一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體及其應用的製作方法

2023-05-09 18:08:06 1

一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體及其應用。所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體為含有酵母DNA複製子和酵母篩選標記基因的雙元載體。所述應用為大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體在向真菌或植物細胞轉化DNA中的應用。本發明的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體是世界上首次報導的、可以同時在酵母、大腸桿菌和農桿菌內複製、增殖並穩定存在的質粒，該穿梭表達載體可以直接通過農桿菌介導的方式轉化真菌或植物細胞，縮短了基因操作的流程和時間，使用方便、工作效率高，且製備過程簡便、快速、高效。
【專利說明】一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體涉及一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體及其應用。
【背景技術】
[0002]轉基因技術是一種把人工分離或修飾過的DNA片段導入到生物體基因組中，弓丨起某種基因的表達或不表達，使生物體的性狀發生可遺傳的改變。在生產和科學研究中，植物和真菌是兩類廣泛進行的轉基因對象。轉化的DNA片段一般用於基因表達、基因敲除或基因沉默等，目的在於研究基因的功能，提聞植物的抗病能力、增廣、改善品質，提聞工業真菌的生產效率等。植物和真菌的DNA轉化有許多方法，其中農桿菌介導的轉化方法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)是一種效率最高的方法。農桿菌介導需要利用雙元載體(binary vector),雙元載體含有一段T-DNA序列,農桿菌通過侵染植物或真菌細胞，可將T-DNA插入到植物基因組中。
[0003]目前使用的雙元載體有pCAMBIA 系列(如 pCAMBIA1300)、pBHtl、pSN1301、PUN1301、PSN1301等。這些雙元載體一般含有大腸桿菌的DNA複製子和細菌篩選標記(如Amp>Kana>TET等抗性基因)，同時含有農桿菌的DNA複製子(如pVSl_origin、pVSl_REP等)和T-DNA序列。因而，這些雙元載體為大腸桿菌-農桿菌穿梭表達載體，可以在大腸桿菌和農桿菌內複製、增殖。但是目前所有這些雙元載體都不能在酵母細胞內複製、增殖。
[0004]用於轉化真菌或植物的DNA片段一般是由幾個小片段組成，進行DNA轉化時，通常是先將這些片段通過限制性內切酶酶切的方法插入到大腸桿菌體內的雙元載體中構建重組載體，然後從大腸桿菌提取重組載體DNA，轉化到農桿菌(如AGLl)體內，再轉化到植物或真菌細胞。`
[0005]上述載體構建方法不足之處在於，效率非常低、耗時長、不適於高通量的DNA轉化和基因敲除操作。
[0006]而酵母同源重組是一個高效、快速、而且適於高通量DNA轉化的載體構建方法。具有酵母複製子和酵母篩選標記的DNA載體可以用於DNA的同源重組。這些載體有PYES2、pYIP5、pPICZ、pRS426等等，其特點在於含有一個酵母DNA複製子(如2micro2_origin)、酵母篩選標記基因(如URA3、LEU2、HIS3等)，同時這些載體一般還含有大腸桿菌的DNA複製子和細菌篩選標記(如Amp.Kana.TET等抗性基因)。因而，這些酵母質粒為大腸桿菌-酵母穿梭表達載體，可以在酵母和大腸桿菌細胞內複製、增殖。
[0007]但是目前所有這些大腸桿菌-酵母穿梭表達載體都不能在農桿菌細胞內複製、增殖，因此不能直接用於農桿菌介導的DNA轉化過程。利用酵母同源重組法構建的DNA融合片段(基因表達序列、基因敲除結構等)需要從酵母質粒使用限制性內切酶切下目的DNA片段後，再插入大腸桿菌-農桿菌穿梭表達載體，然後用於農桿菌介導的DNA轉化。這使得載體構建的效率低下、不適於高通量的ATMT操作。
【發明內容】

[0008]本發明提供了一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，該穿梭表達載體能在大腸桿菌、農桿菌和酵母細胞內複製增殖，可用於向真菌或植物細胞進行高效、快速、高通量的DNA轉化。
[0009]一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，它為含有酵母DNA複製子和酵母篩選標記基因的雙元載體。
[0010]雙元載體是一種大腸桿菌-農桿菌穿梭載體，既有大腸桿菌複製起點又有農桿菌複製起點，本發明將酵母DNA複製子重組到雙元載體中，酵母DNA複製子的複製起點被酵母細胞的複製相關蛋白識別，從而使所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體獲得在酵母細胞中複製、增殖以及穩定存在的能力，用於進行高效、快速、高通量的DNA轉化。
[0011]作為優選，所述雙元載體為pCAMBIA系列載體、？8價1、？3附301或？^1301。作為進一步優選，所述雙元載體為pCAMBIA系列載體。作為最優選，所述雙元載體為pCAMBIA1300。
[0012]pCAMBIA1300質粒中含有大腸桿菌的DNA複製子pBR322_origin以及農桿菌的DNA複製子pVSl_origin和T-DNA序列，還含有Kana抗性基因，Kana抗性基因是大腸桿菌和農桿菌共同的篩選基因，可直接作為篩選標記，不必另外插入抗性基因。當然，根據需要也可將Kana抗性基因替換為Amp、Tet、Cmr和Spec抗性基因。
[0013]本發明中，所述酵母DNA複製子可選用2micro2_origin、25ym、ARSl、ARS3002或ARS3003。對酵母DNA複製子在所述雙元載體中的插入位置沒有特殊要求。
[0014]為便於該大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體在轉化酵母細胞後篩選轉化成功的菌落，所述大腸桿菌-酵母`-農桿菌穿梭表達載體還含有酵母篩選標記基因。作為優選，所述酵母篩選標記基因為 URA3、HI S3、LEU2、LYS2、TRP1、MET 15、ADE2 或 ADEI。
