長效型膠原蛋白及其製造方法
2023-05-10 05:36:21 3
專利名稱：長效型膠原蛋白及其製造方法
技術領域：
本發明是提供一種長效型膠原蛋白及其製造方法，其是透過製備一膠原蛋白 (Collagen),再添加一 Y-聚麩胺酸(Y-PGA)，最後經過二次交聯，即可得到該長效型 膠原蛋白，其不但可增加該膠原蛋白在人體內的存留時間，同時具有較佳的生物適應 性(biocompatibility)等優點，使得該長效型膠原蛋白在實際應用上極具產業應用價值。
背景技術：
人隨著年齡增長，肌膚會因老化而失去光澤、出現皺紋，甚至變得粗糙沒有彈性， 其主要原因是由於皮膚中的真皮層(Dermis)隨著年齡增長，其代謝能力會慢慢衰退， 而真皮層即是肌膚的彈性來源， 一但真皮層的代謝能力退化，肌膚便會隨的老化；於 是坊間逐漸發展出許多回春(rejuvenate)的方法，而在回春方法中，效果最佳為填充顏 面填充物，而顏面填充物的材料(facial fillers)中又可分為合成材料與天然材料兩種， 該合成材料包含有矽膠(Silicone)、氫氧基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)、聚乳酸 (Poly-lactic acid, PLA)、甲基丙烯酸樹脂(Polymethyl methacrylate, PMMA)及聚甲基丙 烯酸羥乙酯(Hydroxyethylmethacrylate,HEMA)等；而該天然材料則包含有肉毒桿菌 毒素(BT)、自體脂肪(Autologous fat)、膠原蛋白(Collagen)及玻尿酸(Hyaluronic acid,HA) 等。
該合成顏面填充材料卻具有下列缺點
1、 矽膠(Silicone):注射至人體內可永久存在於體內，不過極容易引起長期發炎反 應及產生肉芽腫(granulomas),必須通過手術取出；另外，受到地心引力的影響，可 能會有植入物移位(migration)的現象產生，因此美國藥物食品檢驗局(Food and Drug Administration,FDA)己明文禁止施打此材料於人體中。
2、 氫氧基磷灰石(HAP):目前以HAP為材料中，如Radiesse，其是唯一通過美 國藥物食品檢驗局(FDA)所認可的顏面填充物，其雖可維持2 5年不等，不過有時會 有結塊(nodule)產生，尤其是在嘴唇部位，相當不美觀。3、 聚乳酸(PLA):目前主要是以左型聚乳酸(PLLA)作為施打材料，雖經過美 國藥物食品檢驗局(FDA)認可，不過仍會有肉芽腫(granulomas)產生，是目前所有 顏面填充注射材料(facial fillers)的中，發生肉芽腫頻率最高者。
4、 甲基丙烯酸樹脂(PMMA):甲基丙烯酸樹脂雖然具有良好的生物適應性 (biocompatibility)，但在人體內卻不會被降解掉，會造成生物累積，雖是永久性植入
材料，也相當容易產生肉芽腫，亦需要開刀取出，故目前已有許多國家禁止甲基丙烯 酸樹脂使用於皮下注射。
5、 聚甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA):其缺點與甲基丙烯酸樹脂類似，不過由於其中 含有一氫氧基(-OH)，所以在施打後其彈性較佳，不過隨著時間會有硬化現象發生。
上述該合成顏面填充材料的缺點，主要是會引起嚴重發炎反應，同時在人體內會 有較大副作用。
又，該天然顏面填充材料亦具有下列缺點-
1、 肉毒桿菌毒素(BT):其是透過阻止乙醯膽鹼(acetylcholine)的釋放，以阻斷部分 神經與肌肉的生理功能，以達到消除動態皺紋的效果，但肉毒桿菌毒素(BT)同時會阻 斷肌肉的部分生理功能，長期下來肌肉會有退化跡象，故當患者在微笑時，其臉部表 情會不自然；另外，由於肌肉的活動力減少，故患者每天皆必須針對注射的部位進行 按摩，另一方面，有研究文獻指出，施打過量肉毒桿菌毒素(BT)有1%的致死機率。
