一種製備人纖維蛋白原製劑的方法及其製備的製劑的製作方法

2023-05-09 19:53:51 2

一種製備人纖維蛋白原製劑的方法及其製備的製劑的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種製備人纖維蛋白原製劑的方法，該方法以健康人血漿為原料，經低溫乙醇蛋白分離法分離純化，其中採用溫和的壓濾法替代了離心法，並用低溫乙醇溶液對沉澱進行頂洗；增加了多級深層過濾；改進了凍幹工藝，使凍幹周期由4～8天縮短到2～3天；並將S/D法、UVC照射法和乾熱法結合對病毒進行滅活處理，保證了對脂包膜、非脂包膜病毒尤其是耐熱的細小病毒的去除效果。本發明還公開了由上述方法製備的人纖維蛋白原製劑。本發明生產出的人纖維蛋白原製劑質量更穩定，雜質含量更低，病毒安全性更高，能最大限度的減少輸注該製劑可能給患者帶來的安全風險，降低了臨床應用時副反應的發生，使用藥更安全。
【專利說明】一種製備人纖維蛋白原製劑的方法及其製備的製劑

【技術領域】
[0001] 本發明涉及血液製品領域，特別是涉及一種製備人纖維蛋白原製劑的方法及其制 備的製劑。

【背景技術】
[0002] 纖維蛋白原（Fibrinogen，Fg)，即凝血因子I (F I )，是凝血系統中的"中心"蛋 白質之一，相對分子量340kDa，具有2964 (6)個胺基酸殘基，分子長度約為45nm，寬度最大 直徑為4. 8nm，半衰期為96?144小時，等電點為5. 1?5. 5,沉降係數為7. 7?7. 9。Fg 主要由肝臟合成，是一種糖蛋白，含碳水化合物3%?5%，由兩個相同部分組成，每個部分 含有3條肽鏈，即Αα、Ββ和γ鏈，分別由610、461和410個胺基酸殘基構成。每部分由 12個二硫鍵相連，兩個部分之間通過兩條Y鏈的半胱氨酸8、9及Aa鏈的半胱氨酸28所 形成的3個二硫鍵在氨基端相連。大部分存在於人體血漿中，約15%存在於血管外，正常 人血漿中Fg的含量為2. 0?4. Og/L，是血漿粘滯性的主要決定因素，止血需要量約為正常 的25 %?50%，血楽水平低於1?I. 5g/L可能引起凝血障礙。纖維蛋白原在凝血酶的作 用下裂解釋放纖維蛋白肽A和B，形成纖維蛋白，與血小板一起形成穩固的纖維蛋白血栓， 完成止血機制。Fg是由健康人血漿經分離、提純並經病毒滅活處理製成的，主要應用於先天 性、獲得性纖維蛋白原減少症、嚴重肝臟損傷、肝硬化、DIC以及手術或者產後大出血等的治 療，是臨床上用於大出血止血的必備急救藥品之一。其製備方法直接影響產品的質量和安 全性。
[0003] 早在20世紀40年代，採用Cohn低溫乙醇法分離出來的Fg製品就已應用於臨床； 但當時Fg製品的生產工藝中尚不含對製品的病毒滅活處理，這導致患者在輸注後引起病 毒性肝炎的危險性很大，一些歐美國家相繼停止了 Fg製品的製備與應用。美國FDA於1977 年12月撤銷了 Fg製品的生產許可證，並於1978年7月禁止其使用。20世紀80年代以後， Fg製品病毒滅活方法的研究取得成功，使該製品又重新開始生產。2002年國家食品藥品督 管理局（SFDA)發布《血液製品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導》，要求在凝血因子類 製品的生產過程中，應有特定的能去除/滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，以減少產品 攜帶病毒的風險，確保製品的安全。目前，國內上市的Fg製品均為S/D法聯合乾熱法進行 病毒滅活，但S/D法僅能滅活脂包膜病毒如危害性較大的HBV、HCV和HIV等，對人細小病毒 (B19)、HAV等非脂包膜病毒無殺滅作用。乾熱法即凍幹製劑經過加熱處理殺滅病毒的方法， 目前採用較多的是l〇〇°C 30min乾熱處理，該法已被證明能有效滅活HBV、HCV、HIV等脂包 膜病毒及EMCV、HAV等非脂包膜病毒，其病毒滅活效果已為實驗室驗證和臨床應用所肯定， 為控制凝血因子類製品病毒感染髮揮了重要作用，但早在1997年就有過8名血友病患者採 用經100°C 30min乾熱法滅活的凝血因子製品治療後感染B19的報導；2005年Prikhod'ko 等的研究顯示，殘留水分為0. 5%?0. 7%的人纖維蛋白原，經100°C 3h乾熱法滅活處理後， B19病毒僅降低（2?3) log。可見乾熱法對B19等耐熱性非脂包膜病毒有一定滅活效果， 但無法完全阻斷B19的傳染，存在一定風險。針對B19這類耐熱性較強的非脂包膜病毒，還 應與其他滅活方法結合使用，以確保製品的安全性。
