一種含LoxP-FRT重組酶位點的植物雙元表達載體的製作方法
2023-05-09 21:43:11 1
專利名稱：一種含LoxP-FRT重組酶位點的植物雙元表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種含LoxP-FRT重組酶位點的植物雙元表達載體。
背景技術：
隨著技術的發展，新的植物遺傳轉化方法在不斷增加。但在眾多的植物遺傳轉化方法中，對農桿菌介導的轉化方法研究的最多，機理最為透徹。農桿菌介導的轉化因操作簡單、費用低廉等獨特優點，成為植物遺傳轉化的首選。根癌農桿菌介導的方法是獲得穩定的植物遺傳轉化的方法之一。 根癌農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤細菌，是植物病原菌，可以引發植物產生冠癭瘤。農桿菌能夠通過感染植物的傷口，將其Ti質粒的T-DNA區整合到植物基因組中。這是自然界中將外源DNA轉入植物細胞的天然方法。Ti質粒T-DNA區段的左右兩端各有一個高度保守的25bp長的同向不完全重複序列(LB和RB)。在農桿菌對植物的轉化中RB先進入植物細胞，隨後外源基因及LB進入。原始的農桿菌T-DNA上編碼的部分基因可以破壞植物細胞內源激素的平衡，幹擾植物正常新陳代謝，引發植物腫瘤的形成。T-DNA的切除和轉移是由Ti質粒的致毒(Vir)區基因編碼的蛋白完成。在所有的Ti質粒中，T-DNA區和Vir區是兩個不同的區域。這是農桿菌介導植物轉化的基礎。人們利用農桿菌轉化的原理，開發了植物表達雙元載體系統。一個雙元載體系統是由兩個分別含有T-DNA和Vir區的相容性突變Ti質粒組成。通常實驗中構建的雙元載體為已去除了 T-DNA中與幹擾植物新陳代謝相關的基因，只含有T-DNA的兩端邊界序列。輔助質粒為含有Vir區段，但T-DNA缺失，完全喪失了致瘤的功能；其作用是提供Vir基因功能，激活T-DNA轉移。為了使雙元Ti載體能夠穿梭在大腸桿菌和農桿菌中，並能自我複製，在這些質粒中常用到廣譜複製原點，如PBIN19及其Ti質粒用到的pRK2。雙元Ti質粒也可有兩個複製原點(oris) JnpCGN系列質粒,一個用於大腸桿菌(如來自pColEl),另一個用於農桿菌(如來自pRi)。早期雙元載體pBIN19等的T-DNA區常克隆自野生型Ti質粒(如pTiT37)。後來人們才人工合成了 25bp重複結構的LB和RB片段。LB和RB之間序列常為一個選擇標記基因(編碼抗生素或除草劑)表達框和一些多克隆位點(MCS)。有的還含有一個用於藍白斑篩選的缺陷型￠-半乳糖苷酶基因(LacZ)。早期儘管人們已對Ti載體進行修改，但載體通常都很大(超過10kb)，MCS位點少，且在大腸桿菌中拷貝數很低。離體的重組效率與質粒DNA的大小成反比。為了能滿足轉化大片段DNA的需要，雙元Ti載體應儘量最小化。隨著人們對雙元載體的不斷改進，這些缺陷正逐漸減少。隨著人們對轉基因植物的生物安全性意識的提高，無標記轉基因植物成為商業生產轉基因植物發展的熱點。國內外研究者陸續開發了多種有效的策略。利用Cre或Flp重組酶，在獲得轉基因植株後將選擇標記基因去除是研究最為詳細、應用最廣的技術之一。雖然這些策略在刪除標記基因上取得了成功，但在載體的構建過程中由於經過多次的亞克隆步驟，最終能用於目的基因工程操作的MCS變得非常稀少，妨礙了後期的基因工程操作。現在常用的植物轉化雙元載體(如pGreen、pCAMBIA等系列)雖然有著諸多的優點，方便基因工程操作，但其主要是為基礎研究所創造，沒有為後期將植物篩選標記去除做準備。這就使其在植物遺傳轉化商業生產應用中受到限制。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種載體。本發明提供的載體，為環狀雙鏈DNA分子，自5』末端至3』末端依次包括大腸桿菌複製起始原點ColEl、農桿菌複製起始原點Rep-ori、調節蛋白Rep表達框、T-DNA超驅動區、T-DNA右邊界、T-DNA左邊界和Kan抗性基因表達框。上述載體中，所述大腸桿菌複製起始原點ColEl為序列表中序列4自5』末端第 1-589位核苷酸所不的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第1-589位核苷酸所不的雙鏈DNA片段；所述農桿菌複製起始原點Rep-ori為序列表中序列4自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述調節蛋白Rep表達框為序列表中序列4自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述Kan抗性基因表達框為序列表中序列4自5』末端第2448-3694位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第4120-5366位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第4351-5597位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第3877-5123位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；其蛋白的表達與質粒5』-3』順序相反；所述T-DNA超驅動區為序列表中序列4自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述T-DNA左邊界為序列表中序列4自5』末端第2423-2447位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第4095-4119位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第4326-4350位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第3852-3876位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述T-DNA右邊界為序列表序列4自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段，也為序列表中序列I自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段。
上述載體中，在所述T-DNA右邊界和所述T-DNA左邊界之間還包括內酶切識別位點I ;所述內酶切識別位點I具體為MluI的識別位點。上述載體中，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列4。上述載體中，在所述T-DNA右邊界和所述T-DNA左邊界之間還包括含有植物篩選標記基因表達框的片段，所述含有植物篩選標記基因表達框的片段自5』末端至3』末端依次包括多克隆酶切識別位點、右側LoxP-FRT融合位點、植物篩選標記基因表達框和左側LoxP-FRT融合位點。上述載體中，所述多克隆酶切識別位點為22個內切酶識別位點，所述22個內切酶識別位點自5』末端至3』末端具體依次為DraI識別位點、PmeI識別位點、NruI識別位點、識別位點甲、識別位點乙、Eco0109I識別位點、XhoI識別位點、PspXI識別位點、SalI識別 位點、ClaI識別位點、HindIII識別位點、EcoRV識別位點、EcoRI識別位點、PstI識別位點、識別位點丙、BamHI識別位點、SpeI識別位點、NotI識別位點、AleI識別位點、SacI識別位點、Mfe I識別位點、Age I識別位點；所述識別位點甲為KpnI位點或Acc65I識別位點；所述識別位點乙為ApaI位點或PspOMI識別位點；所述識別位點丙為SmaI位點或XmaI的識別位點；所述植物篩選標記基因表達框為NptII基因表達框、Hyg基因表達框或Bar基因表達框。上述植物篩選標記基因表達框的蛋白表達與質粒5』 -3』順序相反。