2、 自體脂肪其材料來源為患者自體的脂肪，所以生物兼容性極高，但由於脂肪 來源及患者的個體差異，使得自體脂肪在體內存留時間的變異相當大，期間可由數月 至數年不等，另一方面，由於自體脂肪顆粒較粗大，無法填補小範圍的皺痕或細紋， 故在使用效果及範圍均相當有限。
3、 膠原蛋白目前膠原蛋白有人類活體(human collagen)、人類屍體(cadaveric collagen)、牛(bovine collagen)及豬(porcine collagen)等，其中牛的膠原蛋白(bovine collagen)已使用二十幾年，且都通過美國藥物食品檢驗局(FDA)許可，不過由於爆發 人畜共通的狂牛症(mad cow disease)疫情，有感染的疑慮；而來自人類活體的膠原蛋白， 雖通過美國藥物食品檢驗局許可，但由於其來源取得較為困難，其價格亦較其它材料 昂貴許多；人類屍體的膠原蛋白雖然來源與人類活體的膠原蛋白相同，但由於受到培 養環境因素的影響，製備出來的顆粒度(particle size)較大，約介於微米O m)與釐米(mm) 範圍間，故亦需較粗大的針頭，造成患者額外的疼痛感。4、玻尿酸(HA):由於玻尿酸(HA)是由兩種單體(如N-acetyglucosamine與 D-glucuronic acid)聚合而成，是一種多醣類(polysaccharide)，其可被完全代謝，但其 中的該單體(如N-acetyglucosamine)的結構非常接近肝素(heparin)，所以當產生傷 口時，該單體(如N-acetyglucosamine)會進行填補，因而導致玻尿酸(HA)的數量減 少，且由於玻尿酸(HA)只能強化真皮層中物質的結合，並不能使肌膚具有彈性，所以 在植入後，必須儘量避免受外力擠壓及傷口產生，另一方面，肌肉移動會加速玻尿酸 (HA)的吸收，故患者必須避免過多臉部表情。
綜合上述天然及合成顏面填充材料中，以膠原蛋白的發炎反應程度為最低，其可 應用範圍也最廣，但膠原蛋白仍有下列缺點
1、 在體內存留時間較短未交聯過的膠原蛋白在人體內三個月便會被降解吸收， 而經戊二醛(Ghitaraldehyde)等交聯劑交聯過的膠原蛋白可存留至六個月，但存留時間 仍然過短，必須常常補充施打，相當不便。
2、 具有生物毒性經過戊二醛交聯過的膠原蛋白，會有高濃度的戊二醛殘留，其 具有高度生物毒性、會危害人體健康。
由此可見，上述習用的膠原蛋白仍有諸多缺失，實非一良善的設計，而亟待加以 改良。
發明內容
有鑑於習用膠原蛋白，其具有存留時間短及具有生物毒性等缺點；因此，發明人 依據多年來從事此方面的相關經驗，乃經過長久努力研究與實驗，並配合相關學理， 終於開發設計出本發明的一種長效型膠原蛋白及其製造方法。
本發明的一目的，在提供一種長效型膠原蛋白，是在一膠原蛋白中加入一Y-聚麩 胺酸(？polyglutarmicacid,，PGA)，再透過二次交聯，即可得到一交聯程度更均勻完全 及存留時間增長為2~3倍的長效型膠原蛋白，以解決習用膠原蛋白的存留時間過短、 必須常常補充施打的缺點。
本發明的另一目的，在提供一低生物毒性的膠原蛋白，是利用一極低濃度的戊二 醛，透過二次交聯使該膠原蛋白與該戊二醛交聯均勻完全，即可得到一極低濃度的戊 二醛殘留、同時具有較佳的生物適應性(biocompatibility)的膠原蛋白，以解決習用膠原 蛋白會有高濃度的戊二醛殘留，及該戊二醛具有生物毒性會危害人體健康的缺點。
6圖1為本發明的流程示意圖2為Y-聚麩胺酸的化學結構圖3為該膠原蛋白標準溶液曲線圖4為A組、B組、C組樣本在相同濃度膠原蛋白降解酶下的降解速率測試結 果示意圖。
具體實施例方式