[0004] 由此可見，上述現有的製備人纖維蛋白原製劑的方法顯然仍存在有不足，而亟待 進一步改進。如何能創設一種製備的人纖維蛋白原製劑純度高、穩定性高、病毒滅活效果好 的新的方法及其製備的製劑，為當前重要研發課題之一。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種製備人纖維蛋白原製劑的方法及其製備的 製劑，使其製得的人纖維蛋白原製劑純度高、穩定性高、病毒滅活效果好，從而克服現有的 製備人纖維蛋白原製劑方法的不足。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供一種製備人纖維蛋白原製劑的方法，製備方法 步驟如下：
[0007] (1)分離組分I :將病毒檢測合格並且符合國家檢疫期規定的原料血漿，在溫度 (TC ±2. 5°C、乙醇濃度8?10%、pH7. 0±0. 20條件下，攪拌1?3小時，然後通過壓濾法 分離出組分I ;
[0008] (2)洗滌/溶解組分I :將組分I沉澱粉碎後，加入體積升數為組分I千克數20±5 倍的枸櫞酸鈉-甘氨酸緩衝液中，在溫度〇°C ±2. 5°C條件下攪拌洗滌30?60分鐘，通過 壓濾法分離出洗滌後的沉澱A，將該沉澱A粉碎，加入到體積升數為沉澱A千克數3?5倍 的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液中，在溫度20°C?30°C的條件下攪拌溶解1?3小 時，用三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液稀釋至體積升數為沉澱A千克數的10?12倍， 澄清過濾，取濾液備用；
[0009] (3)S/D滅活處理：計量步驟（2)得到的濾液體積後，在攪拌過程中，加入1/10濾 液體積的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20°C? 30°C，調製溶液pH至7. 00±0. 20,並在水浴24°C?26°C的條件下緩慢攪拌滅活4?8小 時；
[0010] ⑷乙醇沉澱：將步驟⑶得到的溶液澄清過濾後，降溫至〇°C?2°C，在攪拌過程 中，加入預冷至-5°C以下的50 %乙醇溶液，使溶液中乙醇終含量為8 %?10 %，並調整溫度 至-2°C?2°C，pH至7.00±0. 20,攪拌反應0. 5?1. 5小時，通過壓濾法分離出沉澱^將 沉澱B加入到體積升數為沉澱B千克數13?15倍的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液 中，保持溫度30°C?37°C，攪拌溶解0. 5?1. 5小時，澄清過濾，重複本步驟上述操作一次， 通過壓濾法分離出沉澱C ;
[0011] (5)原液製備：將沉澱C粉碎後，加入到體積升數為沉澱C千克數4?8倍的鹽酸 精氨酸-枸櫞酸鈉緩衝液中，在30°C?37°C的條件下攪拌溶解0. 5?1. 5小時，澄清過濾 後，用鹽酸精氨酸-枸櫞酸鈉緩衝液調整溶液中蛋白質含量至2. 2 %?3. 0 %，調整pH值為 6. 5?7. 5,得原液；
[0012] (6) UVC照射處理：將原液放置於UVC滅活儀中，經強度為90?140J/m2UVC照射處 理；
[0013] (7)除菌過濾及分裝。
[0014] 作為本發明的進一步改進，所述方法還包括：將步驟（7)得到的分裝樣品凍幹，所 述凍幹過程中包括預冷、退火操作步驟。
[0015] 進一步改進，所述凍幹步驟為：5°C預冷lh、-40°C凍結3h、-KTC?-5°C退火 2h、-40°C凍結3h、-5°C?(TC升華20h、20°C?25°C升溫乾燥IOh?20h，真空封口，且凍幹 過程中製品溫度不超過30°C。
[0016] 進一步改進，所述方法還包括：將所得的凍幹製劑經沸水浴100°C、30min乾熱法 處理。