上述載體中，所述左側LoxP-FRT融合位點為序列表中序列I自5』末端第4016-4083位核苷酸所示的雙鏈DNA片段或序列2的自5』末端第4247-4314位所示的雙鏈DNA片段或序列3的自5』末端第3773-3840位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述右側LoxP-FRT融合位點為序列表中序列I自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段或序列2的自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段或序列3的自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述NptII基因表達框為序列表中序列I自5』末端第2650-4007位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述Hyg基因表達框為序列表中序列2自5』末端第2650-4238位所示的雙鏈DNA片段；所述Bar基因表達框為序列表中序列3自5』末端第2650-3764位所示的雙鏈DNA片段。上述載體中，在所述左側LoxP-FRT融合位點和所述T-DNA左邊界之間還包括內切酶識別位點2 ;所述內切酶識別位點2具體為PmlI識別位點；在所述左側LoxP-FRT融合位點和所述篩選標記基因表達框之間還包括內切酶識別位點3 ;所述內切酶識別位點3具體為AscI識別位點；在所述植物篩選標記基因表達框和所述右側LoxP-FRT融合位點之間還包括由多個內切酶識別位點組成內切酶識別位點組；所述內切酶識別位點組自5』末端至3』末端具體依次為BsiWI識別序列、StuI識別序列和AseI識別序列。
所述載體自5』末端至3』末端依次包括大腸桿菌複製起始原點ColEl、農桿菌複製起始原點R印-ori、調節蛋白R印表達框、T-DNA超驅動區、T-DNA右邊界、多克隆酶切識別位點、右側LoxP-FRT融合位點、BsiWI識別序列、StuI識別序列、AseI識別序列、植物篩選標記基因表達框、AscI識別位點、左側LoxP-FRT融合位點、PmlI識別位點、T-DNA左邊界和Kan抗性基因表達框。上述載體為如下I)或2)或3):I)所述載體中植物篩選標記基因為NptII基因，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列I ;2)所述載體中植物篩選標記基因為Hyg基因，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列2 ； 3)所述載體中植物篩選標記基因為Bar基因，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列3。上述的載體在培育轉基因植物中的應用。本發明的實驗證明，本發明構建了植物表達雙元載體pYBAlOO、pYBA200和PYBA300，其載體較小且在T-DNA區獲得較多的22個MCS位點，由於使用了大腸桿菌複製原點ColEl和農桿菌複製起始原點R印_ori，可在大腸桿菌和農桿菌中複製，且具有較高的複製能力，方便了基因工程操作。載體的T-DNA植物篩選基因表達框兩側預留有LoxP-FRT融合位點，方便在獲得轉基因植物後通過Cre或FLP重組酶將植物篩選標記基因刪除，可以滿足用於安全生產轉基因植物的需要。
圖I為pYBA載體骨架結構示意2為大腸桿菌中提取的不同質粒DNA濃度比較圖3為載體pYBAlOO結構示意4為載體pYBA200結構示意5為載體pYBA300結構示意6為pYBAlOO轉基因植株T-DNA區段的PCR檢測圖7為pYBA200轉基因植株T-DNA區段的PCR檢測圖8為pYBA300轉基因植株T-DNA區段的PCR檢測圖9為pYBAlOO質粒經Cre重組酶離體刪除選擇標記基因圖10為pYBA200質粒經Cre重組酶離體刪除選擇標記基因
圖11為pYBA300質粒經Cre重組酶離體刪除選擇標記基因
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、植物表達雙元載體pYBAlOO、pYBA200、pYBA300的構建野生型擬南芥Columbia (Col-O)購自 ABRC(Arabidopsis BiologicalResourceCenter, Columbus, OH, USA)，產品目錄號為CS28166，實施例中簡稱為野生型擬南芥;大腸桿菌菌株DH5a購自Tiangen公司，產品目錄號為CBlOl ;根癌農桿菌GV3101(pMP90)公眾可以從北京農業生物技術研究中心獲得；參考文獻Koncz, C. and Schell, J. (1986)The promoter of TL-DNA gene 5 controlsthe tissue-specifice xpression of chimeric genes carried by a novel type ofAgrobacterium binary vector. Mol. Gen. Genet. 204, 383 - 396。pBBBasta載體的構建方法如下1、用SacI酶切質粒pDHB321. 1，回收約2100bp的片段(含LB-bar表達框-RB，序列5)。2、用SspI酶切質粒pBBRlMCS_2，回收約4440bp的片段(含卡那黴素抗性基因的骨架)。3、將步驟I回收的約2100bp的片段補平，與步驟2回收的約4440bp的片段連接，獲得植物表達載體pBBBasta，pBBBasta為將序列5插入pBBRlMCS_2的)SspI酶切位點間得到的載體。pBBRlMCS-2公眾可以從北京農業生物技術研究中心獲得；參考文獻=BlockMD, BottermanJ, Vandewiele M,Dockx J, Thoen C, GosseleV, Movva NR, ThompsonC，Montagu MV, LeemansJ. Engineering herbicide resistance in plants by expressionof a detoxifying enzyme. EMBO J. 1987 Sep;6(9):2513-8.pBI121 載體購自 ABRC,目錄編號:CD3_388 ；pBluescript II KS(+)載體購自Agilent公司(目錄編號212207);pUC19載體購自NEB公司(目錄編號N3041 )；pGreen0029載體購自 John Innes Centre (http://www. pgreen. ac. uk/) ;pCAMBIA1300 載體公眾可以從 http://www. cambia. org/ 獲得；本實驗使用的各種限制性內切酶購自TaKaRa和NEB公司，Cre重組酶、T4連接酶、去憐酸化酶購自 NEB 公司，Easy Taq 和 TransStart FastPfu DNA Polymerase 購自TransGen Biotech公司。PCR純化試劑盒,膠回收試劑盒,質粒小提試劑盒都購自康為世紀有限公司。引物、DNA合成及測序由上海生物工程技術服務有限公司完成。本實驗使用引物的核苷酸序列如下表I所示表I試驗中所用引物......麗................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
KaiiS，5, - CCGACGCGTamacaccacaataialcctgccaCGATTTGCCCATGGGGGl-3
Kan3f54 -gcggagcciaiggaaaCTGGGATGAATGTCAGCTACTG-3 *
colES"5 * -giagctgacaitcaicccagTTTCCATAGGCTCCGCCC-3 *
colE3，5f -tagtgagtatactcaagcIIGAGATCCITITTITCTGCGCGTAATCTG-3! Ori-rep5￥5，-acgcgcagaaaaaaaggatclcaaGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTG-3，
Ori-rcp3"5 』 -actaagtcgclgtaigtgiltglUgIATTCTGCCTCCCAGAGCCT-3 』
RB3 』5 -CCGAC MtgacaggatataUggcgggiaaacTAAGTCGCTGTATGlGITTG-31
PsfIS'5 』 -CCCTGAATGAACTtCAGGACGAGGCAGCGCGG-3，
PsiO'5 』 -CCGCGCTG€CTCGTCCTGaAGTTCATTCACiGCi-3,
MCS515 』 -GCGCTaccggtCTATAGGGCCAMICGAGCTCCAC-3
MCS315，~AGCTTTMmmctcQcmGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTC~3f
NosPS，5，-TTGGCGC(HrCflaicatgagcggagaattaa￡gaagl-3
NosP3!5 * -aatccatctigiicaatcatAGATCCGGTGCAGATTATTTG-34
NptII5，5，-aiaatcigcaccggalctATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-3 』
NptIO *5 』 -tgccaaatglttgaacgalcTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3
NosTS!5，-citcltgacgagilctlctgaGATCGTTCAAACATTTGGCA-3
Nosl'3 *5 * -CCAl IAAFcccgatctagtaacafaeatgacac-3"
ICpnLr5』-CTTCAGCCTGCCGGTCCGCCCCGTC-3』
Kpif3，y-GACGGGGCGGaACCGGCAGGCTGAAG-3'
SalIS!5、CTACGACTGGACGGC€GAGTCtACCGTGTACGTCWCd
SalLV5^GGGAGACGTACACGGTaGACTCGGCCGTCCAGTCGTAG-3
Agd5，5，-GCTGTTCTACAA(X:aGT(GCGGAGGCTATG-3』
Agcl3 S^-CATAGCCTCCGCGACtGGTTGTAGAACAGC-S'
Apal5，S^CGCCTACGCiGGCCCCTGG
ApaLVS^CCAGGGGCCaGCGTAGGCG
Hyg NosP3555 gigagiicaggciiiiicatAGATCCGGTGCACATTATTTG
HygfT5 ^caaalaalclgcaccggalctAfGAAAAAOCC IGAACrCACCGC-Jl
Hyg.r3』4geeaaatgmgaacgatdTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGirG-3』
Hyg-NmIT.I^giccgagggcaaagaaaiagGATrGTTC AAAC ATTTGGrA-35
NosT3'S'-CCAJTAATcccgatciagiaacaiagaigacac-J1
NosPS'5\TTe￡￡em￡Cgaieatgageggagaaimggg_-3』
Bar-NosP355 ^gcglcgttclgggctcatAG ATCCyGTCC^^GATTAT^FGGATTG-3,
Bar 』.I'-caaaiaalclgcaccggalciATGAGCCCAGAACGACGCo'
Bar.V.l^itgccaaalgmgaacgatcTCAGATCTCGGTGACGGGCAGCi.r
Bm-NosT5s5MgoxgtcaccgagaicigaGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGT-3』注各融合片段之間相鄰部分的引物為部分反向互補序列。一、pYBA雙元載體骨架的構建DNA操作和克隆都基於分子克隆手冊所述方法。PCR產物純化，DNA片段回收及質粒小量提取操作均按照試劑盒廠家提供使用說明書操作。為了能使構建的載體最小化，新設計的pYBA載體骨架部分儘量去除了非必要的元件(該載體的結果示意圖如圖I)。PYBA骨架自5』末端至3』末端依次包括大腸桿菌複製起始原點ColEl、農桿菌複製起始原點Rep-ori、調節蛋白Rep表達框、T-DNA超驅動區(overdrive, OD)、T-DNA右邊界(RB)、MluI的識別位點、T-DNA左邊界(LB)和Kan抗性基因表達框，約3. 69kb。該載體骨架在LB和RB間留有I個MluI位點，用於後期LB至RB間序列的插入；為了儘可能保留多的單酶切位點用於MCS，pYBA載體骨架採用融合PCR方法構建。
具體構建方法如下I、載體骨架元件的獲得I)突變前Kan抗性基因表達框的獲得以pBBBasta載體為模板，用引物Kan5』和Kan3』擴增，結果獲得1297bp的突變前Kan抗性基因表達框片段(經過測序為序列表中序列4的自5』末端第2417-3694、1-16位核苷酸，且第3249位點為C，且第3246 — 3251為PstI位點)。其中LB設計在引物Kan5』中，其中小寫部分為LB序列，下劃線部分是MluI限制性內酶切位點。
2) ColEl片段的獲得以pUC19載體為模板，用引物colE5，和引物colE3，擴增，得到627bp的ColEl片段(經過測序為序列表中序列4的自5』末端第3675-3694、1-611位核苷酸)。3)ori_RB片段的獲得以pBBBasta載體為模板，用引物0ri_rep5』和0ri_rep3』擴增，得到1824bp的ori-Rep片段(經過測序為序列表中序列4的自5』末端第566-2393位核苷酸)；再以ori-Rep片段為模板，用引物0ri_rep5』和引物RB3』延伸擴增，獲得1856bp的ori-RB片段(經過測序為序列表中序列4的自5』末端第566-2422位核苷酸)。RB設計在引物RB3』中，其中小寫部分為RB序列，下劃線部分是MluI限制性內酶切位點，大寫部分為OD序列。為了後期PCR產物的融合，引物colE5』和Kan3』為部分反向互補，引物colE3』和0ri-rep5』為部分反向互補。上述PCR產物均經瓊脂糖凝膠電泳去除多餘引物後，切膠回收後備用。2、中間載體I的獲得I) Kan 和 ColEl 片段融合以上述I得到的突變前Kan抗性基因表達框和ColEl片段為模板，用引物kan5』和引物colE3』進行融合PCR，得到大小為I. 89kb的Kan-ColEl融合片段(經過測序為序列表中序列4的自5，末端第2417-3694、1-611位核苷酸)。上述融合PCR 反應體系為5x FastPfu Buffer IOu I, 2. 5mM dNTPs5u I, FastPfu DNAPolymerase I U I, Kan 和 ColEl 純化後的 PCR 產物各 I ii 1，加水至47. I。上述融合PCR 的反應條件為95°C 2min，(95°C 20s，55°C 20s，72°C lmin)x48 循環，72°C 5min ;前12個循環不加引物，在第13個循環時加入引物kan5』和colE3』各I. 2 yl。2)中間載體的獲得用MluI和HindIII分別雙酶切上述I)得到的Kan-ColEl融合片段和上述I得到的ori-RB片段，酶切產物用T4連接酶4°C過夜連接後，將連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5a，獲得轉化子。將轉化子提取質粒進行PCR，引物為Kan5』和Kan3』，得到1297bp的片段為PCR陽性質粒。再將上述PCR陽性質粒分別用HindIII和BglII酶切，得到3690bp的片段即為中間載體。3、pYBA雙元載體骨架的構建
I)去除HindIII酶切位點將上述2得到的中間載體用HindIII酶切後得到酶切產物,再用Klenow Fragment補平所述酶切產物末端得到平末端產物，最後將所述平末端產物自連，獲得去除HindIII酶切位點的載體(圖I所示的HindIir位置為去除HindIII的位置)。2)去除PstI酶切位點新載體的抗性基因Kan中含PstI酶切位點。為了消除該位點對後期MCS的影響，採用定點突變的辦法將該位點去除。突變原則是選用單雙子葉植物偏好兼併密碼子，在不改變Kan胺基酸序列的情況下，改變核酸序列(序列4的第3249位點c — a)。以上述I)得到的去除HindIII酶切位點的載體為模板，利用突變引物PstI5』和PstI3』進行PCR擴增，得到3694bp的突變產物。突變引物PstI5』和PstI3』下劃線部分為原PstI位點，小寫字母為突變後的鹼基。上述PCR為20iil反應體系，載體加入量約為150ng ;反應條件為95°C 2min，(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循環，72°C 5min。