為便於貴審査委員能對本發明的技術手段及運作過程有更進一步的認識與了解， 現舉一實施例配合圖式，詳細說明如下。
本發明是一種長效型膠原蛋白及其製造方法，其中先製備一膠原蛋白(Collagen)， 並在該膠原蛋白中加入一 Y-聚麩胺酸Cy-polyglutarmic acid, PGA)同時經過下列一預 定製程，即可得到一長效型膠原蛋白，其中該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)的化學結構如圖2所 示，其結構中的醯胺鍵結(amidelinkage,CONH)，系由該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)的胺基(一 NH2)及側基(residue group)的羰基(-COOH)鍵結而成，稱為Y-鍵結，該鍵結較不易因 為受到人體體內酵素的攻擊而快速降解，利用該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)對於人體體內酵素 降解的高抵抗性，以大幅減緩膠原蛋白在人體內的降解速率。
請參閱圖1所示，該長效型膠原蛋白的製造是依下列步驟進行處理
步驟一、刮除多餘組織首先，將一豬皮刮除多餘肌肉及脂肪等組織，再將剩餘 部分剪成小片段組織；
步驟二、去除油脂將該小片段組織浸泡於丙酮(acetone)中，以去除油脂，再以 二次水衝洗，直到完全去除油脂為止；
步驟三、膨潤將去除油脂的小片段組織，在一預定溫度下(該預定溫度為4'C)， 浸泡於一鹽水中(該鹽水濃度為10%)—預定時間(該預定時間為24小時)後，再浸泡於 一特定酸鹼值(該特定酸鹼值為pH值4.5)的檸檬酸(citric acid)溶液中，並持續該預定 時間使該小片段組織膨潤；
步驟四、消化將經過膨潤後的該小片段組織，在該預定溫度下浸泡於一第一溶 液中(該第一溶液為一濃度為0.5M的胃液素(pepsin)及一氫氯酸(hydrochloric acid)混 合的溶液)持續該預定時間，使該小片段組織消化成為一第二溶液；
步驟五、離心分離將該第二溶液在一第一預定條件下(該第一預定條件為5500g) 進行離心，使其中被消化的該小片段組織與該第二溶液分離；步驟六、鹽析將前述分離後的該第二溶液加入一食鹽水溶液，製備為一第三溶 液(該第三溶液的濃度為0.8M)，同時加以劇烈搖晃直到析出一雲狀物為止；
步驟七、收集下層沉澱物將搖晃後的該第三溶液在一第二預定條件(該第二預定 條件為22000g)下進行離心，同時收集一下層沉澱物，再將該下層沉澱物置入二次水 中，同時加入一氫氧化鈉(NaOH)(該氫氧化鈉的濃度為0.1N)，調整酸鹼值成為一第四 溶液(該第四溶液的pH值為7);
步驟八、冷凍乾燥將該第四溶液於一另一預定溫度(該另一預定溫度為-20。C)下 冷凍該預定時間後，再進行乾燥，即可得一膠原蛋白(該膠原蛋白為一第一型膠原蛋 白(Type I collagen));
步驟九、與該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)混合將該膠原蛋白配置為一膠原蛋白溶液(該
膠原蛋白溶液的濃度為35mg/ml)，同時取一預定量(該預定量為4ml)的該膠原蛋白溶 液，與同樣預定量的Y-聚麩胺酸(Y-PGA)混合為一第五溶液；
步驟十、進行第一次交聯在該第五溶液中以一泵浦(該泵浦為一蠕動泵浦)滴入 一另一預定量(該另一預定量為0.5ml)戊二醛溶液(該戊二醛溶液的濃度為0.05%)，同 時以一預定轉速(該預定轉速為250rpm)攪拌一另一預定時間(該另一預定時間為30分 鍾)，使該第五溶液中的膠原蛋白與戊二醛進行第一次交聯；
步驟十一、進行第二次交聯最後再重複步驟十，完成第二次交聯後，即可得該 長效型膠原蛋白。