[0017] 進一步改進，步驟（1)、（2)、（4)中所述壓濾法分離沉澱的步驟是：採用孔徑公稱 精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m的壓濾濾板分離沉澱，並用低溫乙醇溶液對沉澱進行頂洗。
[0018] 進一步改進，所述低溫乙醇溶液為_2°C?-3°C的10%乙醇溶液。
[0019] 進一步改進，步驟（2)中澄清過濾步驟是採用孔徑公稱精度為Ιμπι?2μπι的 深層濾器串聯LOym濾器進行的；步驟（4)中澄清過濾步驟是採用孔徑公稱精度為 0.4μπι?0.8μπι的深層濾器進行的；步驟（5)中澄清過濾步驟是採用孔徑公稱精度 0. Ιμπι?0. 5μηι的深層濾器進行的。
[0020] 進一步改進，步驟（1)中分離的組分I在_30°C以下凍存。
[0021] 本發明還提供一種由上述方法製備的人纖維蛋白原製劑。
[0022] 採用上述的技術方案，本發明至少具有以下優點：
[0023] 1、本發明製備人纖維蛋白原製劑的方法，採用了溫和的壓濾法替代了傳統的離心 法分離沉澱，並用低溫乙醇溶液對壓濾出的沉澱進行了頂洗，一方面提高了生產效率，避免 了高剪切力對蛋白結構可能造成的破壞，一方面降低了沉澱所含上清液中的雜質含量。
[0024] 2、本發明製備人纖維蛋白原製劑的方法，採用了多步澄清過濾，並且在原有的S/D 法聯合乾熱法的基礎上，增加了 UVC照射法，以滅活B19等耐熱性非脂包膜病毒，生產出的 人纖維蛋白原製劑不僅質量穩定，而且病毒安全性更高。
[0025] 3、本發明製備人纖維蛋白原製劑的方法，對人纖維蛋白原製品的凍幹增加了預 冷、退火工藝，使人纖維蛋白原製劑凍幹周期由4?8天縮短到2?3天。
[0026] 4、本發明製備人纖維蛋白原製劑的方法，生產周期短，產品純度高達90%以上，雜 質含量低，降低了臨床應用時副反應的發生，用藥更安全。

【具體實施方式】
[0027] 實施例1
[0028] (1)分離組分I :將病毒檢測合格，並且符合國家檢疫期規定的冰凍原料血楽，用 75 %的酒精消毒血漿袋錶面，破袋，將血漿收集在專用的帶有夾層的血漿收集罐中，用循環 水進行循環加熱，血漿融化後，離心去除冷沉澱，再將去除冷沉澱的血漿通過吸附法去除凝 血酶原複合物，得到的血漿在溫度〇°C ±2. 5°C，乙醇濃度8%，pH7. 0±0. 20條件下，攪拌 3小時，然後使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱，並用 501^的-21：?-31：的10%乙醇溶液對沉澱進行頂洗，得組分1沉澱9.00敁。
[0029] (2)洗滌/溶解組分I :將存放於_30°C以下冷庫內的組分I沉澱9. OOKg出庫後， 粉碎，加入到225L枸櫞酸鈉-甘氨酸緩衝液（以下簡稱CitNa-Gly緩衝液）中，在溫度 (TC ±2. 5°C條件下，攪拌洗滌30分鐘，然後使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾 板通過壓濾法分離出沉澱，並用50L的-2°C?_3°C的10%乙醇溶液對沉澱進行頂洗，得沉 澱AS. 10Kg。將沉澱A粉碎，加入到32. 4L三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液（以下簡稱 Tris-CitNa緩衝液）中，在溫度20°C?22°C的條件下攪拌溶解I. 5小時，用Tris-CitNa緩 衝液稀釋至97. 2L，然後使用孔徑公稱精度為1 μ m?2 μ m的深層濾器串聯I. O μ m濾器進 行澄清過濾，得到濾液體積為107L。
[0030] (3)S/D滅活處理：計量步驟（2)得到的濾液體積107L，在攪拌過程中，加入10. 7L 的S/D溶液（含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20?30°C )中，使溶液中 聚山梨酯80含量達到10. Og/L，磷酸三丁酯的含量到達3. Og/L，將得到的溶液置於專用的 病毒滅活罐內，調製溶液pH至6. 94,並在水浴24°C?26°C的條件下緩慢攪拌保溫6小時， 以滅活產品中可能殘留的汙染病毒。