DpnI酶切延伸產物，由於原來的模版質粒來源於常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎,而體外合成的帶突變序列的質粒由於沒有甲基化而不被切開，因此在隨後的轉化中得以成功轉化，即可得到突變質粒的克隆。因此將上述突變產物用DpnI消化後轉入DH5 a，得到轉化子。提取轉化子的質粒，經MluI和PstI雙酶切，只得到3694bp條帶的為陽性質粒。將上述陽性質粒送去測序，結果為該陽性質粒的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；將該陽性質粒命名為PYBA，大小為3694bp，為雙元載體。上述結果表明，pYBA自5』末端至3』末端依次由大腸桿菌複製起始原點ColEl、農桿菌複製起始原點R印-ori、調節蛋白R印表達框、T-DNA超驅動區(OD)、T-DNA右邊界、MluI限制性內酶切位點、T-DNA左邊界和Kan抗性基因表達框組成；所述大腸桿菌複製起始原點ColEl為序列表中序列4自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述農桿菌複製起始原點Rep-ori為序列表中序列4自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述調節蛋白Rep表達框為序列表中序列4自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述Kan抗性基因表達框為序列表中序列4自5』末端第2448-3694位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第4120-5366位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第4351-5597位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序 列3自5』末端第3877-5123位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；其蛋白的表達與質粒5』-3』順序相反；所述T-DNA超驅動區為序列表中序列4自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述T-DNA左邊界為序列表中序列4自5』末端第2423-2447位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第4095-4119位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第4326-4350位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第3852-3876位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述T-DNA右邊界為序列表中序列4自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列I自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述MluI限制性內酶切位點的核苷酸序列為序列表中序列4自5』末端第2417-2422位核苷酸；也為序列表中序列I自5』末端第2417-2422位和4089-4094位核苷酸；序列表中序列2自5』末端第2417-2422位和4320-4325位核苷酸；序列表中序列3自5』末端第2417-2422位和3846-3851位核苷酸。4、pYBA雙元載體骨架的鑑定研究I)驗證pYBA雙元載體拷貝數的高低載體pBBBast為pBBRlMCS-2派生質粒，使用的是廣譜複製原點。雖然其可以穿梭於大腸桿菌和農桿菌，但其在大腸桿菌中為低拷貝，不太便於基因工程操。在新載體的構建中，為了獲得在大腸桿菌中高拷貝的質粒，選用了 PUC19的ColEl複製原點，保障了構建的新載體在大腸桿菌中高的拷貝數；而來源於pBBBast的ori-Rep基因片段則保障了新載體可以在農桿菌中自我複製。將上述3 得到的 pYBA 雙兀載體與質粒 pBBBasta、pGreen0029、pUC19、pBluescriptIIKS (+)分別轉入大腸桿菌DH5 a中，且在菌液濃度均約為0D_=2. 0時，分別提取3ml菌液的質粒DNA，溶於30 ill ddH20中，各取4 ill單酶切，粗略估測質粒濃度。結果如圖2 所不，1-6 號泳道分別為 Ikb plus DNA Ladder、pBBBasta 6559bp、pGreen00294632bp、pYBA 3694bp、pUC19 2686bp、pBluescript II KS (+) 2961bp ;2 和 3為EcoRI酶切，4-6為HindIII酶切，可以看出，相同條件下pYBA與高拷貝質粒pUC 19，pBluescript IIKS(+)和pGreen0029濃度基本相當，明顯高於低拷貝質粒pBBBasta。2) Kan基因的T546突變為G546對pYBA抗性的影響通過上述測序結果可以看出Kan抗性基因表達框中的G546 (位於序列4的第2883位核苷酸)為突變。在定點突變去除PstI位點時，無意中將Kan基因的T546突變為G546 (序列4自5』末端方向的A2883 — C2883)，這個突變致使胺基酸由天冬氨酸變為穀氨酸(圖I中Kan基因標*位置)。為了檢驗該位點的突變是否會引起抗性發生變化，進行如下實驗將序列4的第2883位核苷酸未突變質粒，轉入大腸桿菌DH5 a中，得到轉化未突變質粒的大腸桿菌DH5 a。將上述I)得到的轉化了 pYBA的大腸桿菌DH5a和轉化未突變質粒的大腸桿菌DH5a，用50mg/L-5000mg/L不同梯度的卡那黴素篩選濃度進行了鑑定(50 1000mg/L以每50mg為一梯度；1000 5000mg/L以每IOOOmg為一梯度)，結果顯不50 1000mg/L濃度下Kan突變前後抗性無差別，菌株均可生長。當卡那黴素濃度增加到2000mg/L時，只有含突變質粒的菌株可以生長，而含未突變質粒的菌株則不能生長。3000mg/L以上濃度菌株均不能生長。可以看出該Kan546位點突變，使突變質粒抗性增強。基於以上結果，保留該突變質粒骨架pYBA，用於後續載體構建，並在構建T-DNA植物篩選標記表達框時以該Kan546突變基因為模板進行植物篩選標記表達框構建。二、雙元載體pYBAlOO的構建I、含有篩選標記基因表達框的DNA片段的組件獲得I)兩串聯同向的LoxP-FRT片段的獲得
在T-DNA區段植物篩選標記基因表達框兩側，設計預留重組酶Cre和Flp識別位點LoxP和FRT組成的LoxP-FRT融合位點，方便在獲得轉基因植物後能將標記基因刪除。因LoxP和FRT位點均為由34bp組成的發卡互補序列，融合位點LoxP-FRT的發卡結構十分嚴重。構建含兩串聯同向的LoxP-FRT片段由上海捷瑞公司人工合成，其核苷酸序列為
5 』 -ccgacgcgtcacgtGAAGTTCCTA11c|<TT1'CTAGA<|iaATA(；GAACTTCri taac t icgta tik<gcatacat<\ IaIacgaagttati
ggcgcgccattaataggcctcgtacg GM(;TTCCI'ATAC|<11TCTAGA<|GAATAGGMa'TC/ taac11cgta u\(gca taca t<\ la tacgaagt ta t accggtttaaacgcgtcgg-3，。下劃線部分為限制性內切酶位點，依次為MluI-PlmI，Ascl-AseI-StuI-BsiffI,AgeI-PmeI-DraI-MluI ;大寫字母部分為FRT位點，小寫斜體部分為LoxP位點，方框部分依次為FRT和LoxP位點決定方向的8bp核心序列，序列中的箭頭指向為核心序列方向。2)新多克隆酶切識別位點new MCS片段的獲得多克隆位點的構建是基於pBluescript II KS(+)載體的MCS,通過設計引物MCS5』和MCS3』在原有MCS上增加了 AgeI-MfeI和PmeI-DraI-NruI五個酶切位點，具體如下以pBluescript II KS (+)載體為模板，用引物MCS5』和MCS3』經PCR擴增獲得154bp newMCS片段，經測序，為序列表中序列I或序列2或序列3的自5』末端第2421-2563位核苷酸，new MCS片段中的多克隆位點自5』末端至3』末端具體為依次為DraI識別位點、PmeI識別位點、NruI識別位點、KpnI位點或Acc651識別位點、ApaI位點或PspOMI識別位點、Eco0109I識別位點、XhoI識別位點、PspXI識別位點、SalI識別位點、ClaI識別位點、HindIII識別位點、EcoRV識別位點、EcoRI識別位點、PstI識別位點、SmaI位點或XmaI的識別位點、BamHI識別位點、SpeI識別位點、NotI識別位點、AleI識別位點、SacI識別位點、MfeI識別位點、AgeI識別位點；共22種內切識別序列。3)植物篩選標記基因表達框的獲得 參考GenBank: AF485783. I的Nos啟動子和終止子序列。以PBI121質粒為模板，用引物NosP5』(下劃線部分為AscI位點)和NosP3』進行擴增，得到337bp的Nos-P片段，為序列表中序列I自5，末端第3681-4016位核苷酸；
