至紋狀體。
[0248]在一個實施例中，將群和/或細胞和/或可溶性因子施用至缺血部位和/或缺血部位的周邊。所述部位可以使用本領域已知的方法來確定，例如磁共振成像和/或計算機斷層掃描和/或超聲。
[0249]用於治療性製劑的施用方案的選擇取決於若干因素，包括實體的血清或組織周轉率、症狀水平和實體的免疫原性。
[0250]在一個實施例中，由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代是以單次推注劑量來遞送。或者通過連續輸注、或通過間隔為例如一天、一周或每周
1-7次的劑量來施用由STRO-1+細胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+細胞或其子代。示例性劑量方案是涉及最大劑量或避免明顯不當副作用的劑量頻率的方案。總每周劑量取決於所使用因子/細胞的類型和活性。適當劑量由臨床醫師例如使用本領域中已知或懷疑影響治療或預測影響治療的參數或因素來確定。一般來說，劑量始於稍小於最佳劑量的量並在此後以較小增量增加直至相對於任何負面副作用達成所需或最佳的效果。
[0251]本發明包括以下非限制性實施例。
實施例
[0252]實施例1:通討詵擇STR0-31細朐對MPC講行免瘡詵擇
[0253]骨髓(BM)是從健康正常的成人志願者(20-35歲)中採集。簡單地說，從髂後嵴抽吸40ml BM至含肝素鋰抗凝劑的試管中。
[0254]如先前所述(Zannettino,A.C.等(1998) Blood92:2613-2628)使用Lymphoprep? (Nycomed Pharma, Oslo, Norway)通過密度梯度分離製備 BMMNC。在4 °C下以400Xg離心30分鐘後，用轉移吸管移除白細胞層並在由含有5%胎牛血清(FCS ;CSL Limited, Victoria, Australia)的漢克氏平衡鹽溶液(HBSS ;LifeTechnologies, Gaithersburg, MD)構成的 「HHF」 中洗漆三次。[0255]隨後如先前所述(Gronthos等(2003) Journal of Cell Sciencell6:1827-1835 ；Gronthos, S.和 Simmons, P.J.(1995)Blood85:929-940)通過磁性活化細胞分選法分離STR0-3+(或TNAP+)細胞。簡單地說，在冰上將約1-3X IO8個BMMNC在由10%(v/v)正常兔血清於HHF中組成的阻斷緩衝液中孵育20分鐘。在冰上將細胞與200 μ I的STR0_3mAb於阻斷緩衝液中的10 μ g/ml溶液一起孵育I小時。隨後通過在400 X g下離心將細胞在HHF中洗滌兩次。加入山羊抗小鼠 Y-生物素(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)於HHF緩衝液中的1/50稀釋液且在冰上將細胞孵育I小時。如上將細胞在MACS緩衝液(補充有l%BSA、5mM EDTA和0.01%疊氮化鈉的無Ca2+且無Mn2+的PBS)中洗滌兩次並重懸於最終體積為0.9ml的MACS緩衝液中。
[0256]將100 μ I 抗生蛋白鏈菌素微珠(Miltenyi Biotec;Bergisch Gladbach, Germany)加入細胞懸浮液中且在冰上孵育15分鐘。將細胞懸浮液洗滌兩次並重懸於0.5ml MACS緩衝液中且隨後上樣至微型MACS管柱(MS Columns, Miltenyi Biotec)上，並用0.5ml MACS緩衝液洗滌三次以回收未結合STR0-3mAb的細胞(於2005年12月19日保藏於美國典型培養物中心(American Type Culture Collection ;ATCC),保藏編號 PTA-7282-參見國際公布號W02006/108229)。再加入Iml MACS緩衝液後，由磁體移除管柱並通過正壓力分離TNAP+細胞。將來自各部分的細胞等分試樣用抗生蛋白鏈菌素-FITC染色並通過流式細胞術評估純度。丨
[0257]實施例2:通討STR0~3mAb詵擇的細朐是STRO-1a細朐
[0258]設計實驗以證實使用STR0_3mAb作為用於分離細胞STR0-1胃細胞的單一試劑的可能性。
[0259]鑑於STR0_3(IgGl)的同種型與STR0-1 (IgM)的同種型不同，因此通過雙色FACS分析基於與使用MACS程序分離的STRO-T細胞的共表達評估STR0-3鑑定克隆CFU-F的能力(圖1)。點陣直方圖表示以列表模式數據形式收集的5X IO4個事件。垂直線和水平線設定為小於用在相同條件下處理的同種型匹配對照抗體1B5 (IgG)和1A6.12 (IgM)獲得的平均螢光的1.0%的反應性水平。結果表明STR0-1胃細胞的較小群體共表達TNAP (右上象限)，而其餘STRO-T細胞未能與STR0-3mAb反應。隨後測定所有四個象限的通過FACS分離的細胞的CFU-F發生率(表1)。
[0260]表1:通過雙色FACS分析基於細胞表面標誌物STR0-1和TNAP的共表達富集人骨髓細胞(參考圖1)。將FACS分選的細胞在標準克隆條件下在補充有20%FCS的a MEM中培養。數據表示鋪板的每IO5個細胞中第14天群落形成細胞(CFU-F)的平均數土SE(n=3個不同骨髓抽吸物)。這些數據表明人MPC僅局限於BM(其明顯共表達STR0-1抗原)的TNAP陽性部分。
【權利要求】
1.一種在患有中風的受試者中改善大腦功能或預防大腦功能喪失的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO-r細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
2.如權利要求1所述的方法，其中改善所述受試者的大腦功能改善了所述受試者的運動障礙。