[0015]本發明所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體還包含H3啟動子和螢光蛋白基因，所述螢光蛋白基因可選用綠色螢光蛋白基因或紅色螢光蛋白基因，用於指示本發明大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體攜帶的目的基因是否在受體細胞中表達。
[0016]H3啟動子用於驅動螢光蛋白基因在受體細胞中表達，其鹼基序列如SEQ ID N0.1所示。螢光蛋白基因的啟動子可以根據受體細胞的種類而選擇，優選受體細胞自身含有的強啟動子。SEQ ID N0.2所示的鹼基序列是稻瘟病菌H3啟動子序列的一部分，稻瘟病菌H3啟動子序列是一個強啟動子，在稻瘟病菌的菌絲、孢子和附著胞階段都具有強啟動作用。利用H3啟動子啟動螢光蛋白基因表達作為負篩選標記，可以提高轉化子的篩選效率。
[0017]所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體的構建方法，包括:
[0018]先將H3啟動子序列和螢光蛋白基因依次插入所述植物雙元載體中，獲得初始重組載體；
[0019]再將酵母DNA複製子、酵母篩選基因和初始重組載體混合，轉化酵母細胞，經酵母同源重組後獲得所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體。
[0020]本發明還提供了含有所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體的重組菌株。所述重組菌株為酵母或大腸桿菌。
[0021 ] 本發明還提供了所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體在向真菌或植物細胞轉化DNA中的應用。利用該穿梭表達載體能夠實現含有目的基因的重組載體的快速構建、在真菌或植物細胞中的快速轉化以及突變體的高效篩選。[0022]具體地,所述應用包括:
[0023]( I)將目的基因與所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體一起轉化酵母細胞，經酵母同源重組獲得重組表達載體；
[0024](2)通過農桿菌介導轉化法將所述重組表達載體轉入真菌或植物細胞中，並在選擇性培養基上挑取轉化子。
[0025]當用於基因敲除時，從受體細胞基因組中克隆待敲除基因的上遊同源序列和下遊同源序列，將該上遊同源序列和下遊同源序列、適宜的抗性基因以及酶切過的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體混合，轉化酵母感受態細胞；經酵母同源重組獲得含有基因敲除結構(待敲除基因的上遊同源序列-抗性基因-待敲除基因的下遊同源序列)的基因敲除載體；將該基因敲除載體轉化農桿菌，然後經ATMT法轉化到受體細胞中，並在選擇性培養基上挑取轉化子；在螢光顯微鏡下，發螢光的轉化子為隨機插入的轉化子，不發螢光的轉化子為基因敲除突變體。
[0026]當用於基因表達時，克隆目的基因及其啟動子，或者僅克隆目的基因的編碼區、另外PCR克隆其他來源的合適的啟動子；然後將帶有啟動子的目的基因或者目的基因的編碼區和適宜啟動子、適宜的抗性基因以及酶切過的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體混合，轉化酵母感受態細胞；經酵母同源重組獲得含有目的基因的基因表達載體；將該基因表達載體轉化農桿菌，然後經ATMT法轉化到受體細胞中，並在選擇性培養基上挑取轉化子；提取轉化細胞(植物或真菌)的總蛋白，根據目的蛋白的特性，採用Western blot或酶活測定等方法鑑定目的基因是否表達及其表達量。
[0027]本發明的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體雖然都能用於向真菌或植物細胞中轉化DNA，但由於植物細胞的特殊性，致使DNA重組效率非常低，因此該大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體只能用於實現植物細胞中的基因表達，無法用於實現植物細胞中的基因敲除。`
[0028]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0029]本發明的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體是世界上首次報導的、可以同時在酵母、大腸桿菌和農桿菌內複製、增殖並穩定存在的質粒，該穿梭表達載體可以直接通過農桿菌介導的方式轉化真菌或植物細胞，縮短了基因操作的流程和時間，使用方便、工作效率高，且製備過程簡便、快速、高效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為pCAMBIA1300載體的質粒圖譜；
[0031]圖2為ρΚΟΙΑ載體的質粒圖譜；
[0032]圖3為ρΚΟΙΑ-RED載體的質粒圖譜；
[0033]圖4為ρΚΟΙΒ載體的質粒圖譜；
[0034]圖5為ρΚΟΙΒ-RED載體的質粒圖譜；
[0035]圖6為pK01B-HIS3載體的質粒圖譜；
[0036]圖7為pK01B-LEU2載體的質粒圖譜；
[0037]圖8為pK01B-LYS2載體的質粒圖譜；
[0038]圖9為ρΚΟΙΒ-TRPl載體的質粒圖譜；[0039]圖10為pK01B-MET15載體的質粒圖譜；
[0040]圖11為pK01B-ADE2載體的質粒圖譜；
[0041]圖12為ρΚΟΙΒ-ADEl載體的質粒圖譜；
[0042]圖13為使用綠色螢光標記篩選基因敲除突變體的結果圖；
[0043]圖14為對基因敲除突變體進行PCR驗證的電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0044]實施例1
[0045]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體ρΚΟΙΒ或ρΚΟΙΒ-RED的構建方法，包括:
[0046]I構建攜帶H3啟動子和螢光蛋白基因的大腸桿菌-農桿菌穿梭表達載體
[0047](I)獲取稻瘟病菌H3啟動子
[0048]以pKD5質粒為模板，利用引物al/a2進行高保真PCR擴增，獲取H3啟動子序列(長度為1.5kb)的部分序列(長度為1.2kb)，引物al/a2的鹼基序列如下:
[0049]h遊引物 a 1:5』-TTCTCGAGGTGTATTTTCTTTCTGCTCG-3』 (下劃線處為 Xho I 酶切位點)；
[0050]下遊引物a2:5，-TTGAATTCGGCCATTGTGATTGATTTGT-3，(下劃線處為 EcoRI 酶切位點)。`
[0051]PCR 反應體系為:pKMDNAlOng，高保真 DNA 聚合酶 0.5μ L，dNTP (50mM) 0.4μ L,上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0052]PCR反應條件為:94V 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，58°C I分鐘，72°C I分鐘20秒)，72°C 10分鐘。
[0053]PCR產物經瓊脂糖電泳，切下1.2kb大小的目的條帶，經膠回收純化，連接到PGEM-T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。
[0054]將酶切鑑定正確的Η3啟動子經Xho I和EcoR I雙酶切後插入pCAMBIA1300載體(如圖1所示)的Xho I和EcoR I位點之間，重組pCAMBIA1300載體經酶切驗證後命名為ρΚΟΙΟ。
[0055](2)插入綠色螢光蛋白基因
[0056]以pEGFP質粒為模板，利用引物bl/b2進行PCR擴增，獲取0.7kb的GFP基因片段，引物bl/b2的鹼基序列為:
[0057]上遊引物bl:5，-ATGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，(下劃線處為 EcoRI 酶切位點)；
[0058]下遊引物b2:5』 -ATGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3，(下劃線處為 Sac I 酶切位點)；
[0059]PCR 反應體系為:pEGFP DNAlOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0060]PCR 反應條件為:94 °C 3 分鐘，35 個循環(94 °C 30 秒，56 °C 30 秒，72 °C 40 秒)，72 °C 10 分鐘。
[0061]PCR產物經瓊脂糖電泳、膠回收純化後克隆到pGEM-T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。
[0062]酶切鑑定正確的重組pGEM-T載體用EcoR I和Sac I酶切，將酶切片段(GFP基因片段)插入ρΚΟΙΟ載體的EcoR I和Sac I位點之間；重組ρΚΟΙΟ載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定，將驗證正確的載體命名為ρΚΟΙΑ (如圖2所示)。
[0063](3)插入紅色突光蛋白基因
[0064]以pDsRED2質粒為模板，利用引物cl/c2進行PCR擴增，獲取0.7kb的DsRED2基因片段，引物Cl (上遊引物)/c2 (下遊引物)的鹼基序列為:
[0065]cl:5，-AAGAATTCATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3> ；
[0066]c2:5， -AAGAGCTCCAGGAACAGGTGGTGGCG-3，；
[0067]PCR 反應體系為:pDsRED2DNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0068]PCR 反應條件為:94 °C 3 分鐘，35 個循環(94 °C 30 秒，56 °C 30 秒，72 °C 40 秒)，72 0C 10 分鐘。
[0069]PCR產物經瓊脂糖電泳、膠回收純化後克隆到pGEM-T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。
[0070]酶切鑑定正確的重組`pGEM-T載體用EcoR I和Sac I酶切，將酶切片段(DsRED基因片段)插入ρΚΟΙΟ載體的EcoR I和Sac I位點之間；重組ρΚΟΙΟ載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定，將驗證正確的載體命名為ρΚΟΙΑ-RED (如圖3所示)。
[0071 ] 2構建大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體
[0072]以pYES2質粒為模板，利用引物dl/d2進行PCR擴增，獲取2.9kb的2micro2_origin和URA3基因的DNA片段，引物dl/d2的鹼基序列為:
[0073]上遊引物dl:5』 -GTATCGACGGAGCCGATTTTGAAA
[0074]CCGCGGGGAACAACACTCAACCCTA-3，(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0075]下遊引物也:5』 -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCA
[0076]CCGCGGTTCGATGTAACCCACTCG-3，(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0077]PCR 反應體系為:pYES2DNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0078]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94 °C 30秒，57 °C 30秒，72 °C 3分鐘)，72 0C 10 分鐘。
[0079]PCR產物經電泳驗證正確後，取4 μ L PCR產物和IOOng Sac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體或ρΚΟΙΑ-RED載體混合，使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞；
