一種植物雙元雜交表達載體及其應用的製作方法
2023-05-09 18:02:46 1
專利名稱：一種植物雙元雜交表達載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域中一種植物雙元雜交表達載體及其應用，特別涉及一種植物雙元雜交表達載體，利用該植物雙元雜交表達載體進行植物轉基因雜交育種的方法和該植物雙元雜交表達載體在篩選啟動子和鑑定目的基因功能中的應用。
背景技術：
在酵母、昆蟲、植物以及哺乳動物等生物中，均存在一類轉錄激活因子(transcriptional activator)，能夠激活基因的轉錄。這類激活因子的結構都基本相似，由一個DNA結合區(結構域)(DNA-binding domain，DBD)和一個轉錄激活區(結構域)(transcriptional activation domain，AD)組成，可以同轉錄組分的操縱子結合併激活轉錄反應。其中酵母蛋白Gal4(Allen，L. Raymond F.(1984).Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae Gal4 gene.Molecular andCellular Biology 4，260-267；Johnston，M.(1987).A model fungal generegulation mechanismthe Gal4 genes of Saccharomyces Cerevisiae.Microbiol.Rev.1987，51，458-476)就是一個典型的轉錄激活因子，它由881個胺基酸組成，N端1-147位胺基酸含細胞核定位序列和與酵母啟動子上遊激活序列結合的結構域，它與酵母細胞啟動子上遊激活區序列結合；C端768-881位胺基酸含轉錄激活結構域，可激活起始轉錄。為增強轉錄激活因子激活轉錄的能力，常在DNA結合區加入一段負電荷蛋白(Giniger，E.，Varnum，S.M. Ptashne M.(1985).SpecificDNA binding of Gal4，appositive regulatory protein of yeast.Cell 40，767-774)。按照Ivan Sadowski(1988)的方法，可將從庖疹病毒中克隆的高酸性蛋白VP16(Dalrymple，M.A.，McGeoch，D.J.，Davison，A.J. Preston C.M.，DNA sequenceof the herpes simplex virus type I gene whose product is responsible fortranscriptional activation of immediate early promoters.Nucleic AcidsResearch，1984，13(21)，7865-7879)的基因與Gal4的DNA特異結合區(Gal4 DBD)構建成融合基因。在皰疹病毒中，VP16通過其末端胺基酸序列結合宿主編碼蛋白，該蛋白可以識別啟動子DNA序列，從而快速激活轉錄病毒早期表達基因(Triezenberg，S.J.，LaMarco，KL. McKnight，SL.，(1988).Evidence of DNAproteininteractions that mediate HSV-1 immediate early gene activation by VP16.GenesDevelopment.2，730-742；Preston，CM.，Frame，MC. Campbell，M.E.M.，(1988).A complex formed between cell components and an HSV structural polypeptidebinds to a viral immediate early gene regulatory DNA sequence.Cell 52，425-434)。研究表明，Gal4(DBD)-VPl6融合蛋白可以高效地激活目的基因的轉錄(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，Ptashne，M.，(1988).GAL4-VP16 isan unusually potent transcriptional actibator.Nature.335，563-4)。
多年來人們對這類轉錄因子做了大量深入的研究，並廣泛應用到酵母、昆蟲、動物細胞(Fischer，JA.，iniger，E.，Maniatis，T. Ptashne，M.(1988).GAL4 activatestranscription in Drosophila.Nature 332，853-856；Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，Ptashne，M.，(1988).GAL4-VP16 is an unusually potenttranscriptional actibator.Nature.335，563-564)以及植物體系(Wilde RJ.CookeSE，Brammar WJ.，et al，(1994).Control of gene expression in plant cells usinga VP16 chimeric protein.Plant Molecular Biology 24，381-388；Guyer，D.，Tuttle，A.，Rouse，S.，Volrath，S.，Johnson，M.，Potter，S.，Gorlach，J.，Goff，S.，Crossland，L.and Ward，E.，(1998).Actibation of Latent Transgenesin Arabidopsis Using a Hybrid Transcription Factor.Genetics，149，633-639)的研究中。利用轉錄激活因子的特點，人們建立了各種雙元雜交表達系統，比如現在廣泛應用的酵母雙雜交系統、動物細胞培養系統中的雙元表達體系等，能夠有效地在轉錄水平調節基因表達，研究目標基因的特性和功能。
在以往的研究中，人們更注重於將雙元表達系統用於理論研究，常常利用轉錄激活因子雙元雜交系統調控基因的特異性表達或表達水平，從而更容易地研究目的基因尤其是致死基因在生物體中的功能。
