玉米愈傷組織特異性啟動子及其克隆方法與應用的製作方法

2023-05-10 11:14:06 2

專利名稱：玉米愈傷組織特異性啟動子及其克隆方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物啟動子、其克隆方法及其應用，特別是涉及一種玉米愈傷組織特 異性啟動子、其克隆方法及其在培育安全性轉基因植物中的應用。
背景技術：
篩選標記基因在植物基因工程中具有重要作用，利用篩選標記基因可以在植物轉 基因過程中從大量未轉化的細胞中篩選出轉化細胞。然而，轉基因植物中的篩選基因又引 起了人們對一系列生物安全方面的擔心，如選擇標記基因是否編碼有毒的物質和過敏源， 是否不利於植物代謝的改變，是否會降低治療性藥物的療效，以及是否會在相近的物種和 病原體間遷移等。如何從轉基因植物中剔除篩選標記基因已經成為人們關心的問題。目前， 主要有兩種具有潛在的應用價值的剔除篩選標記基因的技術一種是目的基因和篩選標記 基因共轉化技術，它可以使目的基因和篩選標記基因通過基因自由分離的原則在後代中剔 除篩選標記基因而保留目的基因；另一種是通過位點特異性重組來剪除篩選標記基因的技 術；此外，還有轉座子介導的篩選標記基因剔除技術和同源重組介導的篩選標記基因剔除 技術等。但上述從基因水平上剔除篩選標記基因具有繁瑣複雜，轉化周期長的缺點。

發明內容
本發明提供了一種在玉米愈傷組織中特異性表達的啟動子。本發明所提供的玉 米愈傷組織特異性啟動子，名稱為ZMW，來源於玉米屬玉米(Zea mays L.)。該啟動子大小 2880bp。本發明所涉及的設計方案為，一種玉米愈傷組織特異性啟動子，通過生物信息學 的方法初步確定，在玉米B73自交系中擴增該啟動子，通過在水稻中驗證在愈傷中特異性 表達的啟動子，具有序列表中1下的序列。一種上述玉米愈傷組織特異性啟動子的克隆方法，利用生物信息學篩選候選基 因，然後與基因組序列進行比對分析，設計引物，上遊引物5』_ CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G _3，，下遊引物5，- GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A -3』擴增該基因上遊5』區域DNA序列，然後與GUS基因連接，通過轉基因水稻驗證啟動子功 能。根據上述玉米愈傷組織特異性啟動子在植物愈傷組織基因功能研究和基因表達 調控中的應用。本發明提供的一個玉米愈傷組織特異性啟動子ZMW在水稻的愈傷組織中特異表 達，能指導外源基因在植物發育過程中特定時空的表達，用該方法篩選轉基因水稻具有階 段性強、靈敏度高的優點，而且由於篩選基因只會在愈傷階段表達，在其他時期不會表達， 它不僅能使目的基因的表達產物在一定空間積累，增加區域表達量，而且也避免了植物營 養的不必要浪費，具有較大的實際應用價值。


圖1為轉基因植株的⑶S染色結果(該啟動子特異性的在愈傷組織中呈藍色)。A為愈傷；B為根；C為葉；D為花粉；E為莖；F為穎殼；G為未成熟的種子；H為成 熟的種子；I為子房。染色結果顯示⑶S基因在愈傷中特異性表達，其他部位均不表達，A圖中的藍色部 分即為染上部位。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物均由上海捷瑞生物 工程有限公司合成，測序由hvitrogen公司進行，PCR試劑盒、連接試劑盒和載體構建過程 中的核酸內切酶均購自於自寶生物工程有限公司，質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購於 全式金生物技術有限公司，方法均參照試劑盒說明書進行。一、玉米愈傷組織特異性表達的基因wrky的獲得
首先在NCBI網站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中以關鍵詞「wrky」搜索基因，獲 得擬南芥wrky基因的蛋白序列。建立玉米蛋白本地資料庫，使用「DNAT00LS 6.0」軟體對 獲得的擬南芥wrky基因的蛋白序列進行BlaStP(E-value=0. 001)序列比對，篩選出同源性 最高的玉米候選蛋白序列。接著使用「DNAT00LS 6.0」軟體對獲得的玉米全基因組DNA序 列數據建立本地資料庫，以獲得的玉米蛋白序列進行BlastN (E-value=0. 001)序列比對， 篩選出同源性最高的候選基因。對轉基因植株進行⑶S組織染色，但在擬南芥的愈傷中檢測到⑶S的表達，推測 ⑶S可能在水稻的愈傷中表達。二、玉米愈傷組織特異性啟動子wrky的克隆