[0080]轉化酵母細胞塗在SC-URA篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-URA篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒；質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5ci，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將驗證正確的載體命名為ρΚΟΙΒ (如圖4所示)或ρΚΟΙΒ-RED (如圖5所示)。
[0081]實施例2
[0082]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體PK01B-HIS3的構建方法，包括:
[0083]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0084]2 構建 pK01B-HIS3
[0085](I)獲取 2micro2_origin DNA 片段
[0086]以pYES2質粒為模板，利用引物el/e2進行PCR擴增，獲取1.1kb的2micro2_originDNA片段,引物el/e2的鹼基序列為:
[0087]上遊引物e 1: 5 』 -GTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGG
[0088]GCTAGCTTTTCAATTCAATTCATC-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0089]下遊引物e2:5，-TTCGATGTAACCCACTCGTGCA-3，；
[0090]PCR 反應體系為:pYES2DNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0091]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分鐘10秒)，72°C 10分鐘。`
[0092]獲得的PCR產物(2micro2_origin DNA片段)經電泳驗證,並膠回收純化。
[0093](2)獲取HIS3基因片段
[0094]利用HIS3的PCR引物，從pTAL3_His載體經PCR獲得1.3kb長的HIS3基因的DNA片段，
[0095]上遊引物fl:5』 -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0096]CGAAGTTCGTATAAATACTTACTGACA-3』 ；
[0097]下遊引物f2:5 』 -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0098]CTTCATTCCGTAACTCTTCTACCT-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0099]PCR 反應體系為:pTAL3_His DNAIOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下遊引物各 0.5 μ L, IOx PCR 緩衝液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0100]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分鐘20秒)，72°C 10分鐘。
[0101]獲得的PCR產物(HIS3基因的DNA片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0102]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和HIS3基因片段)和IOOngSac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合,使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞。轉化酵母細胞塗在SC-HIS篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-HIS篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將驗證正確的載體命名為pK01B-HIS3(如圖6所示)。
[0103]實施例3
[0104]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體PK01B-LEU2的構建方法，包括:[0105]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0106]2 構建 pK01B-LEU2
[0107](I)根據實施例2步驟2- (I)的方法獲取2micro2_origin DNA片段；
[0108](2)獲取LEU2基因片段
[0109]以pTAL4_Leu質粒為模板，利用引物gl/g2進行PCR擴增，獲取2.2kb長的LEU2基因片段，引物gl/g2的喊基序列為:
[0110]上遊引物gl:5，-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0111]CGAATCATATAATTTCTGTTGAATTAC-3』 ；
[0112]下遊引物g2:5 』 -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0113]CGTCTACCCTATGAACATATTCCA-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0114]PCR 反應體系為:pTAL4_Leu DNAIOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下遊引物各 0.5 μ L, IOx PCR 緩衝液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0115]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 2分鐘20秒)，72°C 10分鐘。