酵母HAP1(Heme Activator Protein 1)是另一個Gal4轉錄因子家族的成員，它有保守的Zn2Cys6集團。HAP1能夠結合許多基因的UASs(upstream activationsequences)區，並激活這些基因的轉錄。利用HAP1的DNA結合區和VP16構建融合蛋白(HAP1-VP16)同樣也能提高它在植物中表達效率和與UAS的結合能力(Hach A，HonT，Zhang L.The coiled coil dimerization element of the yeast transcriptionalactivator Hap1，a Gal4 family member，is dispensable for DNA binding butdifferentially affects transcriptional activation.Biol Chem 2000 Jan7；275(1)248-54.)。許多實驗證明它在植物中可以高效地激活與其調控元件UAS融合的目的基因的轉錄(Fred Berger，Jim Haseloff，John Schiefelbein and LiamDolan，Positional information in root epidermis is defined duringembryogenesis and acts in domains with strict boundaries.Current Biology8421-430，1998；G Cnops，X Wang，P Linstead，M Van Montagu，M VanLijsebettens，and L Dolan，Tornadol and tornado2 are required for thespecification of radial and circumferential pattern in the Arabidopsis root.Development 1273385-3394，2000)。
發明創造內容本發明的目的是提供一種植物雙元雜交表達載體。
本發明所提供的植物雙元雜交表達載體，由啟動子載體和功能基因表達載體組成；所述啟動子載體包括目的啟動子與轉錄激活因子編碼基因的融合序列；所述功能基因表達載體包括所述目的基因與所述轉錄激活因子的調控元件的融合序列。
所述目的啟動子可為組成型、誘導型或組織特異性表達啟動子。
所述轉錄激活因子可為具有與Gal4相同或相似功能的所有具有DNA結合結構域和轉錄激活結構域的轉錄激活因子如酵母的HAP1，酵母的GCN4，E.coli的LexA，HIV的tat等，以及其它具有相似轉錄激活活性功能的基因；優選為Gal4和HAP1轉錄激活因子，尤其優選為Gal4(DBD)-VP16和HAP1-VP16。
所述功能基因表達載體可包括一個目的基因或多個目的基因；在多基因表達載體中，串聯的每個基因的上遊都有Gal4的調控元件(Gal40P)或HAP1的調控元件(UAS)。
所述目的基因可以是任何可以利用的基因，如RDG基因。RDG基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。序列1由1631個鹼基組成。
所述功能基因表達載體和所述啟動子載體可含有相同或不同的篩選標記。
本發明的第二個目的是提供一種建立在植物雙元雜交表達載體之上，有效的植物轉基因雜交育種方法。
本發明所提供的植物轉基因雜交育種方法，包括以下步驟1)將所述功能基因表達載體和所述啟動子載體分別轉化植物，獲得獨立的父本和母本轉基因植株；2)所述父本和母本轉基因植株進行雜交，得到雜交後代。
父本既可以是被啟動子表達載體轉化的植株，也可以是被功能基因表達載體轉化的植株，母本也同樣，但優選為父本為被所述啟動子表達載體轉化的植株，母本為被所述功能基因表達載體轉化的植株。
所述功能基因表達載體和所述啟動子載體分別選用不同篩選標記基因(分別用於父本和母本)，在雜交後代中，通過篩選與母本不同的父本選擇標記即可快速選出雜交後代種子。
本發明的第三個目的是提供一種建立在植物雙元雜交表達載體基礎上的，較方便地篩選啟動子和鑑定目的基因功能的方法。
本發明提供的篩選啟動子的方法包括以下步驟1)將待鑑定啟動子及報告基因克隆到植物雙元雜交表達載體的啟動子載體中，得到啟動子檢測載體；2)利用啟動子檢測載體轉化植物或瞬間表達系統，並通過報告基因的表達來鑑定啟動子的功能。
pSGF和pSGG(物理圖譜如圖2)是有代表性的啟動子檢測載體。啟動子檢測載體可按照如下方法構建將轉錄因子相應的調控元件與報告基因(GUS或GFP)融合後與轉錄因子構建在同一載體中，在轉錄因子的上遊引入多克隆位點(HindIII，SpeI，KpnI)，將新克隆的啟動子插入到多克隆位點，在轉化植物或瞬間表達系統中通過檢測報告基因的表達鑑定啟動子功能。
本發明所提供的鑑定目的基因功能的方法，包括以下步驟1)將所述功能基因表達載體和所述啟動子載體分別轉化植物，獲得獨立的父本和母本轉基因植株；所述功能基因表達載體中的功能基因為待檢測基因；2)所述父本和母本轉基因植株進行雜交，得到轉基因雜交後代，觀察雜交後代，判定待檢測基因的功能。
為了更高效地研究不同啟動子和功能基因，可在所述啟動子檢測載體和所述功能基因表達載體中分別引入LR重組位點得到植物高效啟動子檢測載體，如pSGAF、pSGAG(如圖4)，和植物高效單基因表達載體，如pSZC，pSZN，pHUG-1，pKUG-1(如圖5)以及植物高效多基因表達載體，如pYLVS-LR、pYLSV-LR、pYLVUS-1，pYLSUV-1(如圖6)。這樣，將所有目的啟動子和功能基因分別克隆到含有LR重組位點的中間載體後，可以很容易地通過LR重組反應，將目的啟動子和基因分別克隆到所述雙元雜交表達載體中，從而提高了克隆效率，可以高通量地對啟動子和功能基因進行研究。
本發明的原理如圖1所示，雙元雜交表達載體由啟動子載體和功能基因表達載體組成將所述功能基因與轉錄因子Gal4/HAP1的調控元件(Gal40P/UAS)融合，構建成植物功能基因表達載體；將克隆的啟動子與轉錄激活因子的DNA結合區及轉錄激活區Gal4(DBD)-VP16/HAP1-VP16的基因片段融合構建成啟動子載體，為了能夠快速高效地檢測啟動子功能，在上述基本結構後面，加上了與Gal4調控元件融合的報告基因GUS或GFP序列。將啟動子載體和目的基因載體分別轉化植物，獲得轉基因親本，所轉入的目的基因在親本中不表達，不影響親本性狀。分別以獲得的啟動子和功能基因轉化植株為親本進行雜交，在雜交後代中，轉錄激活因子的DNA結合區與相應的調控元件結合，該轉錄因子的激活區便激活目的基因的轉錄，使目的基因在雜交後代中表達，從而確定目的基因的功能，最終獲得所需目的轉基因植物。
