一種提高飼料中總纖維素酶活力檢測準確性的方法與流程
2023-04-28 01:10:46
本發明涉及纖維素酶檢測技術領域，具體涉及一種飼料中總纖維素酶活力的方法。
背景技術：
隨著我國畜牧業的發展和生物技術的不斷進步，飼用複合酶已廣泛用於飼料工業中。由於酶製劑能夠消除飼料中的某些抗營養因子的負面作用，提高飼料消化率，改善動物生產性能，降低生產成本，因此日益受到飼料界的重視。飼用複合酶種類繁多，大部分包含纖維素酶，目前飼料用纖維素酶檢測方法有《ny/t912-2004飼料添加劑纖維素酶活力測定》及《gb/t23881-2009飼用纖維素酶活性的測定濾紙法》，前者是測體系中內切葡聚糖酶活性，後者是測總纖維素酶活性，但由於飼料成分較複雜，含有各種金屬離子對酶製劑有激活或抑制作用、糖類及其他成分造成纖維素酶活性檢測過程中背景值非常高，再加上纖維素酶本身添加量較少，導致飼料中纖維素酶活性檢測值不準確。因此，需要一種提高靈敏度和準確性高的檢測方法。
技術實現要素：
為了解決現有技術中的上述問題，本發明提供了一種提高飼料中總纖維素酶活力檢測準確性的方法。
研究發現，飼料中含有的一些金屬離子及糖類會對纖維素酶的檢測產生一定影響。農業部1224號公告中可添加到飼料中的常量元素和微量元素，部分元素對纖維素酶有激活作用，部分有抑制作用，不管是激活還是抑制，都會造成飼料中纖維素酶檢測值與理論添加值間的差異，這種正向或反向的差異都會增加實測值與理論值的差異。飼料本身含有各種聚糖、寡糖及單糖，這些糖特別是具有還原性的單糖，比如葡萄糖在酶解過程中會與dns試劑發生反應，造成檢測背景值偏高，大幅降低檢出限，使得飼料中纖維素酶較難檢出。
因此，本發明通過沉降飼料中的金屬元素，以及減少飼料原料中的糖類，主要是一些單糖，達到提高準確性的目的。
本發明提供的提高飼料中纖維素酶活力檢測準確性的方法，是在常規的纖維素酶檢測方法基礎上，對飼料進行除金屬和除糖的預處理，並優化酶解反應過程，包括優化底物形狀、優化酶解反應體系中各參數比例。
其中，常規的纖維素酶檢測方法是指在本發明申請日以前基於還原糖與dns試劑反應顯色原理的檢測技術，例如可以參照ny/t912-2004及gb/t23881-2009等。
優選地，飼料預處理步驟為：將粉碎的飼料與金屬沉降劑投入緩衝液中進行提取，過濾後濾液中加入除糖劑反應，反應結束後過濾，得酶液。
優選地，所述金屬沉降劑為含二甲基二硫代氨基甲酸鈉的複合螯合劑，能夠沉降鉻、鎳、銅、鋅、錳、鎘、釩、鐵、錫等多種金屬離子，減少金屬離子對酶活的影響。
優選地，所述除糖劑為一種畢赤酵母，能夠分解利用掉可與dns發生反應的單糖，大大降低背景噪音，提高檢測準確性。
本發明還提供了一種提高飼料中總纖維素酶活力檢測準確性的方法，包括以下步驟：
(1)處理酶液：將粉碎的飼料與金屬沉降劑投入緩衝液中進行提取，過濾後濾液中加入除糖劑反應，反應結束後過濾，得酶液；
(2)酶活測定：濾紙粉碎，加入酶液37℃進行酶解反應，反應結束後加入dns試劑，煮沸滅活酶，過濾，取濾液在540nm測其吸光度，與標準曲線對照得單糖濃度，按照以下公式(1)計算得出酶活力：
x＝a×l/0.5×n÷m＝(ax+b)×0.5×l/0.5×n÷m....(1)
式中：
x—樣品中總纖維素酶活力，u/g(或u/ml)；
a—根據吸光度在標準曲線上查得或計算出的還原糖量，mg；
1/0.5—換算成酶液1ml；
n—酶樣的稀釋倍數；
m—稱樣量，g；
所述標準曲線由已知梯度濃度的葡萄糖與dns試劑反應後在540nm測定吸光度值，每個葡萄糖濃度值對應一個吸光度值，形成標準曲線。
優選地，所述濾紙粉碎後還包括對其烘乾的步驟，烘乾條件為105℃烘乾至恆重，含水量低於5％。對濾紙進行粉碎和烘乾處理，大大提高了方法重現性。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明通過去除檢測樣品中的金屬離子和糖，大大提高了檢測準確性，通過對濾紙進行特殊的粉碎烘乾處理，提高了重現性。使用本發明的檢測方法，可以準確檢測出飼料中含有的真實纖維素酶含量，檢測誤差遠低於常規標準方法。
附圖說明
圖1為實施例1標準曲線圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明並能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
實施例1
1試劑
