一種割罐法發酵生產韋蘭膠的方法
2023-04-28 08:25:21 2
一種割罐法發酵生產韋蘭膠的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用產鹼桿菌發酵生產韋蘭膠並採用丙酮進行後提取的方法，步驟如下：S1.菌種保藏斜面的製備：將產鹼桿菌ATCC31555接種到培養基斜面上，於30℃恆溫培養2-4天備用；S2.用接種環於上述斜面上挑一環菌體至一級種子液體培養基中，30℃培養24小時，得到一級液體種子；S3.將一級種子按10％接種量接於二級種子液體培養基中，28-38℃培養12-24個小時，得到二級液體種子；S3.上述種子用於接種至滅菌後的5L發酵罐中發酵；S4.發酵20-36個小時後，將5L小罐中發酵液排出1-3.5L，再補加1-3.5L液體發酵培養基，如此重複2-3次，發酵結束；S5.發酵液的後提取。該方法縮短發酵周期，提高生產效率和得率。
【專利說明】一種割罐法發酵生產韋蘭膠的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用產鹼桿菌發酵產韋蘭膠的方法，特別涉及一種割罐法發酵生產韋蘭膠，並用丙酮提取的方法。
【背景技術】 [0002]微生物代謝膠也叫生物合成膠，許多微生物在生長代謝過程中，在不同的外部條件下都能產生一定量的各種多糖。微生物多糖安全無毒，有獨特的理化性質，且與植物和動物多糖相比，微生物多糖的生產受地理環境、氣候、自然災害等因素的影響較小，產量及質量都很穩定。韋蘭膠是一種新型微生物多糖。韋蘭膠的結構骨架由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖單元組成。韋蘭膠中含有2.8% -7.5%乙醯基，11.6% -14.9%的葡萄糖醛酸，甘露糖、葡萄糖和鼠李糖的摩爾比例為1: 2: 2。
[0003]韋蘭膠是美國Kelco公司80年代繼黃原膠、結冷膠之後開發的最有市場前景的微生物多糖之一，迄今為止美國的Kelco公司是韋蘭膠全球唯一的生產、供應商。韋蘭膠具有優良的觸變性、懸浮性、水溶性等流變性能，且具有卓越的穩定性，市場前景廣闊。它主要作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、潤滑劑、成膜劑和粘合劑應用於工農業的各個方面，尤其在食品、混凝土、石油、石墨等工業中有廣泛的應用前景。
[0004]目前國外僅有一些關於其結構和應用性的專利報導。在國內的研究還停留在實驗室階段。無法形成工業化生產。主要是因為用於發酵的菌種對原料的要求較高且產率太低，導致發酵液中的韋蘭膠濃度較低，另外發酵液中的副產物太多。這些因素進一步造成提取的成本居高不下.另一方面國內韋蘭膠成品質量較差。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於克服上述已有技術的不足之處，提供一種高效可行並可降低韋蘭膠生產成本，減小投資，益於生產應用的割罐法發酵生產韋蘭膠的方法，並採用丙酮沉澱的方法提取，有效去除了發酵液中的雜質和色素。
[0006]為實現上述目的本發明所採用的技術方案如下:
[0007]一種割罐法發酵生產韋蘭膠的方法，其特徵在於:依次步驟如下:
[0008]S1.菌種保藏斜面的製備:將產鹼桿菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接種到培養基斜面上，於30°C恆溫培養2-4天待用；斜面培養基組成包括，單位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白腖5g,牛肉膏5g,瓊脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌種:鞘氨醇單胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0009]S2.上述斜面用於接種至滅菌後的一級液體種子培養基中，一級液體種子培養基組成包括，單位1L:葡萄糖15-20g，酵母粉4-8g，牛肉膏4-8g，蛋白腖3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4 0.01-0.03g，用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後用接種環從菌種保藏斜面上挑I環菌體接入上述冷卻的液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為150rpm的搖床上培養24h，得到一級液體種子；[0010]S3.上述一級液體種子用於接種至滅菌後的二級級液體種子培養基中，二級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖15-20g，酵母粉4-8g，蛋白腖3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4 0.01-0.038，用蒸餾水定容至11^，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後將一級液體種子按10%接種量接入上述冷卻的二級液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於28-38 °C、轉速為120_200rpm的搖床上培養12-24h，得到二級液體種子；
[0011]S4.上述二級液體種子培養基用於接種至滅菌後的5L發酵罐中，發酵罐培養基組成包括，單位 IL:玉米澱粉水解液 250-400ml, NaNO3 3.0-4.0g, MgSO40.2-0.4g，K2HPO4
4.5-6.0g，CaCO3 1.0-2.0g，FeS04 0.001-0.005g，蛋白腖 5_10g，用蒸餾水定容至 3L，pH 值