以PBI121質粒為模板，用引物NosT5』和NosT3』(下劃線部分為AseI位點)進行擴增，得到285bp的Nos-T片段，為序列表中序列I自5』末端第2644-2926位核苷酸；以上述一得到的pYBA骨架(骨架的kan抗性基因表達框也是nptll基因，只是啟動子和終止子不同)為模板，用引物NptII5』和NptII3』擴增獲得833bp的NptII片段，為序列表中序列I自5』末端第2886-3718位核苷酸。引物NosP3』和NptII5』、NptII3』和NosT5，分別為部分反向互補序列。所有PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，去除多餘引物。然後以Nos-P、NptII和Nos-T三個片段為模板，用引物NosP5』和NosT3』進行融合PCR，得到1376bp篩選標記基因NptII表達框的片段，為序列表中序列I自5』末端第2644-4016位核苷酸。上述融合PCR 反應體系如下5x FastPfu Buffer 4 u 1,2. 5mM dNTPs 2u I,FastPfu DNAPolymerase 0. 4 U I, Nos-P 0. 2 U I, NptII 0. 2 U I, Nos-T 0. 2 U I 補水至19. 6 u I。循環反應為95V2min, (95。。20s，54。。20s, 72°C lmin) x48,72°C 5min ;前 12 個循環不加引物，在第13個循環時加入引物NosP5』 0. 6iil，NosT3』 0.6u I02、雙元載體pYBAlOO的構建I)含有兩串聯同向的LoxP-FRT片段的中間載體用MluI分別酶切上述I得到的含有兩串聯同向的LoxP-FRT片段和上述一得到的pYBA骨架，連接得到獲得中間載體pYBA-LF ;經過測序該質粒為將含有兩串聯同向的LoxP-FRT片段插入pYBA的MluI酶切位點間，為含有兩串聯同向的LoxP-FRT片段的中間載體。2)含有兩串聯同向的LoxP-FRT片段和new MCS片段的中間載體用DraI和AgeI分別酶切上述I得到的多克隆位點new MCS片段和上述I)得到的中間載體pYBA-LF，連接酶切產物，得到中間載體pYBA-LFM ;經過測序該質粒為將new MCS片段(序列表中序列I自5』末端第2421-2563位核苷酸)插入pYBA-LF的DraI和AgeI酶切位點間，得到含有兩串聯同向的LoxP-FRT片段和new MCS片段的中間載體pYBA-LFM。3)植物篩選標記基因表達框的添加用AseI和AscI分別酶切上述I得到的含有篩選標記基因NptII表達框的片段和上述2)得到的中間載體pYBA-LFM，連接酶切產物，連接產物轉入DH5 a，得到轉化子。將轉化子的質粒進行MluI酶切驗證，得到3694bp載體骨架和1672bp片段的為陽性質粒。將上述陽性質粒送去測序，結果為該質粒為將序列表中的序列I自5』末端第2417-4094位核苷酸插入pYBA的MluI限制性內酶間得到的載體，命名為pYBAlOO，該質粒的核苷酸序列為序列表中的序列1，大小為5366bp。結構示意圖如圖3所示。序列表中的序列I自5』末端第2417-4094位核苷酸表示片段自5』末端至3』末端依次包括多克隆酶切識別位點、右側LoxP-FRT融合位點、BsiWI、StuI和AseI識別序列組、NPtII基因表達框、AscI酶切識別序列、左側LoxP-FRT融合位點和PmlI酶切識別序列。所述多克隆酶切識別位點為22個內切酶識別位點，自5』末端至3』末端具體依次為DraI識別位點、PmeI識別位點、NruI識別位點、識別位點甲、識別位點乙、Eco0109I識別位點、XhoI識別位點、PspXI識別位點、Sal I識別位點、ClaI識別位點、Hindi 11識別位點、EcoRV識別位點、EcoRI識別位點、PstI識別位點、識別位點丙、BamHI識別位點、SpeI識別位點、NotI識別位點、AleI識別位點、SacI識別位點、MfeI識別位點、AgeI識別位點；所述識別位點甲為KpnI位點或Acc65I識別位點；所述識別位點乙為ApaI位點或PspOMI識別位點；所述識別位點丙為SmaI位點或XmaI的識別位點；所述PmlI酶切識別序列為序列表中序列I自5』末端第4083-4088位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述AscI酶切識別序列為序列表中序列I自5』末端第4008-4015位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述BsiWI、StuI和AseI識別序列組為序列表中序列I自5』末端第2632-2649位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述多克隆酶切識別序列為序列表中序列I自5』末端第2421-2563位核苷酸所 示的雙鏈DNA片段；所述左側LoxP-FRT融合位點為序列表中序列I自5』末端第4016-4083位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述右側LoxP-FRT融合位點為序列表中序列I自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述NptII基因表達框為序列表中序列I自5』末端第2650-4007位核苷酸所示的雙鏈DNA片段。三、pYBA200雙元載體構建pCAMBIA1300載體的抗性基因Hyg中含AgeI酶切位點。為了消除該位點對新載體後期MCS的影響，採用同前述PstI定點突變的辦法將該位點去除。突變原則是選用單雙子葉植物偏好兼併密碼子，在不改變胺基酸序列的情況下，改變Hyg基因的342核酸序列(g — a)。I)以上述pCAMBIA1300載體為模板，利用突變引物AgeI5』和AgeI3』進行PCR擴增，得到8958bp的突變產物。突變弓丨物Age15 』和Age13 』下劃線部分為原AgeI位點，小寫字母為突變後的鹼基。上述PCR為20iil反應體系，載體加入量約為150ng ;反應條件為95°C 2min，(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循環，72°C 5min。將上述PCR產物用DpnI消化後轉入DH5 a，得到轉化子。pCAMBIA1300含2個AgeI酶切位點。提取轉化子的質粒，經AgeI酶切，只得到8958bp單一條帶的為陽性質粒，即得到pCAMBIA1300突變質粒，經過測序，該質粒的抗性基因Hyg中不含AgeI酶切位點，在不改變胺基酸序列的情況下，改變Hyg基因的342核酸序列(g — a)。2) Hyg植物篩選標記基因表達框的獲得方法和過程同NosP-NptII-NosT表達框。以pBI121質粒為模板，用引物NosP5』(下劃線部分為AscI位點)和Hyg-NosP3』進行擴增，得到338bp的Nos-Pllyg片段，為序列2自5』末端第3912-4246位核苷酸；以PBI121質粒為模板，用引物Hyg-NosT5』和NosT3』(下劃線部分為AseI位點)進行擴增，得到284bp的Nos-Tllyg片段，為序列2自5』末端第2644-2925位核苷酸；以上述I)得到的pCAMBIA1300突變質粒為模板，用引物Hyg5』和Hyg3』擴增獲得1067bp的Hyg片段，為序列2自5』末端第2886-3952位核苷酸。引物Hyg_NosP3』和Hyg5』、Hyg3』和Hyg-NosT5』分別為部分反向互補序列。所有PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，去除多餘引物。然後以Nos-PHyg、Hyg和Nos-Tllyg三個片段為模板，用引物NosP5』和NosT3』進行融合PCR，得到1607bp篩選標記基因Hyg表達框，為序列2自5』末端第2644-4246位核苷酸。