除特殊說明外，所有的試劑均為分析純，水均符合gb/t6682中規定的二級水。
1.1dns試劑
稱取3，5-二硝基水楊酸3.15g，加水500ml在磁力攪拌器上加熱攪拌，至45℃，然後逐步加入100ml氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明(注意：在氫氧化鈉加入的過程中，溶液溫度不得低於45℃，不得高於48℃)，再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g，保持在46℃左右。直到全部溶解，加入苯酚2.5ml，再加入無水亞硫酸鈉2.5g，保溫45℃攪拌，直到加入物質完全溶解，停止加熱，冷卻至室溫後，用水定容至1000ml。用濾紙過濾，取濾液儲存在棕色瓶中，避光保存，室溫下存放7d後可以使用，有效期為2個月。
1.2乙酸-乙酸鈉緩衝溶液0.1mol/l，ph值5.5，適用於飼用纖維素酶：
稱取無水乙酸鈉8.2g，用水溶解，再用冰乙酸調節ph至5.5，加水定容至1000ml，搖勻。
1.3葡萄糖標準貯備溶液(10mg/ml)
稱取於(103士2)℃下烘乾至恆重的無水葡萄糖1g，精確至0.1mg，用水溶解並定容至100ml。
1.4葡萄糖標準使用溶液
分別吸取葡萄糖標準貯備溶液0、0.125、0.25、0.5、1.00、1.50、2.00ml於10ml容量瓶中，用水定容至10ml，蓋塞，搖勻備用。上述系列濃度應根據需要自行調整。
1.5快速定性濾紙：杭州沃華濾紙有限公司，雙圈定性濾紙，帶whatmanr標識，直徑15cm。
2儀器
2.1分光光度計：能檢測350～800nm的吸光度範圍；
2.2ph計：精確至0.01；
2.3恆溫水浴鍋：溫度控制範圍在30～60℃之間，精確度為0.1℃；
2.4分析天平：感量0.1mg；
2.5磁力攪拌器；
2.6秒表：每小時誤差不超過5s；
2.7電磁振蕩器；
2.8具塞刻度試管25ml；
2.9移液器：精度為1μl。
2.10粉碎機
3繪製標準曲線
按表l規定的量，分別吸取葡萄糖標準使用溶液，緩衝溶液和dns試劑於各管中混勻。
將標準管同時置於沸水浴中加熱10min。取出，迅速冷卻至室溫，混勻。用10mm比色杯，在分光光度計波長540nm處測量吸光度。以葡萄糖量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪製標準曲線，獲得線性回歸方程。
表1葡萄糖標準曲線
4樣品的測定
4.1樣品前處理
將配合飼料樣品粉碎通過0.45mm標準篩，稱取5g於三角瓶中，稱取0.2g金屬沉降劑，用25ml緩衝液於20℃水浴搖床提取30min，靜止過濾，取濾液9.9ml，加入0.1ml除糖劑，於20℃處理4h，過濾取濾液備用。
4.2濾紙的製備
先將濾紙撕成小片，再用粉碎機粉碎成棉花狀，粉碎後105℃烘箱烘2h至恆重，置於(矽膠)乾燥器中待用，水分控制在5％以內。
4.3測定步驟
取四支25ml刻度具塞試管，稱取濾紙粉0.05g放入每支試管的底部，加入1.8ml緩衝液，使管內溶液浸沒濾紙。於37℃水浴中預熱5min，加入0.20ml酶液於三支樣品管中，精確反應60min，向四支試管中加入dns試劑2.5ml。再於空白管中補加酶液0.20ml。沸水煮沸10min，取出，冷卻至室溫，搖勻，四層紗布過濾，取濾液比色。
5試樣酶活力的計算
試樣酶活力按式(l)計算：
x＝a×l/0.5×n÷m＝(ax+b)×0.5×l/0.5×n÷m....................(1)
式中：
x—樣品的外切酶活力，u/g(或u/ml)；
a—根據吸光度在標準曲線上查得(或計算出)的還原糖量，mg；
1/0.5—換算成酶液1ml；
n—酶樣的稀釋倍數；
m—稱樣量，g。
6允許差
同一試樣兩次測試結果的絕對差值，不得超過算術平均值的10％。
7檢測結果
7.1標準曲線
標準曲線參見圖1。
7.2樣品中纖維素酶檢測結果
表2：不同方法檢測飼料中總纖維素酶活性
備註：複合酶中含有纖維素酶，理論值根據複合酶中纖維素酶活性為1000u/g,添加量為300g/t進行計算所得。
以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳實施例，本發明的保護範圍不限於此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護範圍之內。本發明的保護範圍以權利要求書為準。