本發明在轉錄因子雙元表達調控思想的基礎上，巧妙地設計了相關的載體系統和選擇標記，將啟動子系統和功能基因分別克隆到雙元系統的兩個載體上，並分別轉化植物，然後，通過不同組合的雜交，高效率地研究目的啟動子和目的基因的功能，並通過父本選擇標記有效地篩選出雜交後代，使雙元雜交體系在作物育種和改良中的應用成為可能。
本發明利用雙元雜交表達載體分別轉化植物，以獲得獨立的父本和母本轉基因植物。分別以兩個不同轉化植株為親本進行雜交，在雜交後代中，轉錄因子的DNA結合區與調控元件(Gal40P或UAS)結合，該轉錄因子活性區能夠激活目的基因的轉錄，使目的基因在雜交後代中表達，從而表現目的基因的功能。在多基因表達載體中，串聯的每個基因的上遊都有Gal4/OP或UAS，因此，當雜交後轉錄因子可同時激活多個基因的表達，可以同時觀察不同目的基因在植物體內的相互作用。利用本方法對作物品種進行改良和育種，可以大大提高育種效率和成功率。
同時，將目的啟動子和功能基因分別轉入父本和母本植株中，啟動子和功能基因通過不同組合進行雜交，可高效快速地研究植物啟動子和基因的功能，避免重複轉化植物，縮短植物育種和改良品種的周期。
另外，雙元雜交表達載體選用不同篩選基因(分別用於父本和母本)，在雜交後代中，通過篩選與母本不同的父本選擇標記即可快速選出雜交後代種子，有效地選出具有優良性狀的雜交後代，完全去除來自母本自交的非雜交種子的汙染，有效地保證了雜交良種的純度，從而大大提高育種效率，很好地解決了雜交育種中非雜交種子混雜影響種子質量與純度的問題。
本發明首次將水稻矮化基因(水稻赤黴素突變基因)轉化擬南芥或水稻，與啟動子轉化的擬南芥或水稻株系雜交後，後代出現了矮化現象(圖9)，證明了該雙元雜交系統在植物體系中是可以應用的；而且，通過該雙元雜交表達載體，可以對植物的品質和特性定向地進行改良。利用本發明的技術，水稻矮化基因使雜交後代植株株高變矮，在分子水平上克服了植物雜種優勢中植株過高而易倒伏的缺點，將促進雜交育種技術的應用。
本發明的雙元雜交表達載體可應用於水稻雜交育種的研究及水稻啟動子和功能基因的研究。特別是隨著水稻全基因組晶片研究的展開，使在短期內克隆一系列可誘導或可特異表達的啟動子以及重要基因成為可能，結合雙元雜交表達系統將這些新克隆的啟動子和功能基因引入目前普遍應用的水稻母本和父本中，不僅可以快速研究啟動子和基因的功能，而且還可以將已鑑定的啟動子和功能基因通過不同的組合直接應用到雜交水稻中，結合大田雜交育種技術，對作物進行定向改造，加快改良水稻品種速度，縮短育種周期。
通過本發明的方法，可以實現在分子水平上對植物的性狀進行設計，即基於雜交技術的植物性狀的分子設計；可以充分利用功能基因資源，跨越普通雜交育種的種間障礙，體現分子水平上育種的優勢。該方法在植物功能基因組研究以及作物分子育種等方面有廣闊的應用前景。
圖1為使用雙元雜交表達載體進行植物轉基因雜交育種方法的原理示意2為啟動子檢測載體pSGF和pSGG的物理圖譜圖3為玉米Ubiquitin啟動子(UP)檢測載體pSGPG及其報告基因GFP或GUS在UP的調控下在洋蔥表皮細胞中的表達。
圖4為植物高效啟動子檢測載體pSGAG和pSGAF圖5為植物高效單基因表達載體pSZC、pSZN、pHUG-1和pKUG-1的結構圖譜圖6為植物高效多基因表達載體pYLVSR-LR、pYLSVR-LR、pYLVUS-1和pYLSUV-1的結構圖譜圖7為RDG部分胺基酸序列及5』端突變示意8為含RDG基因的雙元雜交表達載體pSBR23和pSHR6的結構圖譜圖9A為轉化植株雜交得到的後代—擬南芥圖9B為轉化植株雜交得到的後代—水稻圖10為擬南芥雜交後代Northern-blotting檢測結果圖11為Gal4 DBD-VP16轉化擬南芥(父本)Western檢測結果圖12為RT-PCR法檢測水稻雜交後代的基因表達具體實施方式
實施例1、幾種植物表達載體的構建1、啟動子檢測載體的構建以穿梭載體pBI121為基本載體，按常規方法在轉基因區RB和LB之間加入啟動子Pnos，潮黴素基因aphIV和基因的終止子Tnos，隨後的HindIII，SpeI，KpnI位點是被檢測的啟動子的插入位點，在該啟動子插入位點下遊是Gal4(DBD)和VP16的融合基因序列GVP16及其終止子Tnos，再下遊則是報告基因的表達區，包括Gal4的調控元件，報告基因GUS或GFP序列及其終止子Tnos，結果如圖2所示，構建了含報告基因GUS序列的啟動子檢測載體pSGG和含GFP序列的啟動子檢測載體pSGF。其中，載體的選擇標記基因為潮黴素基因aphIV(植物)和卡那黴素基因(細菌)。
該結構轉入植物後，在被檢測啟動子的作用下表達的GVP16轉錄因子與其調控元件結合調控報告基因的表達(圖3)，通過觀察報告基因的表達，可推測出啟動子的功能。
為了高效率地檢測不同的啟動子，通過PCR擴增載體pDEST14(Invitrogen公司產品)上含有LR重組位點的片段(attR1-Cmr-ccdB-attR2)並在兩端分別引入酶切位點HindIII和KpnI，酶切回收後，插入到上述啟動子檢測載體pSGG和pSGF的多克隆位點HindIII和KpnI之間，構建成植物高效啟動子檢測載體pSGAG和pSGAF，如圖4所示，其中，Cmr為氯黴素篩選基因。該載體可以方便快捷地利用LR重組反應將克隆在中間載體的啟動子轉入到啟動子檢測載體中。
2、植物單基因高效表達系統載體的構建利用穿梭載體pZP222，通過HindIII和XbaI位點將Gal40P/TATA順序插入到多克隆位點，再利用KpnI和EcoI將Tnos插入。TMVΩ-attR1-Cmr-ccdB-attR2-9xMyc-6xHis-2xIgG binding domain片段(見序列2)則是通過KpnI位點和鈍化的XbaI位點克隆到該載體中，構建成C端有多肽及抗原標記的載體pSZC(如圖5)。其中9xMyc，6xHis為多肽標籤，表達後的Myc或His多肽可與相應的抗體結合，用於鑑定表達的目的基因，而2xIgG binding domain可與抗體IgG結合，更便於蛋白質的分離。TMVΩ為轉錄增強子，ccdB基因的表達會使普通的大腸桿菌致死，而大腸桿菌DB3.1則可正常存活。該基因的加入可以將未發生LR重組反應的載體在普通大腸桿菌中篩除。pSZN的構建與pSZC相似，除了以TMVΩ-2xIgG bindingdomain-6xHis-9xMyc-attR1-Cmr-ccdB-attR2片段替換TMVΩ-attR1-Cmr-ccdB-attR2-9xMyc-6xHis-2xIgG binding domain(參考序列2，兩個片段元件序列相同，元件順序變化)片段外，其它方法相同(如圖5)。