[0116]獲得的PCR產物(LEU`2基因片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0117]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和LEU2基因片段)和IOOngSac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合,使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞；轉化酵母細胞塗在SC-LEU篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-LEU篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將驗證正確的載體命名為PK01B-LEU2(如圖7所示)。
[0118]實施例4
[0119]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體PK01B-LYS2的構建方法，包括:
[0120]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0121]2 構建 pK01B-LYS2
[0122](I)根據實施例2步驟2- (I)的方法獲取2micro2_origin DNA片段；
[0123](2)獲取LYS2基因片段
[0124]以pRS307質粒為模板，利用引物hl/h2進行PCR擴增，獲取5.0kb的LYS2基因片段；引物hl/h2的喊基序列為:
[0125]上遊引物h 1: 5 』 -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0126]CGAATCTCCTAATTCATATTTAATTATTGT-3』 ；
[0127]下遊引物h2:5 』 -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0128]GCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGC-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0129]PCR 反應體系為:pRS307DNA10ng，高保真 DNA 聚合酶(λ 5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0130]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 5分鐘10#),72°C 10 分鐘。
[0131]獲得的PCR產物(LYS2基因片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0132]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和LYS2基因片段)和IOOngSac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合,使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞。轉化酵母細胞塗在SC-LYS篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-LYS篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將驗證正確的載體命名為pK01B-LYS2(如圖8所示)。
[0133]實施例5
[0134]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體ρΚΟΙΒ-TRPl的構建方法，包括:
[0135]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0136]2 構建 pKOlB-TRPl
[0137](I)根據實施例2步驟2- (I)的方法獲取2micro2_origin DNA片段；
[0138](2)獲取TRPl基因片段
[0139]以pYES2.1-TRPl質粒為模板，利用引物il/i2進行PCR擴增，獲取1.6kb長的TRPl基因片段，引物il/i2的喊基序列為:`[0140]上遊引物i 1: 5，-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0141]CGAAGATGATCCACTAGTACGGATTAGA-3』 ；
[0142]下遊引物i 2:5 』 -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0143]TTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCA-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0144]PCR 反應體系為:pYES2.1-TRPlDNAlOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下遊引物各 0.5 μ L，IOx PCR 緩衝液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0145]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分鐘40#),72°C 10 分鐘。
[0146]獲得的PCR產物(TRP1基因片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0147]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和TRPl基因片段)和IOOngSac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合,使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞。轉化酵母細胞塗在SC-TRP篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-TRP篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將驗證正確的載體命名為ρΚΟΙΒ-TRPl (如圖9所示)。
[0148]實施例6
[0149]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體PK01B-MET15的構建方法，包括:
[0150]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0151]2 構建 pK01B-MET15
[0152](I)根據實施例2步驟2- (I)的方法獲取2micro2_origin DNA片段；[0153](2)獲取MET15基因片段
[0154]以PXP214質粒為模板，利用引物jl/j2進行PCR擴增，獲取1.7kb長的MET15基因片段，引物jl/j2的鹼基序列為:
[0155]上遊引物j 1: 5 』 -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCG
[0156]AAATCCCCGGGATAACTTCGTATA-3』 ；
[0157]下遊引物j2:5 『-ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0158]AGCTCGGTACCCGGGATAACTTCGT-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0159]PCR 反應體系為:pXP214DNA10ng，高保真 DNA 聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0160]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分鐘50秒)，72°C 10分鐘。
[0161]獲得的PCR產物(MET15基因片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0162]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和MET15基因片段)和IOOng Sac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合，使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyComp Transformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞。轉化酵母細胞塗在SC-MET篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-MET篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行`培養，提取質粒，測序鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為ΡΚ01Β-ΜΕΤ15 (如圖10所示)。
[0163]實施例7
[0164]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體PK01B-ADE2的構建方法，包括:
[0165]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0166]2 構建 pK01B-ADE2
[0167](I)根據實施例2步驟2- (I)的方法獲取2micro2_origin DNA片段；
[0168](2)獲取ADE2基因片段
[0169]以pRSII312質粒為模板，利用引物kl/k2進行PCR擴增，獲取2.3kb長的ADE2基因片段，引物kl/k2的鹼基序列為:
[0170]上遊引物kl:5，-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCG
[0171]AAGAATTAATTCTTGAATAATACAT-3』 ；
[0172]下遊引物k2:5 『 -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0173]TATGTATGAAATTCTTAAAAAAGG-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0174]PCR 反應體系為:pRSII312DNA10ng，高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下遊引物各 0.5 μ L, IOx PCR 緩衝液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0175]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 2分鐘20秒)，72°C 10分鐘。
[0176]獲得的PCR產物(ADE2基因片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0177]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和ADE2基因片段)和IOOngSac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合，使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞。轉化酵母細胞塗在SC-ADE篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-ADE篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為PK01B-ADE2(如圖11所示)。
[0178]實施例8
[0179]大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體ρΚΟΙΒ-ADEl的構建方法，包括:
[0180]I根據實施例1步驟1- (I) (2)的方法構建ρΚΟΙΑ載體；
[0181]2 構建 ρΚΟΙΒ-ADEl
[0182](I)根據實施例2步驟2- (I)的方法獲取2micro2_origin DNA片段；
[0183](2)獲取ADEl基因片段
[0184]以YCpADEl質粒為模板，利用引物11/12進行PCR擴增，獲取1.3kb長的ADEl基因片段，引物11/12的鹼基序列為:
[0185]上遊引物11:5 』 -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0186]CGACTTATTCACGAGTCAGTCTGACT-3』 ；