5.0-8.0，將發酵罐培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後按照體積比5-12%的接種量將液體培養基接入上述冷卻的發酵罐培養基中，發酵溫度28-38°C，溶氧控制在30-40% ；
[0012]S5.發酵14-30個小時後，將發酵液排出1_2.5L，並將滅過菌的1_2.5L液體發酵培養基加入5L小罐中，繼續在28-38°C條件下培養10-20個小時；上述操作重複1_3次。
[0013]S6.發酵結束，將發酵液用水稀釋0-3倍，用旋渦式攪拌槳以300-400轉/分鐘速度攪拌，再勻速緩慢加入0.8-1.3倍體積的丙酮，攪拌半小時,離心將上清液倒掉，固體烘乾後粉碎。得到韋蘭膠的產量為20-40g/L。
[0014]與現有技術相比，本發明採用割罐法生產韋蘭膠，可以大大提高底物的利用率，並減少種子製備的繁瑣，相當於普通發酵3-4個周期的效果，有效的提高生產效率，降低了成本。並且不需要複雜的設備，後處理方法簡單，用丙酮可以有效去除了發酵液中的各種雜質，脫色效果也非常明顯，使得到產品的純度有了很大的提高，同時提高了韋蘭膠的收率，進一步降低了成本。該方法具有很高的實際應用價值，市場優勢非常明顯。
【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例，對依據本發明提供的【具體實施方式】詳述如下:
[0016]實施例1
[0017]S1.菌種保藏斜面的製備:將產鹼桿菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接種到培養基斜面上，於30°C恆溫培養2-4天待用；斜面培養基組成包括，單位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白腖5g,牛肉膏5g,瓊脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌種:鞘氨醇單胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0018]S2.上述斜面用於接種至滅菌後的一級液體種子培養基中，一級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖15g,酵母粉4g,牛肉膏4g,蛋白腖3g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.01g,用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後用接種環從菌種保藏斜面上挑I環菌體接入上述冷卻的液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為150rpm的搖床上培養24h，得到一級液體種子；
[0019]S3.上述一級液體種子用於接種至滅菌後的二級級液體種子培養基中，二級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖15g，酵母粉4g，蛋白腖3g，K2HP042g，MgSO4 0.01gj蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後將一級液體種子按10%接種量接入上述冷卻的二級液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為200rpm的搖床上培養16h，得到二級液體種子；
[0020]S4.上述二級液體種子培養基用於接種至滅菌後的5L發酵罐中，發酵罐培養基組成包括，單位 IL:玉米澱粉水解液 250ml，NaNO3 3.0g, MgSO4 0.2g，Κ2ΗΡ044.5g，CaCO3 1.0g,FeS04 0.0Olg，蛋白腖5g，用蒸餾水定容至3L，pH值7.0，將發酵罐培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後按照體積比12%的接種量將液體培養基接入上述冷卻的發酵罐培養基中，發酵溫度38 °C，溶氧控制在30% ；
[0021]S5.發酵14個小時後，將發酵液排出2L，並將滅過菌的2L液體發酵培養基加入5L小罐中，繼續在38°C條件下培養15個小時；
[0022]S6.將步驟S5.重複3次。
[0023]S7.發酵結束，將發酵液原液用旋渦式攪拌槳以的400轉/分鐘速度攪拌，再勻速緩慢加入0.8倍丙酮，攪拌半小時，離心將上清液倒掉，固體烘乾粉碎。得到韋蘭膠產品為220g。
[0024]實施例2
[0025]S1.菌種保藏斜面的製備:將產鹼桿菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接種到培養基斜面上，於30°C恆溫培養2-4天待用；斜面培養基組成包括，單位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白腖5g,牛肉膏5g,瓊脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌種:鞘氨醇單胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555:
[0026]S2.上述斜面用於接種至滅菌後的一級液體種子培養基中，一級液體種子培養基組成包括，單位11^:葡萄糖2(^，酵母粉88，牛肉膏88，蛋白腖68，K2HPO4 3g，MgSO4 0.03g,用蒸餾水定容至lL，pH值7. 0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後用接種環從菌種保藏斜面上挑I環菌體接入上述冷卻的液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為150rpm的搖床上培養24h，得到一級液體種子；