通過PCR方法從pBHG載體中擴增UAS-1片段(pBHG載體中包含HAP1和UAS-1元件，該載體的母體為pPZP200。Hajdukiewicz P.Plant Mol.Biol.25，989-994；KimKS，Guarente L.Nature 342(6246)200-203)，並在兩端引入SacI和SpeI位點，插入到pKOS和pHOS(pKOS和pHOS是以pPZP200為母體改造而成)上相應酶切位點，構建成pHUG-1，pKUG-1載體(如圖5)。
3、植物多基因高效表達載體的構建利用ClaI和KpnI位點，將pSZC的Gal4/0P和TMVΩ-attR1-Cmr-ccdB-attR2-9xMyc-6xHis-2xIgGbinding domain片段克隆到Li Lin等構建的植物多基因表達載體系統中的供體載體pYLVS和pYLSV(Lin，L.，Liu，YG.，Xu，XP. Li，BJ.(2003).Efficientlinking and transfer of multiple genes by a multigene assembly andtransformation vector system.PNAS，100(10)5962-5967)中，如圖6所示，得到植物多基因高效表達載體pYLVS-LR和pYLSV-LR。通過LoxP位點重組反應，逐一將不同的功能基因克隆到受體載體pYLTAC747(Lin，L.，Liu，YG.，Xu，XP.Li，BJ.(2003).Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system.PNAS，100(10)5962-5967)上，然後可同時轉入植物體，觀察不同基因的相互作用。利用該載體，可以同時將串連的多個功能基因同時轉入植物體內，不必作多次轉入便可以觀察到植物體內不同基因的相互作用。
利用同樣的原理，以pYLVS為母體，在SacI和EcoRI位點間插入UAS-1，在KpnI和ApaI位點間插入attR1-CmR-ccdB-attR2-T35S，得到pYLVUS-1；同時，以pYLSV為母體，在SacI和EcoRI位點間插入UAS-1，在KpnI和ApaI位點間插入attR1-CmR-ccdB-attR2-T35S，得到pYLSUV-1。UAS-1來源於pBHG，長160bp；attR1-CmR-ccdB-attR2-T35S來源於pHOS。由此，我們將HAP1的調控元件UAS和LR重組位點分別構建到載體pYLVS和pYLSV中，構建成多基因表達載體pYLVUS-1和pYLSUV-1載體(如圖6)。
實施例2、Ubiquitin啟動子檢測載體的構建及其功能檢測將玉米Ubiquitin啟動子克隆到含報告基因GUS序列的啟動子檢測載體pSGG或含GFP序列的啟動子檢測載體pSGF中，得到載體pSGPG(圖3)。載體pSGPG包含有Gal4 0P/TATA和報告基因(GUS或GFP)以及Gal4 DBD-VP16融合基因。利用BIO-RAD公司Model PDS-1000/He Biolistic particle delivery system將載體pSGPG轉化洋蔥表皮細胞。轉化所採用的參數為真空度為28 inches·Hg、轟擊距離9cm、氦氣壓力為1，100psi、金粉顆粒直徑1.0μm。轟擊後的洋蔥表皮於22℃培養過夜，進行GUS染色(Kim MK，Choi JW，Jeon JH，et al.(2002).Specimen block counter-stainingfor localization of GUS expression in transgenic arabidopsis and tobacco.Plant Cell Rep.21(1)，35-9)。
培養24小時後進行GUS染色觀察GUS的表達或用螢光顯微鏡觀察GFP的表達。結果如圖3所示，觀察到GUS和GFP基因的表達，表明利用啟動子檢測載體分析新克隆啟動子是可行的。
實施例3、轉基因雜交法培育矮化擬南芥和矮化雜交水稻1、植物材料及生長條件野生型擬南芥菜品種(Arabidopsis thaliana，)為哥倫比亞生態型(Columbiaecotype)。擬南芥菜種子經表面消毒(Ang，L.H.and Deng，X.W.(1994).Regulatoryhierarchy of photomorphogenic lociallele-specific and light-dependentinteraction between the HY5 and COP1 loci.Plant Cell，6，613-628)後，放於MS(1％蔗糖)培養基上(Murashige，T.，and Skoog，F.(1962).A revised mediumfor rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.Plant.15，473-497)，於4℃放置4天，移至長日照生長箱中在22℃條件下培養8天後，幼苗被轉入土中，在長日照生長室中生長。
用於分離基因的水稻品種為9311，種子經表面消毒後放於MS(3％蔗糖)培養基上，取生長10天的幼苗為材料提取總RNA。
用於轉基因的水稻栽培品種為龍特甫(Japonica rice variety Longtefu)和華恢7號(Japonica rice variety Huahui7)。經消毒後誘導愈傷組織(Y.Hiei，T.Komari，T.Kubo，Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens，PlantMol.Biol.35(1997)205-218)，用於基因轉化。
2、水稻矮化基因(RDG)的克隆及其載體構建(1)水稻矮化基因(RDG)的克隆為進一步檢測該植物轉基因雜交育種方法在植物系統中的可行性，根據擬南芥菜和小麥等植物基因序列(Peng，J.(1997).The arabidopsis GAI gene defines asignaling pathway that negatively regulates gibberellin responses.GenesDevelopment，11，3194-3205；Peng，J.Richards，D.et al，(1999).『GreenRevolution』genes encode mutant gibberellin response modulators.Nature 400，256-261；Fujioka，S.et al.(1988).The dominant non-gibberellin-respondingdwarf mutant(D8)of maize accumulates native gibberellins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，9031-9035)，在水稻資料庫中找到與赤黴素代謝相關RGA基因，該基因編碼520個胺基酸。根據該序列，將包括5』非編碼區到V84為止的330bp核苷酸敲除，獲得突變基因，突變後的基因以M106為起始密碼子，將此突變基因命名為RDG(具有序列表中序列1的核苷酸序列)。