[0031] (4)乙醇沉澱：將步驟（3)得到的溶液使用孔徑公稱精度為0. 4 μ m?0. 8 μ m的深 層濾器進行澄清過濾，濾液體積為122L，降溫至0. 9°C，在攪拌頻率45%，加入預冷至-5°C 以下的50 %乙醇溶液30. 5L，使溶液中乙醇終含量為10 %，並調整溶液溫度至-I. 9°C，pH為 7. 03,攪拌反應0. 5小時，使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離 出沉澱，並用30L的-2°C?_3°C的10%乙醇溶液對沉澱進行了頂洗，得沉澱B 4. 9Kg。將 沉澱B加入到68. 6LTris-CitNa緩衝液中，保持溫度30°C?32°C，攪拌溶解1. 5小時，然後 使用孔徑公稱精度為〇. 4 μ m?0. 8 μ m的深層濾器進行澄清過濾，得濾液體積為75. 0L，重 複本步驟上述操作一次，使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離 出沉澱，並用30L的-2°C?_3°C的10%乙醇溶液對沉澱進行了頂洗，得沉澱C3. 80Kg。
[0032] (5)原液製備：取3. 80Kg沉澱C粉碎後，加入到15. 2L鹽酸精氨酸-枸櫞酸鈉緩 衝液（以下簡稱Arg-CitNa緩衝液）中，在35°C?37°C條件下攪拌溶解I. 0小時，使用孔 徑公稱精度為〇. 1 μ m?0. 5 μ m的深層濾器進行澄清過濾。根據測定的蛋白質含量43. 9g/ L，用Arg-CitNa緩衝液調整溶液中蛋白質含量至3. 0%，調製品pH值為6. 54,即得原液。
[0033] (6)短波UVC滅活處理：將步驟（5)得到的原液放置於UVC滅活儀中，設定照射劑 量為140J/m 2,進行滅活處理。
[0034] (7)除菌過濾：用滅菌好的過濾器對步驟（6)滅活完的製品進行除菌過濾，過濾器 的孔徑為複合材質〇. 45/0. 2um，過濾結束後檢查除菌過濾器的完整性，確保製品到達無菌 要求。
[0035] (8)分裝、凍幹：將步驟（7)得到的過濾後製品按照標示的裝量進行分裝、凍幹，凍 幹步驟為：5°C預冷lh、-40°C凍結3h、-5°C退火2h、-40°C凍結3h、0°C升華20h、20°C升溫幹 燥20h，凍幹過程中製品溫度最高22. 6°C，凍幹周期為64. 5h，真空封口，即得凍幹製劑。
[0036] (9)乾熱滅活：將步驟⑶得到的凍幹製劑經沸水浴100°C 30min乾熱法處理，制 得人纖維蛋白原製劑一。
[0037] 實施例2
[0038] (1)分離組分I :將病毒檢測合格，並且符合國家檢疫期規定的冰凍原料血楽，用 75 %的酒精消毒血漿袋錶面，破袋，將血漿收集在專用的帶有夾層的血漿收集罐中，用循環 水進行循環加熱，血漿融化後，離心去除冷沉澱，再將去除冷沉澱的血漿通過吸附法去除凝 血酶原複合物，得到的血漿在溫度〇°C ±2. 5°C，乙醇濃度10%，pH7. 0±0. 20條件下，攪拌 1小時，然後使用孔徑公稱精度為〇. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱，並用 501^的-21：?-31：的10%乙醇溶液對沉澱進行頂洗，得組分1沉澱11.901^。
[0039] (2)洗滌/溶解組分I :將存放於_30°C以下冷庫內的組分I沉澱11. 90Kg出庫 後，粉碎，加入到180LCitNa-Gly緩衝液中，在溫度0°C ±2. 5°C條件下，攪拌洗滌60分鐘， 然後使用孔徑公稱精度為〇. 8μ m?1. 5μ m壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱，並用50L 的-2°C?_3°C的10%乙醇溶液對沉澱進行頂洗，得沉澱A10. 5Kg。將沉澱A粉碎，加入到 31. 5LTris-CitNa緩衝液中，在溫度24°C?26°C的條件下攪拌溶解1小時，用Tris-CitNa 緩衝液稀釋至105L，然後使用孔徑公稱精度為1 μ m?2 μ m的深層濾器串聯I. 0 μ m濾器進 行澄清過濾，得到濾液體積為125L。
[0040] (3)S/D滅活處理：計量步驟（2)得到的濾液體積125L，在攪拌過程中，加入12. 5L 的S/D溶液（含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20?30°C )中，使溶液中 聚山梨酯80含量達到10. Og/L，磷酸三丁酯的含量到達3. Og/L，將得到的溶液置於專用的 病毒滅活罐內，調製溶液pH至6. 80,並在水浴24°C?26°C的條件下攪拌保溫4小時，以滅 活產品中可能殘留的汙染病毒。