上述融合PCR 反應體系如下5x FastPfu Buffer 4 u 1,2. 5mM dNTPs 2u I,FastPfu DNAPolymerase 0. 4 U I, Nos-P 0. 2 U I, NptII 0. 2 U I, Nos-T 0. 2 U I 補水至19. 6 u I。循環反應為95°C2min, (95°C 20s,54°C 20s, 72°C lmin) x48,72°C 5min ;前 12 個循環不加引物，在第13個循環時加入引物NosP5』 0. 6iil，NosT3』 0.6u I03)植物篩選標記Hyg基因表達框的添加用AseI和AscI分別酶切上述2)得到的篩選標記基因表達框和上述2的2)中得到的中間載體pYBA-LFM，連接酶切產物，連接產物轉入DH5 a，得到轉化子。將轉化子的質粒進行MluI酶切驗證，得到3694bp載體骨架和1903bp片段為陽性質粒。將上述陽性質粒送去測序，結果為該質粒為將序列2的自5』末端第2417-4325位核苷酸插入PYBA的MluI限制性內酶間得到的載體，命名為PYBA200，該質粒的核苷酸序列為序列表中的序列2，大小為5597bp，結構示意圖如圖4所示。序列表中的序列2自5』末端第2417-4325位核苷酸表示片段自5』末端至3』末端依次包括多克隆酶切識別位點、右側LoxP-FRT融合位點、BsiWI、StuI和AseI識別序列組、Hyg基因表達框、AscI酶切識別序列、左側LoxP-FRT融合位點和PmlI酶切識別序列。所述PmlI酶切識別位點為序列表中的序列2自5』末端第4314-4319位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述AscI酶切識別位點為序列表中的序列2自5』末端第4239-4246位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述BsiWI、StuI和AseI識別序列組為序列表中的序列2自5』末端第2632-2649位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述多克隆酶切識別位點為序列表中的序列2自5』末端第2421-2563位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述左側LoxP-FRT融合位點為序列表中的序列2自5』末端第4247-4314位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述右側LoxP-FRT融合位點為序列表中的序列2自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述Hyg基因表達框為序列表中序列2自5』末端第2650-4238位核苷酸所不的雙鏈DNA片段。三、pYBA300雙元載體的構建
pBBBasta載體的抗性基因Bar中含KpnI、SalI和ApaI酶切位點。為了消除這3個位點對新載體後期MCS的影響，採用同PstI定點突變的辦法將該位點去除。突變原則是選用單雙子葉植物偏好兼併密碼子，在不改變胺基酸序列的情況下，改變Bar基因第516位核酸序列KpnI (a — t，即序列3中第2942位核酸t — a)、第267位核酸Sail (g — t，即序列3中第3191位核酸c — a)、第222位核酸ApaI (g — t，即序列3中第3236位核酸c — a)0I)以上述pBBBasta載體為模板，利用突變引物KpnI5』和KpnI3』進行PCR擴增，得到6558bp的突變產物。突變引物KpnI5』和KpnI3』下劃線部分為原KpnI位點，小寫字母為突變後的鹼基。上述PCR為20iil反應體系，載體加入量約為150ng ;反應條件為95°C 2min,(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循環，72°C 5min。
將上述PCR產物用DpnI消化後轉入DH5 a，得到轉化子。提取轉化子的質粒，經EcoRI和KpnI雙酶切，只得到6558bp —條帶的為陽性中間質粒I。2)以上述I)得到的中間質粒為模板，利用突變引物Sal 15』和Sal 13』進行PCR擴增，得到6558bp的突變產物。突變引物Sal 15 』和Sal 13 』下劃線部分為原Sal I位點，小寫字母為突變後的鹼基。上述PCR為20iil反應體系，載體加入量約為150ng ;反應條件為95°C 2min,(95°C 20s, 66°C 20s, 72°C 5min) xl8 循環，72°C 5min。將上述PCR產物用DpnI消化後轉入DH5 a，得到轉化子。提取轉化子的質粒，經EcoRI和SalI雙酶切，只得到6558bp —條帶的為陽性中間質粒2。3)以上述2)得到的陽性中間質粒2為模板，利用突變引物ApaI5』和ApaI3』進行PCR擴增，得到6558bp的突變產物。突變弓丨物ApaI5 』和ApaI3 』下劃線部分為原ApaI位點，小寫字母為突變後的鹼基。上述PCR為20iil反應體系，載體加入量約為150ng ;反應條件為95°C 2min，(95°C 20s, 62°C 20s, 72°C 5min) xl8 循環，72°C 5min。將上述PCR產物用DpnI消化後轉入DH5 a，得到轉化子。提取轉化子的質粒，經EcoRI和ApaI雙酶切，只得到6558bp —條帶的為陽性質粒即為pBBBasta突變質粒。4) Bar植物篩選標記基因表達框的獲得方法和過程同NosP-NptII-NosT表達框。以pBI121質粒為模板，用引物NosP5』(下劃線部分為AscI位點)和Bar_NosP3』進行擴增，得到335bp的Nos-Pto片段，為序列表中序列3自5』末端第3440-3773位核苷酸；以pBI121質粒為模板，用引物Bar_NosT5』和NosT3』(下劃線部分為AseI位點)進行擴增，得到286bp的Nos-Tto片段，為序列表中序列3自5』末端第2644-2925位核苷酸；以上述3)得到的pBBBasta突變質粒為模板，用引物Bar5』和Bar3』擴增獲得600bp的Bar片段，為序列表中序列3自5』末端第2885-3478位核苷酸。引物Bar_NosP3』和Bar5』、Bar3』和Bar_NosT5』分別為部分反向互補序列。所有PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，去除多餘引物。然後以Nos-PBar、Bar和Nos-Tto三個片段為模板，用引物NosP5』和NosT3』進行融合PCR，得到1133bp篩選標記基因Bar表達框，為序列表中序列3自5』末端第2644-3773位核苷酸。上述融合PCR 反應體系如下5x FastPfu Buffer 4 u 1,2. 5mM dNTPs 2u I,FastPfu DNAPolymerase 0. 4 U I, Nos-P 0. 2 U I, NptII 0. 2 U I, Nos-T 0. 2 U I 補水至19. 6 u I。循環反應為95V2min, (95。。20s，54。。20s, 72°C lmin) x48,72°C 5min ;前 12 個循環不加引物，在第13個循環時加入引物NosP5』 0. 6iil，NosT3』 0.6u I05) pYBA植物篩選標記Bar基因表達框的添加用AseI和AscI分別酶切上述4)得到的篩選標記基因表達框和上述2的2)得到的中間載體pYBA-LFM，連接酶切產物，連接產物轉入DH5 a，得到轉化子。將轉化子的質粒進行MluI酶切驗證，得到3694bp載體骨架和1429bp片段的為陽性質粒。將上述陽性質粒送去測序，結果為該質粒為將序列3的自5』末端第2417-3851位核苷酸插入PYBA的MluI限制性內酶間得到的載體，命名為PYBA300，該質粒的核苷酸序列為序列表中的序列3，大小為5123bp，結構示意圖如圖5所示。