提取水稻總RNA(參見Qiagen公司RNA提取方法)，進行反轉錄，以反轉錄cDNA為摸板，以引物1CTAGATCGTGTCGCACCTGGCCACGG，引物2CACGTGGACTAGT GTCCCAAAAAC為引物進行PCR擴增，PCR產物被克隆到TOPO載體中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，進行序列測定，結果表明得到RDG基因片段。
(2)雙元雜交表達載體的構建該RDG基因片段中含有XbaI和SpeI位點，酶切消化後與Gal40P/TATA連接構建到pBIl21載體(美國Clonetech公司產品)中，得到RDG功能基因表達載體pSBR23(圖8)。將玉米Ubiquitin啟動子通過HindIII和BamHI位點與Gal4 DBD-VP16連接構建到pBI121載體(美國Clonetech公司產品)中，得到啟動子載體pSHR6(圖8)。載體pSBR23包含有Gal40P/TATA和RDG，轉化植物以除草劑(PPT 15mg/L)為篩選標記。載體pSHR6包含有Ubiquitin啟動子調控的Gal4DBD-VP16融合基因，轉化植物以潮黴素(Hyg 20mg/L)為篩選標記。
3、植物轉化載體pSBR23和pSHR6參照擬南芥菜轉化方法(Wang，X.，Kang，D.，Feng S.etal，(2002).CSN1 N-terminal-dependent activity is required for Arabidopsisdevelopment but not for Rubl/Nedd8 deconjugation of cullinsAstructure-function study of CSN1 subunit of COP9 signalosome.Mol.Biol.Cell13，646-655)分別轉化擬南芥菜；參照水稻轉化方法(Y.Hiei，T.Komari，T.Kubo，Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens，Plant Mol.Biol.35(1997)205-218)分別轉化水稻栽培品種龍特甫和華恢7號；轉化植株分別以潮黴素(20mg/L)和除草劑(15mg/L)篩選，獲得第一代轉化植株。
4、Gal4 DBD-VP16轉化擬南芥植株蛋白提取及Western檢測取pSHR6轉化的第一代擬南芥植株組織研磨後加入蛋白提取液(50mM Tris-HCl，pH7.4、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10％甘油、1mM DTT、1mM PMSF、1×蛋白酶抑制劑(Roche，Basel，Switzerland)，提取物在4℃離心10min，吸取上清，再重複離心一次。利用Bradford assay(Bio-Rad)進行蛋白濃度定量。取15％SDS-PAGE膠濃度電泳，轉膜，Gal4 DBD抗血清(Santa Cruz生物技術公司)和二抗抗鼠IgG(Sigma公司)分別按照1∶2000和1∶5000稀釋，進行Western檢測。檢測結果如圖11所示，表明pSHR6(含有Gal4 DBD-VP16融合基因)轉化植株在18KDa處有特異蛋白的表達，而野生型植株沒有特異條帶出現，取檢測陽性植株進行植物雜交。圖11中，1為蛋白分子量標準，2為野生型負對照，3-6為Gal4 DBD-VP16轉化植株。
5、雜交取51株pSBR23轉化的第一代擬南芥植株為母本，以步驟4鑑定的45株pSHR6轉化的第一代擬南芥陽性植株為父本進行植物雜交，獲得51組雜交後代種子。雜交種子在含有潮黴素平板上篩選，10天後將抗性幼苗移入土中，22℃長日照生長室生長至成熟植株。結果如圖9A所示，表明抗性雜交後代植株明顯比母本和父本表型矮化，圖9A中，左側植株為母本，右側植株為父本，中間植株為擬南芥雜交後代。
將兩載體pSBR23和pSHR6分別轉化水稻栽培品種龍特甫和華恢7號，獲得第一代轉化植株，以轉化pSHR6的龍特甫為母本，以轉化pSBR23的華恢7號為父本進行雜交，獲得一組雜交後代種子。雜交水稻種子在田間生長至抽穗期，根據水稻不同品種的麥芒特徵去除非雜交後代(因雜交種子在常規田間發芽時不適合用抗生素篩選，而且該實驗所選擇的水稻品種麥芒特徵明顯)，待水稻抽穗後測量株高，同時以未轉入基因的龍特甫和華恢7號雜交後代作參照。結果如圖9B所示，轉基因雜交後代明顯比非轉基因的雜交後代植株矮。圖9B中從左至右的順序為龍特甫，轉基因水稻的雜交後代，非轉基因水稻的雜交後代，華恢7號。分別轉入RDG和啟動子的父本和母本的生長狀況同非轉基因的水稻相似，且所有統計及拍照植株樣品均生長在同一田塊中。
按照上述步驟1-4的方法進行的其它水稻品種(秀水，中花11，龍特甫)之間相互雜交的雜交結果也證明了該技術方法的可行性。
6、雜交擬南芥植株Northern檢測雜交後代擬南芥植株葉片在液氮中研磨，參照RNeasy kit(Qiagen，Valencia，CA)方法提取RNA。電泳後轉膜，以雜交母本為對照，RDG為探針，取抗性植株葉片進行Northern檢測，檢測結果如圖10所示，表明雜交後代有RDG轉錄。圖10中，1-4為雜交後代，5為RDG轉化植株(母本)。
7、雜交水稻植株的RT-PCR檢測雜交後代水稻植株葉片在液氮中研磨，參照RNeasy kit(Qiagen，Valencia，CA)方法提取RNA。以5』CCACTTCTACGAGTCCTGCC 3』和5』CTGTTTGTAGGCATTGGAGC 3』為突變的水稻矮化基因(RDG)的引物，以RT-PCR法檢測雜交後代中RDG基因的表達，檢測結果如圖12，表明矮化的雜交後代(2號，5號)中RDG的表達可以被檢測到，而高的雜交後代(1號，3號，4號)中沒有檢測到RDG基因，4號樣品中擴增出的小片段為非特異性條帶。圖12中，1-5為雜交後代植株，6為非轉基因水稻龍特甫(陰性對照)，7為RDG基因的PCR產物(陽性對照)。
