一種新型隱球菌莢膜多糖的製備方法
2023-05-10 02:38:06
專利名稱：一種新型隱球菌莢膜多糖的製備方法
技術領域：
本發明涉及真菌的多糖製備領域。具體而言，本發明涉及製備新型隱球菌的莢膜多糖。
背景技術：
新型隱球菌(Crytococcus Neoformans)是一種重要的條件致病性真菌,主要存在於養鳥場或被鳥類排洩物汙染的土壤中，在AIDS和HIV相關隱球菌病患者房間的灰塵和空氣中也能夠找到新型隱球菌的病原體。新型隱球菌常感染免疫低下或免疫缺陷的患者，從而引起臨床症狀，甚至危及生命。近年來由於廣譜抗菌藥物、腎上腺皮質激素、腫瘤化器官移植後免疫抑制劑的長期廣泛應用，以及愛滋病的流行，真菌性腦膜炎明顯增多。而新型隱球菌性腦膜炎(隱腦)是由新型隱球菌所致的最常見的中樞神經系統真菌感染。隱球菌性腦膜炎是一種預後嚴重的深部真菌感染，早期誤診率達90 %，死亡率和嚴重病殘率分別高達25 % 60 %和20 %以上(廖萬清等，Infect Dis Info，2000，Vol. 13，No. 2，p86)。因診斷方法有限，實驗室難以快速提供早期診斷指標。國外實驗室已開展了乳膠凝集實驗檢測血液和腦脊液中隱球菌莢膜多糖抗原，使早期診斷率得以提高(王鑫等，腦與神經疾病雜誌2008年，第16卷，第4期，409-411 頁)。而測定抗原作為新型隱球菌感染診斷方法的關鍵，便是得到製備單克隆抗體的免疫原莢膜多糖，即葡萄糖醛醯木糖基甘露聚糖。對於新型隱球菌莢膜多糖的提取製備，國內目前還沒有相關的研究報導。國外的研究報導常用以下方法製備新型隱球菌莢膜多糖(THOMAS R etal. INFECTION AND IMMUNITY, Feb. 1971，p. 287-294)。通常，用培養罐培養新型隱球菌，經過高壓滅菌後，從離心除去菌體的上清液中提制莢膜多糖。上清液先用O. 45um濾膜過濾，然後超濾濃縮，並向濃縮液中加入醋酸鈉和冰醋酸，接下來用乙醇沉澱出粗製莢膜多糖。然後用氯仿/正丁醇(V v = 5 I)進行反覆抽提，除去蛋白。再用乙醇將莢膜多糖沉澱出來，離心收集沉澱，將沉澱溶於去離子水，透析，凍幹得到精製莢膜多糖。由於氯仿是有毒有害的化學危險品，有致癌的危險性，對工作條件、人員保護、汙水處理等有較高要求。因此，在莢膜多糖的提取製備過程中，應該想辦法儘量避免使用毒害性較大的有機化學試劑。另外有人嘗試用層析法純化新型隱球菌莢膜多糖(R. Mariano Andrade, etal. Cellular Immunology 222(2003) 116-125)。但這種方法的缺點是操作複雜,處理量小，成本高，不易於規模化生產。目前，本領域迫切需要開發一種使用於從新型隱球菌中提制莢膜多糖的簡便、高效、低成本的方法，並能夠有效的避免使用有毒有害的化學試劑
發明內容
本發明的目的在於提供一種利用十六烷基三甲基溴化銨來製備新型隱球菌莢膜多糖的方法。
本發明所採用的新型隱球菌購買自中國醫學微生物菌種保藏管理中心。本發明技術方案如下步驟I)新型隱球菌培養採用通用的白色念珠菌培養條件，具體地說培養基採用YM肉湯培養基，成分為每升培養基含3g酵母提取物,5g蛋白腖,3g麥芽糖提取物，IOg D-葡萄糖。培養溫度為30°C，震蕩速度為200rpm，培養時間大約36h，至菌濃度達到對數期後期；2)菌液高壓滅菌，離心除去菌體，得上清液；3)上清液中邊攪拌邊緩慢加入醋酸鈣粉末至終濃度5 %。再加冰醋酸調pH值至