將啟動wrky表達的啟動子命名為ZMW，根據wrky上遊長度為^12bp的核苷酸序列設 計PCR擴增該片段的引物，上遊加HindIII (AAGCTT)酶切位點，下遊加BglII (AGATCT)酶切 位點
引物序列如下
引物 1(上遊引物):5，-CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G-3， 引物 2 (下遊引物)5，-GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A-3， 提取玉米基因組DNA並以此為模板，在引物1和引物2的引導下，進行PCR擴增，PCR反 應體系為
ddH20 39. 6μ LIOX PCR Buffer 5 μ L ；IOmM dNTP luL；IOuM引物1 luL；IOuM引物2 luL；玉米B73基因組DNA IOpg ；DNA Polymerase(2U/ul):0. 4μ L ；PCR反應條件為預變性94°C 5分鐘， 變性94 0C 30秒，
退火55 40秒，34個循環
延伸72 °C 2分鐘； 」
最後72 °C, 10分鐘。反應結束後，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收並純化^12bp的目 的片段，將其克隆到載體PMD18-T Vector (寶生物公司)，再轉化到Trans5a化學感受態細 胞(全式金生物技術有限公司)中，PCR篩選陽性克隆，進行測序，測序結果表明wrky具有 序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列，序列表中的SEQ ID Ns :1由觀12個鹼基組成，將含有 ZMW DNA序列的重組質粒載體命名為PMD18-ZMW。三、WRKY基因啟動子ZMW表達載體的建立
將用PCR擴增得到並克隆於PMD18-T載體上的wrky片段用Hind III和Bgl II酶切下來， 與用相同酶切PCAMBIA1301的載體連接，構建載體p_ZMW。其載體構建圖具體是hpt 潮黴 素抗性基因，在該基因上遊有一 nos啟動子；wrky 啟動子ZMW ；gus :glucoronidase基因， 即GUS報告基因；nos 終止子，在其下遊是GUS報告基因。取純化後1 μ g的過量表達載體質粒DNA加入到200 μ L ΕΗ105感受態細胞中， 混勻；冰浴5分鐘後轉入液氮中速凍1分鐘，接著移至37°C水浴5分鐘，加入1 mL YEP液 體培養基，28°C，250 rpm預表達4-5小時；10000 rpm離心30秒，棄上清，加入0. ImL YEP 液體培養基，重新懸浮細胞；塗布於含100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL利福平的YEP固體平 板上，培養約48小時。挑取平板上長出的單菌落，接種於含100 μ g/mL Kan和50 μ g/ mL利福平的YEP液體培養基中，最後提取質粒。先用PCR方法初步鑑定(引物為引物1和 引物2)；接著用Hind III和Bgl II酶切驗證。四、農桿菌介導水稻轉化
通過農桿菌感受態的方法將含目的基因的ZMW表達載體p-ZMW質粒導入農桿菌菌 株EH105中，經PCR篩選出陽性克隆，然後用共培養法將含有目的基因的農桿菌導入植物受 體材料轉化水稻。(1)水稻成熟胚愈傷組織的誘導培養與繼代培養
去殼的水稻成熟種子先用ddH20洗4-5次，再用70%乙醇浸泡1-2分鐘，然後用含有 1/1000吐溫的20%次氯酸鈉浸泡30分鐘，期間不停的搖晃，從而進行表面滅菌，之後用無菌 水衝洗3-4次，再將成熟種子放在無菌濾紙上吸乾水分後，放在愈傷誘導培養基上，弱 光培養。約10-15天後，將愈傷組織轉入繼代培養基上，在相同條件下繼代培養。每兩周繼 代培養一次，繼代兩次後挑選繼代培養5-7天，將色澤淡黃的愈傷組織用於共培養。(2)用於轉化水稻的農桿菌菌液的準備
將含有植物表達載體的農桿菌接種於YEP液體培養基(含有100 μ g/mL Kan和50 μ g/ mL利福平)中，28°C振蕩培養至OD6tltl=O. 6-1. 0 ；室溫下5000 rpm離心5分鐘收集菌體，隨後 將其懸浮於液體共培養基中，調整菌體濃度至OD6tltl=O. 4，即為共培養轉化水稻用的農桿菌 懸浮液。(3)農桿菌侵染水稻愈傷組織挑選狀態較好(繼代培養5-7天、色澤淡黃)的愈傷組織放入25 mL無菌三角瓶中，加 入適量農桿菌懸浮液以保證有足夠的菌液與材料接觸，28°C 150 rpm搖床上培養20-30分 鍾。之後倒掉菌液，將愈傷組織放在無菌濾紙上吸去多餘菌液，隨即轉移到鋪有一層無菌濾 紙的固體共培養基上，22°C暗培養2-3天。(4)抑菌處理