[0027]S3.上述一級液體種子用於接種至滅菌後的二級級液體種子培養基中，二級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖20g，酵母粉8g，蛋白腖6g，K2HP043g, MgSO40.03g，用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後將一級液體種子按10%接種量接入上述冷卻的二級液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於28°C、轉速為120rpm的搖床上培養12h，得到二級液體種子；
[0028]S4.上述二級液體種子培養基用於接種至滅菌後的5L發酵罐中，發酵罐培養基組成包括，單位 IL:玉米澱粉水解液 400ml，NaNO3 4.0g, MgSO40.4g，K2HPO4 6.0g, CaCO3 2.0g,FeS04 0.005g，蛋白腖10g，用蒸餾水定容至3L，pH值8.0，將發酵罐培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後按照體積比5%的接種量將液體培養基接入上述冷卻的發酵罐培養基中，發酵溫度28 V，溶氧控制在40 % ；
[0029]S5.發酵30個小時後，將發酵液排出2.5L，並將滅過菌的2.5L液體發酵培養基加入5L小罐中，繼續在28°C條件下培養20個小時。
[0030]S6.將步驟S5.重複2次。
[0031 ] S7.發酵結束，將發酵液稀釋3倍，用旋渦式攪拌槳以的400轉/分鐘速度攪拌，再勻速緩慢加入1.3倍丙酮，攪拌半小時，離心將上清液倒掉，固體烘乾粉碎。得到韋蘭膠產品為330g。
[0032] 實施例3[0033]S1.菌種保藏斜面的製備:將產鹼桿菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接種到培養基斜面上，於30°C恆溫培養2-4天待用；斜面培養基組成包括，單位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白腖5g,牛肉膏5g,瓊脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌種:鞘氨醇單胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0034]S2.上述斜面用於接種至滅菌後的一級液體種子培養基中，一級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖18g，酵母粉5g，牛肉膏6g，蛋白腖4g，K2HPO4 2.5g，MgSO4 0.02g,用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後用接種環從菌種保藏斜面上挑I環菌體接入上述冷卻的液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為150rpm的搖床上培養24h，得到一級液體種子；
[0035]S3.上述一級液體種子用於接種至滅菌後的二級級液體種子培養基中，二級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖18g，酵母粉5g，蛋白腖4g，K2HPO4 2.5g，MgSO4
0.02g，用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後將一級液體種子按10%接種量接入上述冷卻的二級液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於35°C、轉速為150rpm的搖床上培養18h，得到二級液體種子；
[0036]S4.上述二級液體種子培養基用於接種至滅菌後的5L發酵罐中，發酵罐培養基組成包括，單位 IL:玉米澱粉水解液 350ml，NaNO3 3.5g，MgSO40.3g，K2HPO4 5.0g, CaCO3 1.5g，FeSO4 0.004g,蛋白腖8g，用蒸餾水定容至3L，pH值5.0，將發酵罐培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後按照體積比8%的接種量將液體培養基接入上述冷卻的發酵罐培養基中，發酵溫度35 °C，溶氧控制在30% ；
[0037]S5.發酵20個小時後，將發酵液排出1L，並將滅過菌的IL液體發酵培養基加入5L小罐中，繼續在35°C條件下培養10個小時；
[0038]S6.將步驟S5.重複3次。
[0039]S7.發酵結束，將發酵液稀釋I倍，用旋渦式攪拌槳以的350轉/分鐘速度攪拌，再勻速緩慢加入I倍丙酮，攪拌半小時，離心將上清液倒掉，固體烘乾粉碎。得到韋蘭膠產品為 175g。
[0040]實施例4
[0041]S1.菌種保藏斜面的製備:將產鹼桿菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接種到培養基斜面上，於30°C恆溫培養2-4天待用；斜面培養基組成包括，單位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白腖5g,牛肉膏5g,瓊脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌種:鞘氨醇單胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0042]S2.上述斜面用於接種至滅菌後的一級液體種子培養基中，一級液體種子培養基組成包括，單位1L:葡萄糖18g，酵母粉6g，牛肉膏6g，蛋白腖5g，K2HPO4 2g，MgSO4 0.01g,用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後用接種環從菌種保藏斜面上挑I環菌體接入上述冷卻的液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為150rpm的搖床上培養24h，得到一級液體種子；