5.O左右；4)向上述溶液中加入95%的乙醇，4°C靜置過夜，離心分離沉澱，乾燥，得到新型隱球菌抗原粗提物；5)抗原粗提物溶於水，NaCl粉術至終濃度O. 2M，邊攪拌邊按多糖總質量的3倍邊攪拌邊緩慢加入CTAB粉末，靜置I小時後，離心，沉澱用乙醇洗滌兩次；6)沉澱重新溶解後加入氯化鈉溶液，加入乙醇，使多糖沉澱；7)沉澱再次用乙醇洗滌兩次，溶於水後測定多糖濃度；8)莢膜多糖溶液凍幹，即得到精製新型隱球菌莢膜多糖抗原。本發明使用十六烷基三甲基溴化銨進行新型隱球菌莢膜多糖的製備，有效的避免使用有毒有害的化學試劑，並且省略了凝膠層析的過程，不但使得製備工藝簡單化，同時能製備出高純度的新型隱球菌莢膜多糖。實施例1，用本發明的製備方法提取新型隱球菌莢膜多糖，其步驟如下配製YM肉湯培養基O. 6L，其成分為I. 8g酵母提取物，3g蛋白腖，I. 8g麥芽糖提取物，6g D-葡萄糖。培養溫度為30°C，震蕩速度為200rpm，培養時間為36h。菌液121°C滅菌25min，16，OOOg離心30分鐘去除菌體。上清液中邊攪拌邊緩慢加入醋酸鈣粉末至終濃度5 %。再加冰醋酸調pH值至5. O左右。向上述溶液中加入三倍體積95%的乙醇，馬上會有沉澱產生，4°C靜置過夜。倒掉大部分上清，剩餘液體移至50ml圓底離心管中。12，OOOg離心5分鐘。棄上清，沉澱乾燥，得新型隱球菌抗原粗提物。實施例2，用本發明的製備方法，利用十六烷基三甲基溴化銨對粗製莢膜多糖進行純化，具體步驟如下I)粗製莢膜多糖溶液中，加NaCl粉末至終濃度O. 2M，邊攪拌邊按多糖總質量的3倍邊攪拌邊緩慢加入CTAB粉末，靜置I小時，23°C，12，OOOg離心5分鐘，沉澱加約15ml10%的乙醇重懸，23°C 12，OOOg離心30分鐘，棄上清；乙醇洗滌重複兩次；2)沉澱加入到100ml IMNaCl溶液，室溫攪拌約2小時至沉澱溶解，加入200ml無水乙醇，會立即有沉澱生成，靜置I小時，23°C，12，000g離心10分鐘，沉澱用70%乙醇重懸，23°C，12，OOOg離心10分鐘，棄上清，沉澱即為純化新型隱球菌莢膜多糖。
權利要求
1.一種新型隱球菌莢膜多糖的製備方法。其特徵在於純化莢膜多糖的過程中採用了十六烷基三甲基溴化銨，避免了使用有毒有害的化學試劑，使得製備工藝簡單化，並能製備得到高純度的莢膜多糖。
2.如權利要求I所述的新型隱球菌莢膜多糖的製備方法，其特徵在於，除掉菌粉的上清液用醋酸鈣粉末至終濃度5%。再加冰醋酸調pH值至5. O左右，之後再用乙醇沉澱，即得莢膜多糖粗提物。
3.如權利要求I所述的新型隱球菌莢膜多糖的製備方法，其特徵在於，使用十六烷基三甲基溴化銨對多糖粗品進行純化。
4.利要求3所述的方法，其特徵在於，上清液在乙醇中產生沉澱，加入乙醇濃度為95%，加入量為3倍體積的上清液。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，加入十六烷基三甲基溴化銨的量為多糖總質量的3倍。
6.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，莢膜多糖沉澱後用10%乙醇洗滌兩次，然後溶解到氯化鈉溶液中。
7.如權利要求7所述方法，其特徵在於，所用氯化鈉濃度為1M。
8.如權利要求7所述方法，其特徵在於，所得溶液中加入3倍體積的無水乙醇，用以沉澱多糖。
9.如權利要求9所述方法，其特徵在於，所得沉澱用乙醇洗滌兩次。
10.如權利要求10所述方法，其特徵在於，所用乙醇濃度為70%。
全文摘要
本發明涉及真菌的多糖製備領域。具體而言，本發明涉及製備新型隱球菌的莢膜多糖。本發明提供了一種利用十六烷基三甲基溴化銨來製備新型隱球菌的莢膜多糖的方法。首先用醋酸鈣和冰醋酸處理含莢膜多糖的分泌上清液後，用乙醇沉澱得到粗製莢膜多糖。然後用十六烷基三甲基溴化銨處理粗製莢膜多糖溶液，得到純化莢膜多糖。本方法簡便、高效、成本低，並能夠有效的避免使用有毒有害的化學試劑。
文檔編號C12R1/01GK102952201SQ20111024006
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月22日 優先權日2011年8月22日
發明者史東東, 何永勝, 周澤奇, 李寧, 粟豔, 王東東, 彭潔 申請人:天津貽諾琦生物工程有限公司