8、植物雜交結果的分析在雜交擬南芥的51組雜交後代種子中，經篩選，有2組未獲得抗性植株，在49組抗性植株中，雜交後代表型矮化率為0％有4組；矮化率在20-59％有9組；矮化率在60-79％有19組；矮化率在80-99％有16組；矮化率在100％有1組(見表1)。出現雜交後代表型不均一的原因是在植物轉化時，基因隨機插入，基因插入位點不同表達不同，由於母本中的矮化基因處於未轉錄狀態，因此無法在RNA和蛋白水平檢測其表達情況，雜交時只能採取隨機抽取的方法，雜交結果中出現的雜交無矮化表型，可能是因為母本基因插入位點不同產生基因沉默，所以在雜交結果中會出現0矮化率；矮化率為20-99％是因為為儘快檢測雙元雜交體系的可行性，在實驗中，選用了第一代轉化植株分別為母本和父本，由於未得到純合子，若轉化植株外源基因拷貝數不同時，在雜交後代中會出現後代分離，所以使在同一母本和父本雜交後代中出現有的表現矮化，有的無矮化表型。
水稻不同品種的雜交後代出現明顯的雜種優勢，雜交後代的株高明顯高於親本，這種株高過高的現象將影響作物的抗逆性。本發明將水稻矮化基因載體和啟動子載體分別轉化龍特甫、中花11、秀水、華恢7號等水稻栽培品種，應用第一代轉基因植物進行不同組合的雜交，雜交後代中出現一些矮化植株。根據雜交組合的特點和雜種後代麥芒的表型特徵分辨出是否雜交稻，然後測量株高，統計雜交後代中的矮化植株的比例約為18.6％(表2)。由於用於雜交的親本是轉基因水稻的T1代，為雜合體，雜交後代會出現分離，所以同時包含兩個轉化基因的植株比例應為25％，實際比例低於25％的理論值，是由於轉入的外源基因並非都有表達，有些因在植物基因組中的插入位點或其它調控因素不能表達。在分子水平上檢測轉化基因的表達結果也證明這個問題(圖12)。
以上結果證明了將雙元雜交系統引入植物雜交體系是切實可行，而且可在短期內快速且大量地檢測新克隆的啟動子和基因的功能。而且利用這個系統和水稻矮化基因可以改變雜交後代的株高，使雜交水稻的株高同親本相似，從而在保證其它雜種優勢的同時，減低株高，增強抗倒伏能力。這個特性在農業生產實踐中很有應用價值。
表1.以第一代轉基因擬南芥植物為親本雜交結果統計
表2.雜交水稻(龍特甫×華恢7號)後代植株的株高
序列表160221012111631212DNA213人工序列220
223
4001tcgtgtcgca cctggccacg gacaccgtgc actacaaccc ctcggacctc tcctcctggg60tcgagagcat gctttccgag ctcaacgcgc cgctgccccc tatcccgcca gcgccgccgg120ctgcccgcca tgcttccacc tcgtccactg tcaccggcgg cggtggtagc ggcttctttg180aactcccagc cgctgccgac tcgtcgagta gcacctacgc cctcaggccg atctccttac240cggtggtggc gacggctgac ccgtcggctg ctgactcggc gagggacacc aagcggatgc300gcactggcgg cggcagcacg tcgtcgtcct catcgtcgtc ttcctctctg ggcggtgggg360cctcgcgggg ctctgtggtg gaggctgctc cgccggcgac gcaaggggcc gcggcggcga420atgcgcccgc cgtgccggtt gtggtggttg acacgcagga ggctgggatc cggctggtgc480acgcgttgct ggcgtgcgcg gaggccgtgc agcaggagaa cttcgcggcc gcggaggcgc540tggtcaagca gatccccacg ctggccgcgt cccagggcgg cgccatgcgc aaggtcgctg600cctacttcgg cgaggccctc gcccgccgcg tgtaccgctt ccgccccgcg gacagcaccc660tcctcgacgc cgccttcgcc gaccttctgc acgcccactt ctacgagtcc tgcccctacc720tcaagttcgc ccacttcacc gcaaatcaag ccatcctcga ggctttcgcc ggctgccacc780gcgtccacgt cgtcgacttc ggcatcaagc aggggatgca atggccagct ctcctccagg840ccctcgccct tcgtcccggc ggccccccat cgttccgcct caccggcgtc ggccccccgc900agccggacga gaccgacgcc ttgcagcagg tgggttggaa gcttgcccag ttcgcgcaca960ccattcgcgt cgacttccag taccggggac tcgtcgccgc cactctcgcg gacttggagc1020cgttcatgct gcagccggag ggcgaggcgg acgcgaacga ggagcctgag gtgatcgccg1080tcaactcggt gttcgagctg caccggctgc tcgcgcagcc cggcgcgctg gagaaggtcc1140tgggcacggt gcacgcggtg cggccaagga tcgtcaccgt ggtagagcag gaggccaacc1200acaactccgg ctcattcctc gaccggttca ccgagtcgct gcactactac tccaccatgt1260tcgattccct cgagggcggc agctccggcc aggccgagct ctctccgccg gctgccgggg1320gcggcggtgg cacggaccag gtcatgtccg aggtgtacct cggccggcag atctgcaacg1380tcgtggcgtg cgagggcgcg gagcgcacgg agcgccacga gacgctgggg cagtggcgca1440
accgcctcgg ccgcgccggc ttcgagcccg tgcacctggg ctccaatgcc tacaaacagg1500cgagcacgct cctcgcgctt ttcgccggcg gcgacggcta ccgggtggag gagaaggagg1560gctgcctcac gctgggctgg cacacgcgcc cgctcatcgc cacctcggca tggcgcgtcg1620ccgcggcgtg a 163121022113405212DNA213人工序列220