序列表中的序列3自5』末端第2417-3851位核苷酸表示片段自5』末端至3』末端依次包括多克隆酶切識別位點、右側LoxP-FRT融合位點、BsiWI、StuI和AseI識別序列組、Bar基因表達框、AscI酶切識別序列、左側LoxP-FRT融合位點和PmlI酶切識別序列。所述PmlI酶切識別位點為序列表中的序列3自5』末端第3840-3845位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述AscI酶切識別位點為序列表中的序列3自5』末端第3765-3772位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述BsiWI、StuI和AseI識別序列組為序列表中的序列3自5』末端第2632-2649位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述多克隆酶切識別位點為序列表中的序列3自5』末端第2421-2563位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述左側LoxP-FRT融合位點為序列表中的序列3自5』末端第3773-3840位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述右側LoxP-FRT融合位點為序列表中的序列3自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；所述Bar基因表達框為序列表中序列3自5』末端第2650-3764位核苷酸所不的 雙鏈DNA片段。實施例2、pYBAlOO、pYBA200、pYBA300 雙元載體的應用I、擬南芥的轉化與鑑定利用電擊法將由實施例I得到的pYBAlOO、pYBA200、pYBA300載體分別轉入根癌農桿菌 GV3101:pMP90 菌株，分別得至Ij GV3101:pMP90/pYBA100、GV3101 :pMP90/pYBA200、GV3101:pMP90/pYBA300oI) GV3101 :pMP90/pYBAlOO進行花序浸潰法侵染32棵野生型擬南芥，為TO代。將32株TO代收穫的轉基因擬南芥種子經消毒後，播於含100mg/L Kan的Hoagland/2固體培養基，放到條件為25°C，光周期為16h (光)/8h (暗)的培養室，約2周後挑選56株存活Tl代轉基因擬南芥綠苗移栽人工氣候室。隨機挑選36株Tl代轉基因擬南芥，提取幼苗葉片的基因組DNA，以引物NosP5』和MCS3』進行PCR擴增檢測，以pYBAlOO質粒為陽性對照，以野生型擬南芥為陰性對照，結果如圖6所示，I:陰性對照(野生型擬南芥)；2: Ikb plus DNA Ladder ；3:陽性對照pYBAlOO質粒；4-12:Tl代轉基因擬南芥，結果為得到1.6kb的片段為陽性植株，共得 到31株PCR檢測為陽性Tl代轉基因擬南芥苗；1. 6kb的PCR產物經測序，確認插入的T-DNA區段為從Nos-Pro至MCS片段，I. 6kb的PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中序列I自5』末端第2421-4016位核苷酸，說明T-DNA區段已經整合到植物基因組中。2)按照上述I)的方法將GV3101:pMP90/pYBA200進行轉入20棵野生型擬南芥，得到為TO代。將20株TO代收穫的轉基因擬南芥種子經消毒後，播於含25mg/L Hgromycin的Hoagland/2固體培養基，放到條件為25°C，光周期為16h (光)/8h (暗)的培養室，約2周後挑選9株存活Tl代轉基因擬南芥綠苗移栽人工氣候室。以上述9株Tl代轉基因擬南芥，提取幼苗葉片的基因組DNA，以引物NosP5』和MCS3』進行PCR擴增檢測，以野生型擬南芥為陰性對照，結果如圖7所示，I:陰性對照(野生型擬南芥)；2:lkb plus DNA Ladder ；3-ll:Tl代轉基因擬南芥，結果為得到約I. 8kb的片段為陽性植株，共得到8株PCR檢測為陽性Tl代轉基因擬南芥苗；1. 8kb的PCR產物經測序，確認插入的T-DNA區段為從Nos-Pro至MCS片段，I. 8kb的PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中序列2自5』末端第2421-4247位核苷酸，說明T-DNA區段已經整合到植物基因組中。3)按照上述I)的方法將GV3101:pMP90/pYBA300進行轉入64棵野生型擬南芥，得到為TO代。將64株TO代收穫的轉基因擬南芥種子播種人工氣候室，條件為21°C，光周期為16h (光)/8h (Hf),約I周后噴灑0. 2%Basta除草劑，共有463株存活Tl代轉基因擬南芥綠苗。隨機挑選10株Tl代轉基因擬南芥，提取幼苗葉片的基因組DNA，以引物NosP5』和MCS3』進行PCR擴增檢測，以野生型擬南芥為陰性對照，結果如圖8所示，I:陰性對照(野生型擬南芥);2:lkb plus DNA Ladder ；3-12:Tl代轉基因擬南芥，結果為得到I. 35kb的片段為陽性植株，共得到9株PCR檢測為陽性Tl代轉基因擬南芥苗；1. 35kb的PCR產物經測序，確認插入的T-DNA區段為從Nos-Pro至MCS片段，I. 35kb的PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中序列3自5』末端第2421-3773位核苷酸，說明T-DNA區段已經整合到植物基因組中。從上述的實驗結果可以看出最初構建新雙元載體的目標，是獲得儘可能小的、高拷貝數、MCS位點多、方便基因工程操作、後期能將植物選擇標記基因刪除的載體；新構建的載體PYBA系列載體由於使用了大腸桿菌複製原點ColEl和農桿菌複製起始原點R印-ori，可在大腸桿菌和農桿菌中複製，且具有較高的複製能力，方便了基因工程操作。構建pYBA系列載體時考慮到要儘量使載體最小化，且使將來獲得的轉基因植物更加「乾淨」，儘量將一切非必需的元件去除，包括LacZ系統及用於測序的一些通用引物結合位點。pYBA系列與pGreen系列一樣使用了著名克隆載體pBluescript II的多克隆位點，並通過合成添加了一些新的單酶切位點。PYBA系列載體的MCS含22個單酶切位點，這將能滿足絕大部分的基因工程操作的需要。本發明在構建pYBA系列載體時，在除22個MCS位點外，在兩同向LoxP-FRT位點內側另預留了 3個單酶切位點AseI-StuI-BsiWI，用於將來方便插入誘導系統和重組酶系統。PYBA系列的融合LoxP-FRT位點，可以被重組酶Cre或FLP的識別。轉基因植物獲得後，既可以通過誘導重組酶表達，也可通過共轉化或雜交引入重組酶，將兩同向LoxP-FRT位點內所有序列刪除。 重組酶FLP和Cre的識別位點FRT和LoxP的核心序列均為34bp。位點中間為8bp 的核心間隔區，其決定了識別位點的方向，兩側均為13bp的反向互補序列。通常利用FLP/FRT重組系統實驗中所用到的FRT位點在34bp核心序列的5』前端還含有一段14bp的第三組重複序列，組成一個長為48bp含三組重複的序列。雖然FLP識別並結合全部3個重複序列，然而這個14bp的第三組重複序列在重組切割過程中為非必需的部分。為了方便合成LoxP-FRT位點，且能最小化新構建的載體，因此本實驗構建的LoxP-FRT位點不包含非必需的第三組重複序列及4bp的間隔序列部分，位點為LoxP — FRT方向串聯。農桿菌介導的植物轉化中，當T-DNA與植物基因組整合時，RB先於LB進入植物細胞。植物篩選標記基因位於LB端，可防止因目的基因在整合過程中丟失所造成的假陽性植株，便於目的基因插入的篩選。然而早期構建的一些雙元載體許多都忽略了這一點，將篩選標記基因置於了 RB端(如pBI121和pBIN19)。考慮到植物篩選標記基因在T-DNA內位置的重要性，本實驗構建的PYBA系列雙元表達載體的植物篩選標記基因置於LB端，減少了獲得假陽性植株的機率。小體積的高拷貝大腸桿菌質粒通常還用於非農桿菌介導的植物細胞或原生質體轉化；如基因槍、電擊、PEG轉化等。pYBA系列體積小、拷貝數高，MCS位點多，亦可勝任這項工作。此外，在LB-RB內側兩邊留有MluI、RmlI酶切位點，結合MCS位點可以將除LB和RB以外的T-DNA區段整體切除下來，以線性DNA方式用於基因槍等單子葉植物的安全遺傳轉化。