[0041] (4)乙醇沉澱：將步驟⑶得到的溶液使用孔徑公稱精度為0. 4 μ m?0. 8 μ m的 深層濾器進行澄清過濾，濾液體積為142L，降溫至0°C，在攪拌頻率50 %，加入預冷至-5°C 以下的50 %乙醇溶液31. 2L，使溶液中乙醇終含量為9 %，並調整溶液溫度至-0. I °C，pH為 6. 84,攪拌反應I. 0小時，使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離 出沉澱，並用30L的-1°C?0°C的10%乙醇溶液對沉澱進行了頂洗，得沉澱B6. 5Kg。將沉 澱B加入到84. 5LTris-CitNa緩衝液中，保持溫度33°C?35°C，攪拌溶解I. 0小時，使用孔 徑公稱精度為〇. 4 μ m?0. 8 μ m的深層濾器進行澄清過濾，得濾液體積為89. 0L，重複本步 驟上述操作一次，使用孔徑公稱精度為〇. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱， 並用30L的-1°C?0°C的10%乙醇溶液對沉澱進行了頂洗，得沉澱C4. 89Kg。
[0042] (5)原液製備：取2. 40Kg沉澱C粉碎後，加入到19. 2LArg-CitNa緩衝液中，在 33°C?35°C條件下攪拌溶解0. 5小時，使用孔徑公稱精度為0. 1 μ m?0. 5 μ m的深層濾器 進行澄清過濾。根據測定的蛋白質含量26. 9g/L，用Arg-CitNa緩衝液調整溶液中蛋白質含 量至2. 2%，pH值為7. 06,即得原液。
[0043] (6)短波UVC滅活處理：將步驟（5)得到的原液放置於UVC滅活儀中，設定照射劑 量為90J/m 2,進行滅活處理。
[0044] (7)除菌過濾：用滅菌好的過濾器對步驟（6)滅活完的製品進行除菌過濾，過濾器 的孔徑為複合材質〇. 45/0. 2um，過濾結束後檢查除菌過濾器的完整性，確保製品到達無菌 要求。
[0045] (8)分裝、凍幹：將步驟（7)得到的過濾後製品按照標示的裝量進行分裝、凍幹，凍 幹步驟為：5°C預冷lh、-40°C凍結3h、-5°C退火2h、-40°C凍結3h、0°C升華20h、25°C升溫幹 燥IOh的方式凍幹，凍幹過程中製品溫度最高28. I°C，凍幹周期為51h，真空封口，即得凍幹 製劑。
[0046] (9)乾熱滅活：將步驟⑶得到的凍幹製劑經沸水浴100°C 30min乾熱法處理，制 得人纖維蛋白原製劑二。
[0047] 實施例3
[0048] (1)分離組分I :將病毒檢測合格，並且符合國家檢疫期規定的冰凍原料血漿，用 75 %的酒精消毒血漿袋錶面，破袋，將血漿收集在專用的帶有夾層的血漿收集罐中，用循環 水進行循環加熱，血漿融化後，離心去除冷沉澱，再將去除冷沉澱的血漿通過吸附法去除凝 血酶原複合物，得到的血漿在溫度〇°C ±2. 5°C，乙醇濃度9%，pH7. 0±0. 20條件下，攪拌 2小時，然後使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱，並用 501^的-21：?-31：的10%乙醇溶液對沉澱進行頂洗，得組分1沉澱14.601^。
[0049] (2)洗滌/溶解組分I :將存放於_30°C以下冷庫內的組分I沉澱14. 60Kg出庫 後，粉碎，加入到292LCitNa-Gly緩衝液中，攪拌洗滌45分鐘，然後使用孔徑公稱精度為 0.8μπι?1.5μπι壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱，並用50L的-2°C?_3°C的10%乙醇溶 液對沉澱進行頂洗，得沉澱A13. 2Kg。將沉澱A粉碎，加入到66LTris-CitNa緩衝液中，在溫 度28°C?30°C的條件下攪拌溶解3小時，用Tris-CitNa緩衝液稀釋至145. 2L，然後使用孔 徑公稱精度為1 μ m?2 μ m的深層濾器串聯I. 0 μ m濾器澄清過濾，得到濾液體積為160L。