[0187]下遊引物12:5，-ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG`[0188]CGATAAAATTTGCTCTGAGAACAT-3』(下劃線處為 Sac II 酶切位點)；
[0189]PCR 反應體系為:YCpADElDNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下遊引物各0.5 μ L，IOx PCR緩衝液5 μ L，加水至50 μ L。
[0190]PCR反應條件為:94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分鐘20秒)，72°C 10分鐘。
[0191]獲得的PCR產物(ADE1基因片段)經電泳驗證，並膠回收純化。
[0192]各取4μ L上述2種PCR產物(2micro2_origin DNA片段和ADEl基因片段)和IOOngSac II酶切後的ρΚΟΙΑ載體混合,使用Invitrogen公司的商品化試劑盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)轉化釀酒酵母菌株FY834的感受態細胞。轉化酵母細胞塗在SC-ADE篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-ADE篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，測序鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為ρΚΟΙΒ-ADEl (如圖12所示)。
[0193]實施例9pK01B載體在稻瘟病菌基因敲除中的應用
[0194]I轉錄因子基因(MGG_01833)敲除載體的構建
[0195](I)以稻瘟病菌基因組DNA為模板，利用引物ml/m2進行PCR擴增，獲得MGG_01833基因的上遊片段，引物ml/m2的喊基序列為:
[0196]上遊引物序列ml:5』 -GCTGTACAAGTAAGAGCTCGGTACCCG
[0197]GGGATCGACGCCTTGGTCTGCCGTTGTTA-3』 ；
[0198]下遊引物序列m2:5』 -CCGGGAGATGTGGGGCACTGTGGCGTT
[0199]GGCACAATGAAAGGATCTGGGGCGAAGTG-3，；[0200](2)以稻瘟病菌基因組DNA為模板，利用弓丨物nl/n2進行PCR擴增，獲得MGG_01833基因的下遊片段，引物nl/n2的喊基序列為:
[0201]上遊引物序列nl:5』 -TTGATTATTGCACGGGAATTGCATGCTC
[0202]TCACATCTGAGCATGACAGCGCATAGCT-3，；
[0203]下遊引物序列n2:5』 -TTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCC
[0204]AGTCACATCCCAAGACACTCGGCAAAGG-3，；
[0205](3)以pBS-SUR質粒為模板，利用引物ol/o2進行PCR擴增，獲取SUR抗性基因片段，引物ol/o2的喊基序列為:
[0206]上遊引物ol:5，-GTGCCAACGCCACAGTGCC-3，；
[0207]下遊引物o2:5，-GTGAGAGCATGCAATTCCC-3，；
[0208]電泳驗證上述PCR產物是否正確。
[0209](4)使用Xba I和Hind III雙酶切ρΚΟΙΒ載體，取上述3種PCR產物各4 μ L和I μ L酶切過的ρΚΟΙΒ載體(100ng/l μ L)加入到50 μ L釀酒酵母FY834菌株的感受態細胞中，按照Invitrogen公司的試劑盒(S.c.EasyComp Transformation Kit)的步驟進行操作。轉化酵母細胞塗在SC-URA篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-URA篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，通過PCR (3對引物同上)和測序鑑定。將獲得的驗證正確的MGG_01833基因敲除載體命名為pK01B_MGG_01833。
`[0210]2ATMT 法轉化 pK01B-MGG_01833 到稻瘟病菌
[0211]將載體pK01B-MGG_01833通過凍融法轉化到農桿菌菌株AGLl，然後經ATMT法轉化稻瘟病菌萌發孢子中，具體步驟如下:
[0212](I)從新鮮培養的LB平板(含50mg/mL卡那黴素)上挑選一農桿菌單菌落接種於5mL LB液體培養基(含50mg/mL卡那黴素)，200rpm, 28 °C過夜培養；
[0213](2)第二天將200-400 μ L培養液轉移到5mL含50mg/mL卡那黴素的誘導液體培養基(頂)中，OD值約0.15，28°C培養5~6個小時使OD6tltl達到0.5~0.6 ；
[0214](3)稻瘟病菌分生孢子的收集:用IOmL滅菌蒸餾水從培養大約10天的CM平板上洗下稻瘟病菌的分生孢子，三層擦鏡紙過濾後用血球計數板計數，並用無菌水稀釋孢子濃度為IO6個/mL ；
[0215](4)取100 μ L培養好的農桿菌AGL-1 (含載體pK01B_MGG_01833)菌液和100 μ L稀釋好的稻瘟病菌分生孢子懸浮液混合，混合液(200 μ L)均勻塗於AIM平板上的硝酸纖維素膜表面，AIM平板含200 μ mol/L乙醯丁香酮,22°C共培養48小時；
[0216](5)將硝酸纖維素膜轉移到含真菌抗生素(磺胺嘧啶)與抗生素的選擇平板(DCM)上，選擇性培養基中含100 μ g/mL磺胺嘧啶、400mg/mL頭孢黴素、60mg/mL鏈黴素，將平皿置於28°C下培養到轉化子出現。將轉化子接種到含100 μ g/mL磺胺嘧啶DCM平板上再次鑑定。
[0217]3轉錄因子基因(MGG_01833)敲除突變體的鑑定
[0218]挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的轉化子在螢光顯微鏡下檢測，如果轉化子具有GFP基因表達的綠色螢光，則該轉化子為隨機插入的轉化子，丟棄；如果轉化子不發綠色螢光，則可能為基因敲除突變體，挑出並轉移到另一個含100 μ g/mL磺胺嘧啶DCM平板上繼續培養(圖13)。