223
4002cgaatccaag cttcgtaccc tccgctcgga ggacagtact ccgctcggag gacagtactc60cgctcggagg acagtactcc gctcggagga cagtactccg ctcgaggaca gtactccgct120cggaggacag tactccgctc ggaggacagt actccggggg atcctctagc ccactatcct180tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgcttctag240acgcggtacc ggtctagagt atttttacaa caattaccaa caacaacaaa caacaaacaa300cattacaatt actatttaca attacaagtt tgtacaaaaa agctgaacga gaaacgtaaa360atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact420gtaaaacaca acatatccag tcactatggc ggccgcgggt gatgctgcca acttagcggc480cgctaagttg gcagcatcac ccgacgcact ttgcgccgaa taaatacctg tgacggaaga540tcacttcgca gaataaataa atcctggtgt ccctgttgat accgggaagc cctgggccaa600cttttggcga aaatgagacg ttgatcggca cgtaagaggt tccaactttc accataatga660aataagatca ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga ttttcaggag ctaaggaagc720taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcecaat ggcatcgtaa780agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct840ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt900tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga960cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac1020tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat1080atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat1140tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa1200cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca1260aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt1320ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc1380
gtaatctaga ggatccggct taetaaaagc cagataacag tatgcgtatt tgcgcgctga1440tttttgcggt ataagaatat atactgatat gtatacccga agtatgtcaa aaagaggtgt1500gctatgaagc agcgtattac agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt gctcaaggca1560tatatgatgt caatatctcc ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa gcccgtcgtc1620tgcgtgccga acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta1680ttgaaatgaa cggctctttt gctgacgaga acagggactg gtgaaatgca gtttaaggtt1740tacacctata aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt1800gacacgcccg ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa1860gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc1920accgatatgg ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac1980cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc2040tccgttatac acagccagtc tgcaggtcga ccatagtgac tggatatgtt gtgttttaca2100gtattatgta gtctgttttt tatgcaaaat ctaatttaat atattgatat ttatatcatt2160ttacgtttct cgttcagctt tcttgtacaa agtggttgag ctcaagcttg cgggccgctc2220tagaactagt ggtgaacaaa agttgatttc tgaagaagat ttgaacggtg aacaaaagct2280aatctccgag gaagacttga acggtgaaca aaaattaatc tcagaagaag acttgaacgg2340atcctctaga ggtgaacaaa agttgatttc tgaagaagat ttgaacggtg aacaaaagct2400aatctccgag gaagacttga