[0043]S3.上述一級液體種子用於接種至滅菌後的二級級液體種子培養基中，二級液體種子培養基組成包括，單位IL:葡萄糖18g，酵母粉6g，蛋白腖5g，K2HPO4 2g, MgSO4 0.01g,用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ;將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後將一級液體種子按10%接種量接入上述冷卻的二級液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於30°C、轉速為180rpm的搖床上培養20h，得到二級液體種子；
[0044]S4.上述二級液體種子培養基用於接種至滅菌後的5L發酵罐中，發酵罐培養基組成包括，單位 IL:玉米澱粉水解液 300ml, NaNO3 3g，MgSO4 2g，Κ2ΗΡ045.5g，CaCO3 2g，FeS04
0.003g，蛋白腖7g，用蒸餾水定容至3L，pH值7.5，將發酵罐培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後按照體積比10%的接種量將液體培養基接入上述冷卻的發酵罐培養基中，發酵溫度30 V，溶氧控制在40 %。
[0045]S5.發酵18個小時後，將發酵液排出1.5L，並將滅過菌的1.5L液體發酵培養基加入5L小罐中，繼續在30°C條件下培養12個小時；
[0046]S6.將步驟S5.重複I次。
[0047]S7.發酵結束，將發酵液稀釋2倍，用旋渦式攪拌槳以的300轉/分鐘速度攪拌，再勻速緩慢加入1.2倍丙酮，攪拌半小時，離心將上清液倒掉，固體烘乾粉碎。得到韋蘭膠IlOgo
[0048]上述參照實施例對割罐法發酵生產韋蘭膠的方法的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可根據所限定範圍例舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範`圍之內。
【權利要求】
1.一種割罐法發酵生產韋蘭膠的方法，其特徵在於:依次步驟如下: . 51.菌種保藏斜面的製備:將產鹼桿菌ATCC31555接種到培養基斜面上，於30°C恆溫培養2-4天待用；斜面培養基組成包括:蔗糖15g，酵母粉3g，蛋白腖5g，牛肉膏5g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1L，pH值7.0 ;所用菌種:鞘氨醇單胞菌ATCC31555 ； .52.上述斜面用於接種至滅菌後的一級液體種子培養基中，一級液體種子培養基組成包括:葡萄糖15_20g，酵母粉4-8g，牛肉膏4-8g，蛋白腖3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4.0.01-0.03g，用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ; 將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後用接種環從菌種保藏斜面上挑I環菌體接入上述冷卻的液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於.30°C、轉速為150rpm的搖床上培養24h，得到一級液體種子； .53.上述一級液體種子用於接種至滅菌後的二級級液體種子培養基中，二級液體種子培養基組成包括:葡萄糖15_20g，酵母粉4-8g，蛋白腖3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4.0.01-0.03g，用蒸餾水定容至lL，pH值7.0 ; 將液體種子培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後將一級液體種子按10%接種量接入上述冷卻的二級液體種子培養基中，500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，搖瓶於28_38°C、轉速為120-200rpm的搖床上培養12_24h，得到二級液體種子； .54.上述二級液體種子培養基用於接種至滅菌後的5L發酵罐中，發酵罐培養基組成包括:玉米澱粉水解液 250-400ml, NaNO3 3.0-4.0g, MgSO40.2-0.4g, K2HPO4 4.5-6.0g, CaCO3.1.0-2.0g, FeS04 0.001-0.005g，蛋白腖 5_10g，用蒸餾水定容至 3L，pH 值 5.0-8.0 ； 將發酵罐培養基於115°C、15min滅菌再冷卻；然後按照體積比5-12%的接種量將液體培養基接入上述冷卻的發酵罐培養基中，發酵溫度28-38°C，溶氧控制在30-40% ； .55.發酵14-30個小時後，將發酵液排出1-2.5L，並將滅過菌的1_2.5L液體發酵培養基加入5L小罐中，繼續在28-38°C條件下培養10-20個小時；上述操作重複1_3次。 .56.發酵結束，將發酵液用水稀釋0-3倍，用旋渦式攪拌槳以300-400轉/分鐘速度攪拌，再勻速緩慢加入0.8-1.3倍體積的丙酮，攪拌半小時，離心將上清液倒掉，固體烘乾後粉碎，得到韋蘭膠的產量為20-40g/L。
【文檔編號】C12R1/05GK103695498SQ201210364669
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年9月27日 優先權日:2012年9月27日
【發明者】李紅芬, 梁軍軍, 劉雲 申請人:天津科百生物科技研發有限公司