因此，pYBA系列載體能於大腸桿菌和農桿菌中複製，並能成功轉化擬南芥。pYBA雙元表達載體的骨架和T-DNA區段均符合農桿菌介導的植物轉基因要求。在pYBA的基礎上，將陸續開發一系列用於不同目的新植物表達雙元載體。實施例3、pYBAlOO、pYBA200、pYBA300雙元載體中的篩選標記基因表達框刪除驗證為了檢測重組酶位點能否準確將植物篩選標記基因表達框刪除，設計了體外刪除實驗。分別取0. 5 ii g由實施例2得到的pYBA100、pYBA200、pYBA300質粒DNA，與I yl Cre重組酶IOx Cre Buffer 混合，水補足至 30 y I。37 °C 60min,70°C 5min。取 5 y I 重組產物轉化大腸桿菌。隨機抽取了 12個克隆提取質粒DNA，用EcoRI酶，1%瓊脂糖電泳驗證。結果如圖9所示，pYBAlOO的12個克隆中有2個(5和13泳道)經Cre重組後，剔除了目的片段(I. 45kb)，質粒縮小為3. Qlkb0結果如圖10所示，pYBA200的12個克隆中有I個(第3泳道)經Cre重組後，剔除了目的片段(I. 68kb)，質粒縮小為3. Qlkb0結果如圖11所示，pYBA300的12個克隆中有5個(4、5、6、7和9泳道)經Cre重組後，剔除了目的片段(I. 20kb)，質粒縮小為3. 91kb。用引物MCS3』分別對縮小的質粒測序。測序結果證明兩同向LoxP-FRT位點內所有序列刪除。結果證明載體pYBA系列載體能經Cre重組酶重組，刪除兩個同向LoxP-FRT位點間植物篩選標記基因表達框。
權利要求
1.一種載體，為環狀雙鏈DNA分子，自5』末端至3』末端依次包括大腸桿菌複製起始原點ColEl、農桿菌複製起始原點R印-ori、調節蛋白R印表達框、T-DNA超驅動區、T-DNA右邊界、T-DNA左邊界和Kan抗性基因表達框。
2.根據權利要求I所述的載體，其特徵在於 所述大腸桿菌複製起始原點ColEl為序列表中序列4自5』末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述農桿菌複製起始原點Rep-ori為序列表中序列4自5』末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述調節蛋白Rep表達框為序列表中序列4自5』末端第1386-2367位核苷酸所示的雙鏈DNA片段。
所述Kan抗性基因表達框為序列表中序列4自5』末端第2448-3694位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述T-DNA超驅動區為序列表中序列4自5』末端第2368-2391位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述T-DNA左邊界為序列表中序列4自5』末端第2423-2477位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述T-DNA右邊界為序列表中序列4自5』末端第2392-2416位核苷酸所示的雙鏈DNA片段。
3.根據權利要求I或2所述的載體，其特徵在於 在所述T-DNA右邊界和所述T-DNA左邊界之間還包括內酶切識別位點I ; 所述內酶切識別位點I具體為MluI的識別位點。
4.根據權利要求1-3中任一所述的載體，其特徵在於 所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列4。
5.根據權利要求1-3中任一所述的載體,其特徵在於 在所述T-DNA右邊界和所述T-DNA左邊界之間還包括含有植物篩選標記基因表達框的片段， 所述含有植物篩選標記基因表達框的片段自5』末端至3』末端依次包括多克隆酶切識別位點、右側LoxP-FRT融合位點、植物篩選標記基因表達框和左側LoxP-FRT融合位點。
6.根據權利要求5所述的載體，其特徵在於 所述多克隆酶切識別位點為22個內切酶識別位點，所述22個內切酶識別位點自5』末端至3』末端具體依次為DraI識別位點、PmeI識別位點、NruI識別位點、識別位點甲、識別位點乙、Eco0109I識別位點、XhoI識別位點、PspXI識別位點、SalI識別位點、ClaI識別位點、HindIII識別位點、EcoRV識別位點、EcoRI識別位點、PstI識別位點、識別位點丙、BamHI識別位點、SpeI識別位點、NotI識別位點、AleI識別位點、SacI識別位點、MfeI識別位點、AgeI識別位點； 所述識別位點甲為KpnI位點或Acc651識別位點； 所述識別位點乙為ApaI位點或PspOMI識別位點； 所述識別位點丙為SmaI位點或XmaI的識別位點； 所述植物篩選標記基因表達框為NotII基因表達框、Hyg基因表達框或Bar基因表達框。
7.根據權利要求5或6所述的載體，其特徵在於 所述左側LoxP-FRT融合位點為序列表中序列I自5』末端第4016-4083位核苷酸所示的雙鏈DNA片段或序列2的自5』末端第4247-4314位所示的雙鏈DNA片段或序列3的自5』末端第3773-3840位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述右側LoxP-FRT融合位點為序列表中序列I自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段或序列2的自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段或序列3的自5』末端第2564-2631位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述NptII基因表達框為序列表中序列I自5』末端第2650-4007位核苷酸所示的雙鏈DNA片段； 所述Hyg基因表達框為序列表中序列2自5』末端第2650-4238位所示的雙鏈DNA片段； 所述Bar基因表達框為序列表中序列3自5』末端第2650-3764位所示的雙鏈DNA片段。
8.根據權利要求5-7中任一所述的載體,其特徵在於 在所述左側LoxP-FRT融合位點和所述T-DNA左邊界之間還包括內切酶識別位點2 ;所述內切酶識別位點2具體為PmlI識別位點； 在所述左側LoxP-FRT融合位點和所述篩選標記基因表達框之間還包括內切酶識別位點3 ;所述內切酶識別位點3具體為AscI識別位點； 在所述植物篩選標記基因表達框和所述右側LoxP-FRT融合位點之間還包括由多個內切酶識別位點組成內切酶識別位點組；所述內切酶識別位點組自5』末端至3』末端具體依次為BsiWI識別序列、StuI識別序列和AseI識別序列。
9.根據權利要求5-8中任一所述的載體,其特徵在於 所述載體為如下I)或2)或3): 1)所述載體中植物篩選標記基因為NptII基因，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 2)所述載體中植物篩選標記基因為Hyg基因，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列2 ； 3)所述載體中植物篩選標記基因為Bar基因，所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列3。
10.權利要求1-9任一所述的載體在培育轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種含LoxP-FRT重組酶位點的植物雙元表達載體。本發明提供了載體，為環狀雙鏈DNA分子，自5』末端至3』末端依次包括大腸桿菌複製起始原點ColEl、農桿菌複製起始原點Rep-ori、調節蛋白Rep表達框、T-DNA超驅動區、T-DNA右邊界、T-DNA左邊界和Kan抗性基因表達框。本發明的實驗證明，本發明構建了植物表達雙元載體pYBA100、pYBA200和pYBA300，其載體較小且在T-DNA區獲得大量的MCS位點，離體刪除實驗結果證明，載體pYBA系列能經Cre重組酶刪除植物標記基因表達框，可以滿足用於安全生產轉基因植物的需要。
文檔編號A01H5/00GK102676579SQ20121013520
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者姚磊, 王慧, 閆曉紅, 馬榮才 申請人:北京農業生物技術研究中心