[0219]然後用CTAB法提取不發綠色螢光的轉化子的基因組DNA ;通過雙重PCR檢測突變體中MGG_01833是否還存在:
[0220]使用的MGG_01833基因內部引物為:
[0221]上遊序列p1:5』 -GCATCTCAACGGCAGTATCT-3』 ；
[0222]下遊序列p2:5』 -ACCTGGCACAGCAAACAA-3』 ；
[0223]使用的beta-tubulin (陽性對照)基因引物為:
[0224]上遊序列ql:5，-TTCCGCGCTGTCACCGTTCC-3』 ；
[0225]下遊序列q2:5』 -GGGCCTCCTCCTCGTACTCCTCTT-3』。
[0226]PCR產物經過電泳後，如果具有2條電泳條帶，I條為400bp，另一條為540bp的條帶，則基因沒有被敲除；如果只有一條540bp的條帶，則基因被敲除了(圖14)。獲得的基因敲除突變體還可以繼續通過PCR、qPCR、Southern blot、Western blot等方法在DNA、mRNA或蛋白質水平上進一步驗證。
[0227]實施例ΙΟρΚΟΙΒ載體在稻瘟病菌的基因表達中的應用
[0228]以外源基因GFP基因在稻瘟病菌中的表達作為例子說明如何實現外源蛋白的表達。
[0229]1、GFP表達載體的構建
`[0230](I)以pCB1003質粒為模板，利用引物rl/r2進行PCR擴增，獲得1.4kb長的潮酶素抗性基因的DNA片段，引物rl/r2的鹼基序列為:
[0231]上遊引物序列rl:5』 -GCTGTACAAGTAAGAGCTCGGTACCCGG
[0232]GGATCTAGTGGAGGTCAACAATGAATG-3，；
[0233]下遊引物序列r2:5』 -TTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCC
[0234]AGTCACTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3』 ；
[0235]電泳驗證上述PCR產物是否正確。
[0236](2)使用Xba I和Hind III雙酶切ρΚΟΙΒ載體，取上述I種PCR產物4 μ L和I μ L酶切過的ρΚΟΙΒ載體(100ng/l μ L)加入到50 μ L釀酒酵母FY834菌株的感受態細胞中，按照Invitrogen公司的試劑盒(S.c.EasyComp Transformation Kit)的步驟進行操作。轉化酵母細胞塗在SC-URA篩選平板上，30°C培養3天；用無菌水洗取SC-URA篩選平板上的酵母細胞，使用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，質粒轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取卡那黴素LB平板上長出的菌落進行培養，提取質粒，通過PCR (I對引物同上)和測序鑑定。將獲得的驗證正確的GFP表達載體命名為ρΚΟΙΒ-ΗΡΗ。
[0237]2ATMT法轉化ρΚΟΙΒ-ΗΡΗ到稻瘟病菌
[0238]將載體ρΚΟΙΒ-ΗΡΗ通過凍融法轉化到農桿菌菌株AGLl，然後經ATMT法轉化稻瘟病菌萌發孢子中:
[0239](I) - (4)的具體步驟同實施例9的(I) 一(4)。
[0240](5)將硝酸纖維素膜轉移到含真菌抗生素(潮酶素)與細菌抗生素的選擇平板(CM)上，選擇性培養基中含200 μ g/mL潮酶素、400mg/mL頭孢黴素、60mg/mL鏈黴素，將平皿置於28°C下培養到轉化子出現。將轉化子接種到含200 μ g/mL磺胺嘧啶DCM平板上再次鑑定。
[0241]3轉基因突變體的蛋白表達鑑定[0242]挑取具有潮酶素抗性的轉化子在螢光顯微鏡下檢測，如果轉化子發綠色螢光，則說明GFP基因已經在稻瘟病菌內表達。獲得的GFP表達突變體還可以繼續通過RT-PCR和Western blot等方法在mRNA`或蛋白質水平上進一步驗證。
【權利要求】
1.一種大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，其特徵在於，它為含有酵母DNA複製子和酵母篩選標記基因的雙元載體。
2.如權利要求1所述的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，其特徵在於，所述雙元載體為 pCAMBIA 系列載體、pBHtl、pSN1301 或 pUN1301。
3.如權利要求2所述的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，其特徵在於，所述雙元載體為 pCAMBIA1300。
4.如權利要求1所述的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，其特徵在於，所述酵母DNA 複製子為 2micro2_origin、25 μ m、ARS1、ARS3002 或 ARS3003。
5.如權利要求1所述的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，其特徵在於，所述酵母篩選標記基因為 URA3、HI S3、LEU2、LYS2、TRP1、MET 15、ADE2 或 ADEI。
6.如權利要求1所述的大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體，其特徵在於，包含H3啟動子和螢光蛋白基因。
7.含有如權利要求1~6任一所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體的重組菌株。
8.如權利要求1~6任一所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體在向真菌或植物細胞轉化DNA中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，包括: (1)將目的基因與所述大腸桿菌-酵母-農桿菌穿梭表達載體一起轉化酵母細胞，經酵母同源重組獲得重組表達載體 ； (2)通過農桿菌介導轉化法將所述重組表達載體轉入真菌或植物細胞中，並在選擇性培養基上挑取轉化子。
【文檔編號】C12N1/21GK103497969SQ201310418433
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】盧建平, 曹惠娟, 張莉林, 林福呈 申請人:浙江大學