3.一種治療或預防患有中風的受試者的運動障礙的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO-細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
4.如權利要求2或3所述的方法，其中所述運動障礙是麻痺、部分麻痺、言語不清、動作不協調、肌無力、張力減退、張力亢進或不自主的異常運動。
5.一種使患有中風的受試者的大腦神經元再生的方法，所述方法包括對所述受試者施用富含STRO細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述大腦神經元是在大腦皮層中。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述大腦神經元是在運動皮層和/或感覺皮層中。
8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述中風是缺血性中風。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述缺血性中風是由受試者的大腦中動脈閉塞造成的。
10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其包括在中風後I小時與2周之間對所述受試者施用富含STRO-細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
11.如權利要求10所述的方法，其包括在中風後24小時內對所述受試者施用富含STRO-細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。 丨
12.如權利要求1至11中任一項所述的方法，其包括施用富含STRO-1s細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述細胞額外地表達組織非特異性鹼性磷酸酶(TNAP)和/或熱休克蛋白90 β (HSP90P)和/或CD 146。
14.如權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述細胞群是獲自骨髓或牙髓。
15.如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述富含STRO-細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用。
16.如權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述富含STRO細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是對所述受試者的腦部局部地施用。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述富含STRO-細胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是對受試者的大腦局部地施用。
18.如權利要求1至17中任一項所述的方法，其包括施用足以改善大腦功能和/或使大腦神經元再生的劑量的所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子。
19.如權利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子施用多次。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子是每四周或更多周施用一次。
21.如權利要求1至20中任一項所述的方法，其包括施用每公斤0.1 X IO6至5 X IO6之間個STRO-細胞和/或其子代。
22.如權利要求1至20中任一項所述的方法，其包括施用每公斤0.3 X IO6至2 X IO6之間個STRO-1+細胞和/或其子代。
23.如權利要求1至20中任一項所述的方法，其包括施用低劑量的STRO-1+細胞和/或其子代。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述低劑量的STRO-1+細胞和/或其子代包含每公斤0.1 X IO5至0.5 X 106之間個STRO-1+細胞和/或其子代。
25.如權利要求1至24中任一項所述的方法，其中所述富含STRO-1+細胞的群和/或子代細胞是自體的或異體的和/或所述可溶性因子可以獲自自體或異體細胞。
26.如權利要求1至25中任一項所述的方法，其中所述富含STRO-1+細胞的群和/或子代細胞已在施用之前和/或在獲得所述可溶性因子之前經過培養擴增。
27.如權利要求1至26中任一項所述的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子以包含所述STRO-1+細胞和/或其子代細胞和/或由其得到的可溶性因子和載體和/或賦形劑的組合物的形式來施用。
28.一種富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子，其用於改善中風後的受試者的大腦功能或治療中風後的受試者的運動障礙或使中風後的受試者的大腦神經元再生。
29.富含STRO-1+細胞的細胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的用途，其用於製造用於改善中風後的受試者的大腦功能或治療中風後的受試者的運動障礙或使中風後的受試者的大腦神經元再生的藥物。
【文檔編號】C12N5/077GK103826646SQ201280033263
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2011年6月3日
【發明者】西蒙·安德裡亞·科博拉爾, 斯坦·格勞恩索斯, 艾格尼絲卡·亞瑟 申請人:麥瑟布萊斯特公司, 中央阿德萊德當地衛生網絡公司