以下則根據一 Bicinchoninic acid(簡稱BCA)檢測法步驟，加以證明本發明的該長
效型膠原蛋白確有其抗降解的效果
一、 首先，將一 A試劑及一B試劑以體積百分比50:1的比例均勻混合，製備出 一 BCA試劑；
二、 取一A組樣本、一 B組樣本及一C組樣本各25 Pl分別加入96孔滴定盤的 各槽中；
三、 於該各槽中分別加入200ul的該BCA試劑，於37。C下靜置30分鐘，使各 組樣本完全反應；
四、 最後，利用一免疫酵素光譜分析儀分別測量各組樣本的吸收值，其測定波長 為650nm。
前述該A試劑的製備系利用將40mg的酒石酸鈉(Na2C4H406. 2H20)溶在10ml濃度為0.5M的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，待其完全溶解後，再加入lg碳酸鈉(Na2C03)， 持續攪拌，直到溶液呈透明澄清狀態。
前述該B試劑的製備系利用秤取0.2g的酒石酸鈉(Na2C4H406. 2H20)，溶於2ml 濃度為0.5M的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，待其完全溶解後，再加入去離子水使溶液體 積達到10ml，最後再加入0.3g硫酸銅(CuSO4)於該溶液內，此時該溶液呈藍色澄清狀 態。
前述該A組樣本為一 4ml濃度為35mg/ml的膠原蛋白溶液。
前述該B組樣本系取4ml濃度為35mg/ml的膠原蛋白溶液，再以該泵浦在一分鐘 內滴入0.5ml的該戊二醛溶液，同時以轉速250rpm攪拌三十分鐘均勻混合，進行第一 次交聯，並在第一次交聯後，重複滴入0.5ml—戊二醛溶液，再以轉速250rpm攪拌三 十分鐘均勻混合後，進行第二次交聯；其中該戊二醛溶液的製備，系取400!iL的戊 二醛溶於7.6ml的該磷酸緩衝鹽液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)中，即製備完成濃度 為0.5%的該戊二醛溶液。
前述該C組樣本即為依據本發明的製造方法所獲得的該長效型膠原蛋白，且為利 用該BCA檢測法的檢測，故需將該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)溶於一磷酸緩衝鹽液 (Phosphate-Buffered Saline,PBS)中，以順利完成檢測。
此外，透過該BCA檢測法去檢測一膠原蛋白標準溶液，可得到將該膠原蛋白標 準溶液在波長為650nm處的一吸收值x，同時再將該吸收值x代入一曲線方程式y = 0.002x + 0.074，即可得到一y值，其中該曲線方程式中的y值系代表該膠原蛋白標準 溶液中的胜肽鏈(peptidebond)濃度，藉此即可得到如圖3所示的該膠原蛋白標準溶液 曲線圖，透過該圖可得知該膠原蛋白標準溶液在波長為650nm處的吸收值對應其胜肽 鏈濃度的關係。
前述該膠原蛋白標準溶液，系取2ml、濃度為35mg/ml的膠原蛋白，溶於5ml、 濃度為0.025N的醋酸溶液中，然後利用該磷酸緩衝鹽液(Phosphate-Buffered Saline,PBS) 溶液稀釋，即製備完成該膠原蛋白標準溶液。
請參閱圖4所示，為該A組、B組、C組樣本在相同濃度的膠原蛋白降解酶 (collagenase)下，經該BCA檢測法的檢測結果，其結果中顯示在實驗天數第11天時， 該A組樣本的溶液中胜肽鏈(peptide bond)濃度為2.052mg/ml，該B組樣本的溶液中勝 肽鏈濃度為1.77mg/ml，該C組樣本中溶液的胜肽鏈濃度為0.87mg/ml，經由上述結果