[0050] (3)S/D滅活處理：計量步驟（2)得到的濾液體積160L，在攪拌過程中，加入16LS/ D溶液（含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20?30°C)中，使溶液中聚山 梨酯80含量達到10. Og/L，磷酸三丁酯的含量到達3. Og/L，將得到的溶液置於專用的病毒 滅活罐內，調製溶液pH至7. 16,並在水浴24°C?26°C的條件下緩慢攪拌保溫8小時，以滅 活產品中可能殘留的汙染病毒。
[0051] (4)乙醇沉澱：將步驟（3)得到的溶液使用孔徑公稱精度為0. 4 μ m?0. 8 μ m的深 層濾器進行澄清過濾，濾液體積為180L，降溫至2. (TC，在攪拌頻率45%，加入預冷至-5°C 以下的50%乙醇溶液34. 3L，使溶液中乙醇終含量為8 %，並調整溶液溫度至I. 8°C，pH為 7. 19,攪拌反應1. 5小時，使用孔徑公稱精度為0. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離 出沉澱，並用30L的1°C?2°C的10%乙醇溶液對沉澱進行了頂洗，得沉澱B 8. 04Kg。將沉 澱B加入到120. 6LTris-CitNa緩衝液中，保持溫度35°C?37°C，攪拌溶解0. 5小時，使用 孔徑公稱精度為〇. 4 μ m?0. 8 μ m的深層濾器進行澄清過濾，得濾液體積為125L，重複本步 驟上述操作一次，使用孔徑公稱精度為〇. 8 μ m?1. 5 μ m壓濾濾板通過壓濾法分離出沉澱， 並用30L的1°C?2°C的10%乙醇溶液對沉澱進行了頂洗，得沉澱C 6. 30Kg。
[0052] (5)原液製備：取2.30Kg沉澱C粉碎後，加入到13.8LArg-CitNa緩衝液中，在 30°C?32°C條件下攪拌溶解1. 5小時，使用孔徑公稱精度為0. 1 μ m?0. 5 μ m的深層濾器 進行澄清過濾。根據測定的蛋白質含量32. 3g/L，用Arg-CitNa緩衝液調整溶液中蛋白質含 量至2. 5%，pH值為7. 48,即得原液。
[0053] (6)短波UVC滅活處理：將步驟（5)得到的原液放置於UVC滅活儀中，設定照射劑 量為120J/m 2,進行滅活處理。
[0054] (7)除菌過濾：用滅菌好的過濾器對步驟（6)滅活完的製品進行除菌過濾，過濾器 的孔徑為複合材質〇. 45/0. 2um，過濾結束後檢查除菌過濾器的完整性，確保製品到達無菌 要求。
[0055] (8)分裝、凍幹：將步驟（7)得到的過濾後製品按照標示的裝量進行分裝、凍幹，凍 幹步驟為：5°C預冷lh、-40°C凍結3h、-KTC退火2h、-40°C凍結3h、-5°C升華20h、25°C升 溫乾燥15h的方式凍幹，凍幹過程中製品溫度最高27. 8°C，凍幹周期為58. 5h，真空封口，即 得凍幹製劑。
[0056] (9)乾熱滅活：將步驟⑶得到的凍幹製劑經沸水浴100°C 30min乾熱法處理，制 得人纖維蛋白原製劑三。
[0057] 實施例4
[0058] 對實施例1、2、3所得到的製劑依照《中華人民共和國藥典》2010版（三部）規定 的試驗方法和試驗標準進行檢測，主要的質量指標結果如表1所示：
[0059] 表1製劑一、二、三中主要質量指標的檢測結果
[0060]

【權利要求】
1. 一種製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，所述製備方法步驟如下： (1) 分離組分I:將病毒檢測合格並且符合國家檢疫期規定的原料血漿，在溫度 0°C ±2. 5°C、乙醇濃度8?10%、pH7. 0±0. 20條件下，攪拌1?3小時，然後通過壓濾法 分離出組分I ; (2) 洗滌/溶解組分I :將組分I沉澱粉碎後，加入體積升數為組分I千克數20±5倍 的枸櫞酸鈉-甘氨酸緩衝液中，在溫度〇°C ±2. 