用ddH20清洗愈傷3-4次至清洗液清亮，棄去清洗液，用無菌濾紙吸乾，轉入含有頭 孢黴素(500mg/L)和羧苄青黴素(200mg/L)的溶液中振蕩滅菌半個小時以上，用無菌濾紙 吸乾，轉至鋪兩層無菌濾紙的培養皿中乾燥處理M-72小時；將愈傷轉移至加有頭孢黴素 (500mg/L)和潮黴素(50mg/L)篩選培養基上，28°C光照培養約30天。(5)抗性愈傷組織的分化
從篩選後長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色緻密的潮黴素抗性愈傷轉至含有50mg/L 潮黴素(或20mg/L PPT)的分化培養基上，先暗培養3天，然後轉至30°C全光照條件下 培養，一般經過15-20天左右，有綠點出現。30-40d後進一步分化出小苗。(6)生根、壯苗和移栽
抗性愈傷組織分化出的小苗高度大於3cm時，移到生根培養基上，培養2-3周。選擇高 15cm以上、根系發達的小苗，用溫水洗去培養基，在溫室內移栽入土。水面以不淹沒小苗為 度，晴天需要遮蔭到小苗成活(以吐水為準)。待轉基因小苗生長健壯後移入田中生長。五、轉基因水稻的的鑑定
為了檢測轉基因水稻，一般以提取的轉基因水稻總DNA為模板，用中間載體抗性篩選 基因潮黴素的上遊引物和下遊引物配對擴增相應基因，初步鑑定轉基因植株。用於檢測潮黴素抗性基因的引物序列 引物 3 (上遊引物)5』 -ACTCACCGCGACGTCTGT-3』 引物 4 (下遊引物)5，-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3』 ；
初步鑑定為轉基因植株後，接著對轉基因植株進行GUS組織染色。取轉基因水稻 的莖、根、葉、花粉、穎殼，愈傷、未成熟的種子、成熟的種子以及子房等待檢測的植物組織與 小離心管中，加入⑶S緩衝液浸沒組織塊，再加入5% (ν/ν)用量的⑶S染色液，混勻後37°C 下保存16-24小時。葉片等綠色材料轉入70%乙醇溶液中脫色2-3次，直至陰性對照材料 呈白色。肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景下的藍色小點即為GUS表達載體如圖所示(A為愈 傷；B為根；C為葉；D為花粉；E為莖；F為穎殼；G為未成熟的種子；H為成熟的種子；I為子 房)。在轉基因植株的正常器官中都沒有檢測到GUS基因的表達，而只在愈傷中檢測到GUS 基因的表達，從而證明wrky僅在水稻愈傷組織中特異性表達。
權利要求
1.一種玉米愈傷組織特異性啟動子，其特徵在於通過生物信息學的方法初步確定， 在玉米B73自交系中擴增該啟動子，通過在水稻中驗證在愈傷中特異性表達的啟動子，具 有序列表中1下的序列。
2.一種根據權利要求1所述的玉米愈傷組織特異性啟動子的克隆方法，其特徵在於 利用生物信息學篩選候選基因，然後與基因組序列進行比對分析，設計引物，上遊引物5』_ CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G _3，，下遊引物5，_ GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A _3』擴增該基因上遊5』區域DNA序列，然後與⑶S基因連接，通過 轉基因水稻驗證啟動子功能。
3.根據權利要求1所述的玉米愈傷組織特異性啟動子在植物愈傷組織基因功能研究 和基因表達調控中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種玉米愈傷組織特異性啟動子及其克隆方法與應用。本發明利用生物信息學分析獲得一個WRKY基因，通過與基因組進行序列比較，設計引物進行PCR獲得該基因5′上有的啟動子區域，該啟動子長2880bp，具有序列表中1項下的序列，通過對啟動子的分析，其含有多個順式作用元件，把該啟動子亞克隆到含GUS基因載體，啟動GUS基因表達，把載體轉化到水稻中去，對水稻的各個組織進行染色檢測，發現該啟動子特異性的在愈傷組織中表達，該啟動子在基因工程以及基因功能研究中具有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/113GK102094021SQ20101058704
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月14日 優先權日2010年12月14日
發明者唐秀麗, 朱蘇文, 王瑩, 程備久, 項豔 申請人:安徽農業大學