9中可發現，在相同實驗條件的下，該C組樣本的降解速率較該A組、該B組樣本的 降解速率緩慢許多，即表示該C組樣本較能抵抗人體體內酵素的降解作用；該C組樣 本的降解速度約比該B組樣本的降解速度慢2倍，而以目前臨床測試結果得知，該B 組樣本可在人體體內存留6 9個月，故可推算出該C組樣本在人體體內中存留時間約 為12~18個月。
另一方面，由於該C組樣本中的該Y-聚麩胺酸(7-PGA)系以Y方式鍵結，而人體 體內的胺鍵(aminebond)系以a方式鍵結，所以人體內能降解Y方式鍵結的酵素在DNA 序列上係為一不活化(inactivated)狀態，而根據研究指出，活化此酵素需要6~7個月時 間，故當一Y方式鍵結的多胜肽(polypeptide)進入人體中，至少需6~7個月才能開始被 降解，代表一Y-聚麩胺酸(Y-PGA)與一膠原蛋白的共聚材料(如該C組樣本)，在人體中 至少需要比18~25個月才能被完全代謝降解。
下列系利用一細胞(該細胞為一3T3纖維母細胞)評估該A組、B組、C組樣本的 生物適應性(biocompatibility):其系將該A組、B組、C組樣本分別與該細胞一起培 養3天，再分別透過下列項目數據，藉以得知細胞的活性、存活率、數量、衰老 (senescence)情形及基因毒性等各項信息
一、 粒線體酵素活性(Mitochondrial activity assay ，MTT):透過檢測分別與該A組、 B組、C組樣本一起培養的該等細胞中的粒線體酵素活性，以得知該等細胞的活性。
二、 乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase,LDH):透過檢測分別與該A組、B組、C 組樣本一起培養的該等細胞中的乳酸脫氫酶(LDH)，以檢測出該等細胞的存活率。
三、 總DNA含量透過檢測分別與該A組、B組、C組樣本一起培養的該等細 胞中的總DNA含量，以分析該等細胞的數量。
四、 半乳口甘酶(b-galactosidase):透過檢測分別與該A組、B組、C組樣本一起 培養的該等細胞中的半乳口甘酶(b-galactosidase)，以檢測該等細胞的衰老情形。
五、 染色體畸變(chromosome aberration):利用吉姆沙染色法(Giemsa stain)檢測分 別與該A組、B組、C組樣本一起培養的該等細胞的染色體畸變(chromosome aberration),以分別得知即該A組、B組、C組樣本對於該等細胞的基因毒性。
其檢測結果分別如下表所示，下表中的控制組即為前述的該膠原蛋白標準溶液:
控制組A組樣本B組樣本c組樣本
粒線體酵素活性0.6430.6820.6110.692±0.
10(MTT)±0.154±0.124±0.173189
乳酸脫氫酶(LDH)0.487±0. 0940.503±0. 1630.476±0. 1200.511±0. 143
總DNA含量0.833±0. 1440.789±0. 1590.810±0. 2010.805±0. 176
半-乳□甘酶 (b-galactosidase )0.418±0. 0670.512±0. 1690.543±0. 1120.498±0. 128
染色體畸變 ( chromosome aberration)6.8%5.88%7.92%6.73%
由上表的結果可觀察到A組、B組、C組樣本與控制組在粒線體酵素活性(MTT)、 乳酸脫氫酶(LDH)、總DNA含量、半乳口甘酶(b-galactosidase)及染色體畸變 (chromosome aberration)等指標，均沒有統計上的差異，藉此可證明A組、B組、C組 樣本沒有細胞毒性及引發染色體(chromosome)的變異，具有良好的生物適應性。
由上述可證明，本發明的該長效型膠原蛋白有別習用的膠原蛋白關鍵在於
一、 本發明具有新穎性及進步性，由於本發明是在膠原蛋白中加入該Y-聚麩胺酸 (Y-PGA)，並經過兩次交聯，即可得到該長效型膠原蛋白，其可解決習用膠原蛋白的存 留時間過短、必須常常補充施打的缺點，故具有其新穎性及進步性。