5°C條件下攪拌洗滌30?60分鐘，通過壓濾 法分離出洗滌後的沉澱A，將該沉澱A粉碎，加入到體積升數為沉澱A千克數3?5倍的三 羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液中，在溫度20°C?30°C的條件下攪拌溶解1?3小時， 用三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液稀釋至體積升數為沉澱A千克數的10?12倍，澄 清過濾，取濾液備用； (3) S/D滅活處理：計量步驟（2)得到的濾液體積後，在攪拌過程中，加入1/10濾液體 積的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20°C?30°C， 調製溶液pH至7. 00±0. 20,並在水浴24°C?26°C的條件下緩慢攪拌滅活4?8小時； (4) 乙醇沉澱：將步驟⑶得到的溶液澄清過濾後，降溫至〇°C?2°C，在攪拌過程中， 加入預冷至-5°C以下的50%乙醇溶液，使溶液中乙醇終含量為8%?10%，並調整溫度 至-2°C?2°C，pH至7. 00±0. 20,攪拌反應0. 5?1. 5小時，通過壓濾法分離出沉澱B，將 沉澱B加入到體積升數為沉澱B千克數13?15倍的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩衝液 中，保持溫度30°C?37°C，攪拌溶解0. 5?1. 5小時，澄清過濾，重複本步驟上述操作一次， 通過壓濾法分離出沉澱C; (5) 原液製備：將沉澱C粉碎後，加入到體積升數為沉澱C千克數4?8倍的鹽酸精氨 酸-枸櫞酸鈉緩衝液中，在30°C?37°C的條件下攪拌溶解0. 5?1. 5小時，澄清過濾後，用 鹽酸精氨酸-枸櫞酸鈉緩衝液調整溶液中蛋白質含量至2. 2 %?3. 0 %，調整pH值為6. 5? 7. 5,得原液； (6) UVC照射處理：將原液放置於UVC滅活儀中，經強度為90?140J/m2UVC照射處理； (7) 除菌過濾及分裝。
2. 如權利要求1所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，所述方法還包括： 將步驟（7)得到的分裝樣品凍幹，所述凍幹過程中包括預冷、退火操作步驟。
3. 如權利要求2所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，所述凍幹步驟為： 5°C預冷 lh、-40°C凍結 3h、-10°C?-5°C退火 2h、-40°C凍結 3h、-5°C?0°C升華 20h、20°C? 25°C升溫乾燥lOh?20h，真空封口，且凍幹過程中製品溫度不超過30°C。
4. 如權利要求2所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，所述方法還包括： 將所得的凍幹製劑經沸水浴l〇〇°C、30min乾熱法處理。
5. 如權利要求1所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，步驟（1)、（2)、（4) 中所述壓濾法分離沉澱的步驟是：採用孔徑公稱精度為〇. 8 y m?1. 5 y m的壓濾濾板分離 沉澱，並用低溫乙醇溶液對沉澱進行頂洗。
6. 如權利要求5所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，所述低溫乙醇溶 液為-2°C?-3°C的10%乙醇溶液。
7. 如權利要求1所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，步驟（2)中澄清過 濾步驟是採用孔徑公稱精度為1 U m?2 y m的深層濾器串聯1. 0 y m濾器進行的；步驟（4) 中澄清過濾步驟是採用孔徑公稱精度為0. 4 y m?0. 8 y m的深層濾器進行的；步驟（5)中 澄清過濾步驟是採用孔徑公稱精度0. 1 U m?0. 5 y m的深層濾器進行的。
8. 如權利要求1所述的製備人纖維蛋白原製劑的方法，其特徵在於，步驟（1)中分離的 組分I在_30°C以下凍存。
9. 一種由權利要求1?8中任一項所述方法製備的人纖維蛋白原製劑。
【文檔編號】A61K38/36GK104436171SQ201410818246
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優先權日:2014年12月25日
【發明者】馬小偉, 梁雪爽, 張學成, 謝來峰, 李冠軍, 王學位 申請人:華蘭生物工程股份有限公司, 華蘭生物疫苗有限公司