acggtgaaca aaaattaatc tcagaagaag acttgaacgg2460atcctctaga ggtgaacaaa agttgatttc tgaagaagat ttgaacggtg aacaaaagct2520aatctccgag gaagacttga acggtgaaca aaaattaatc tcagaagaag acttgaacgg2580atccactagt ggatcccccg ggctgcagcc tagggattac gatatcccaa cgaccgccag2640tcatcaccat caccatcacc tggaagttct gttccagggg cccgagctta agacggccgc2700cctagcgcaa cacgatgaag ccgtagacaa caaattcaac aaagaacaac aaaacgcgtt2760ctatgagatc ttacatttac ctaacttaaa cgaagaacaa cgaaacgcct tcatccaaag2820tttaaaagat gacccaagcc aaagcgctaa ccttttagca gaagctaaaa agctaaatga2880tgctcaggcg ccgaaagtag acaacaaatt caacaaagaa caacaaaacg cgttctatga2940gatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgaaac gccttcatcc aaagtttaaa3000agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct aaaaagctaa atgatgctca3060ggcgccgaaa gtagacgcga attcgagctc ggtatgatcc tagaggacgt ctcgaggtac3120cgcccgggcg agctcggaax xxgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt3180gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca3240tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt3300cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa3360attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcxxxxg aattc340權利要求
1.一種植物雙元雜交表達載體，由啟動子載體和功能基因表達載體組成；所述啟動子載體包括目的啟動子與轉錄激活因子編碼基因的融合序列；所述功能基因表達載體包括所述目的基因與所述轉錄激活因子的調控元件的融合序列。
2.根據權利要求1所述的雙元雜交表達載體，其特徵在於所述轉錄激活因子為Gal4，HAP1，E.coli的LexA，HIV的tat，Gal4(DBD)-VP16或HAP1-VP16。
3.根據權利要求1或2所述的雙元雜交表達載體，其特徵在於所述目的基因為一個或多個。
4.根據權利要求3所述的雙元雜交表達載體，其特徵在於所述目的基因為RDG基因。
5.一種利用權利要求1-4任一所述的植物雙元雜交表達載體進行植物轉基因雜交育種的方法，包括以下步驟1)將所述功能基因表達載體和所述啟動子載體分別轉化植物，獲得獨立的父本和母本轉基因植株；2)所述父本和母本轉基因植株進行雜交，得到轉基因雜交後代。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述父本為被所述啟動子載體轉化的植株，所述母本為被所述功能基因表達載體轉化的植株。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述功能基因表達載體和所述啟動子載體分別選用不同篩選標記基因。
8.一種利用權利要求1-4任一所述的植物雙元雜交表達載體鑑定啟動子功能的方法，包括以下步驟1)將待鑑定啟動子及報告基因克隆到植物雙元雜交表達載體的啟動子載體中，得到啟動子檢測載體；2)利用啟動子檢測載體轉化植物或瞬間表達系統，並通過報告基因的表達來鑑定啟動子的功能。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述啟動子檢測載體中引入LR重組位點得到植物高效啟動子檢測載體。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述植物高效啟動子檢測載體為pSGAF或pSGAG。
11.一種利用權利要求1-4任一所述的植物雙元雜交表達載體判定基因功能的方法，包括以下步驟1)將所述功能基因表達載體和所述啟動子載體分別轉化植物，獲得獨立的父本和母本轉基因植株；所述功能基因表達載體中的功能基因為待檢測基因；2)所述父本和母本轉基因植株進行雜交，得到轉基因雜交後代，觀察雜交後代，判定待檢測基因的功能。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於所述方法還包括在所述功能基因表達載體中引入LR重組位點得到植物高效單基因表達載體或植物高效多基因表達載體。
13.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於所述高效單基因表達載體為pSZC、pSZN、pHUG-1或pKUG-1；所述植物高效多基因表達載體為pYLVS-LR、pYLSV-LR、pYLVUS-1或pYLSUV-1。
全文摘要
本發明公開了一種植物雙元雜交表達載體及其應用。該植物雙元雜交表達載體，由啟動子載體和功能基因表達載體組成；所述啟動子載體包括目的啟動子與轉錄激活因子編碼基因的融合序列；所述功能基因表達載體包括所述目的基因與所述轉錄激活因子的調控元件的融合序列。本發明還提供了利用該植物雙元雜交表達載體進行植物轉基因雜交育種的方法。該植物雙元雜交表達載體還可用於篩選啟動子和鑑定目的基因功能。本發明可用於定向改造和設計植物的性狀，可縮短植物雜交育種和改良品種的周期，保證了雜交良種的純度。
文檔編號A01H1/02GK1608448SQ200410083659
公開日2005年4月27日 申請日期2004年10月15日 優先權日2003年10月16日
發明者鄧興旺, 薛永彪, 王喜萍, 夏勉, 蘇寧 申請人:北京未名凱拓農業生物技術有限公司