二、 本發明具有實用性，由於本發明系利用該低濃度的戊二醛，透過兩次交聯使 該膠原蛋白與該戊二醛交聯均勻完全，即可得到一極低濃度戊二醛殘留、同時具有較 佳的生物適應性的該長效型膠原蛋白，故具有其實用性。
按，上述詳細說明為針對本發明的一種較佳的可行實施例說明而已，該實施例並 非用以限定本發明的申請專利範圉，舉凡其它未脫離本發明所揭示的技藝精神下所完 成的均等變化與修飾變更，均應包含於本發明所涵蓋的專利範圍中。
1權利要求
1、一種長效型膠原蛋白的製造方法，該方法包含下列步驟將一豬皮刮除多餘肌肉及脂肪組織，再將剩餘部分剪成小片段組織；將該小片段組織浸泡於一有機溶劑中，再以二次水衝洗直到完全去除油脂為止；將去除油脂的小片段組織，在一預定溫度下，浸泡於一鹽水中一預定時間後，再浸泡於一特定酸鹼值的酸性溶液中持續該預定時間，使該小片段組織膨潤；將經過膨潤後的該小片段組織，在該預定溫度下浸泡於一第一溶液中持續該預定時間，使該小片段組織消化成為一第二溶液；將該第二溶液在一第一預定條件下進行離心，使其中被消化的該小片段組織與該第二溶液分離；將分離後的該第二溶液加入一食鹽水溶液，製備為一第三溶液，同時加以劇烈搖晃，直到析出一雲狀物為止；將搖晃後的該第三溶液在一第二預定條件下進行離心，同時收集一下層沉澱物，將該下層沉澱物置入二次水中，同時加入一氫氧化鈉，調整酸鹼值成為一第四溶液；將該第四溶液於一另一預定溫度下冷凍該預定溫度，再進行乾燥即可得一膠原蛋白；將該膠原蛋白配置為一膠原蛋白溶液，同時取一預定量的該膠原蛋白溶液，與同樣預定量的γ-聚麩胺酸混合為一第五溶液；在該第五溶液中以一泵浦滴入一另一預定量戊二醛溶液，同時以一預定轉速攪拌一另一預定時間，使該第五溶液中的該膠原蛋白與戊二醛溶液中的戊二醛進行第一次交聯；再次以該泵浦滴入該另一預定量戊二醛溶液，同時以一預定轉速攪拌該另一預定時間，進行第二次交聯，即可得該長效型膠原蛋白。
2、 根據權利要求1所述的長效型膠原蛋白的製造方法，其中該有機溶劑為丙酮。
3、 根據權利要求l所述的長效型膠原蛋白的製造方法，其中該預定溫度為4'C。
4、 根據權利要求1所述的長效型膠原蛋白的製造方法，其中該酸性溶液為一檸檬 酸溶液。
5、 根據權利要求1所述的長效型膠原蛋白的製造方法，其中該第一溶液為一濃度為0.5M的胃液素及一氫氯酸的混合溶液。
6、 根據權利要求1所述的長效型膠原蛋白的製造方法，其中該另一預定溫度為 -20°C。
7、 根據權利要求1所述的長效型膠原蛋白的製造方法，其中該膠原蛋白為一第一 型膠原蛋白。
8、 一種長效型膠原蛋白，其系在一膠原蛋白添加一 Y-聚麩胺酸，並經過一預定製 程以得到該長效型膠原蛋白。
9、 根據權利要求8所述的長效型膠原蛋白，其中該預定製程分別包含加入一戊二 醛溶液、進行第一次交聯及進行第二次交聯的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種長效型膠原蛋白及其製造方法，是將一豬皮經過刮除多餘組織、去除油脂、膨潤、消化、離心分離、鹽析、收集下層沉澱物、冷凍乾燥後即可得一膠原蛋白，再將該膠原蛋白與γ-聚麩胺酸(γ-PGA)混合，同時加入一戊二醛溶液並攪拌均勻，進行第一交聯，再重複加入該戊二醛溶液攪拌均勻，進行第二次交聯後，即可得該長效型膠原蛋白，其可解決習用膠原蛋白的存留時間過短、必須常常補充施打，以及會殘留高濃度的戊二醛，具有生物毒性會危害人體健康等缺點。
文檔編號C07K1/14GK101648989SQ20081014708
公開日2010年2月17日 申請日期2008年8月15日 優先權日2008年8月15日
發明者盧香吟, 林峰輝, 林育德, 陳柏彰 申請人:雙美生物科技股份有限公司