一種乾巴菌菌種的分離培養方法
2023-04-28 12:44:36
一種乾巴菌菌種的分離培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種乾巴菌菌種的分離培養方法，包括採樣、表面滅菌、分離及純培養步驟，具體包括：在雲南松林地中選擇幼嫩的乾巴菌子實體進行採樣並進行保藏；將採集的乾巴菌子實體進行表面滅菌處理；切取乾巴菌子實體置入乾巴菌組織分離培養基的培養基平面或試管斜面中，培養，再接種至乾巴菌固體培養基的培養基平面或試管斜面中，培養得到目標物，移入含有針葉林廢棄物做培養基質的乾巴菌菌種培養基的試管斜面保存。本發明是選用野生乾巴菌的幼嫩子實體活體，在雲南松生長乾巴菌的林地現場採集，迅速組織分離，用松樹皮、松木屑、松毛等針葉林廢棄物做培養基質培養得到，得到的乾巴菌菌種繁殖穩定性好、成活率達99.9%以上且長勢良好。
【專利說明】一種乾巴菌菌種的分罔培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於菌種培養【技術領域】，具體涉及一種乾巴菌菌種的分離培養方法。
【背景技術】
[0002]乾巴菌(Thelephota.ganbajun.Zang)屬擔子菌亞門層菌綱非裙菌目革菌科革菌屬的大型真菌，其子實體叢生，呈珊瑚狀多次分枝。野生乾巴菌是雲南滇中特有的珍稀野生食用菌，屬於與松樹共生的外生菌根菌。科學研究記載，乾巴菌幹品含粗蛋白24.15%，粗纖維8.45%，總糖量3.1%，10g含維生素Cl.1Omg,維生素A16.0mg，B族維生素1.2mg,維生素E45.14 mg;含有18種胺基酸和人體必需的8種胺基酸，其比值為55%，是優質的蛋白質；乾巴菌中含有的多種微量元素鐵、鉀、鈉、磷、鋅、鎂、銅、錳、鈣，特別是人體普遍缺乏的硒元素，其含量高達4603.59Pg/100g，屬於罕見的富硒珍貴野生菌；同時，乾巴菌的香氣揮髮油有49種成分，量較大的是亞油酸甲酯；近年來，研究新發現在乾巴菌中還含有高度抗氧化活性的對聯三苯系列色素，而抗氧化物質能清除人體內的自由基，具有延緩衰老的功效。硒是聯合國衛生組織確定的唯一的防癌抗癌元素，適量的硒幾乎能防止一切癌變，並能防止人體的四十多種疾病。因此，乾巴菌除了是美味野生菌外，其更具有保健和膳食補充價值。近十年來，人們試圖用人工栽培技術培育乾巴菌，但除了一些試驗性報導外，至今仍未實現人工化栽培。本發明的目的就是解決在野生乾巴菌資源日趨稀缺現狀下，利用人工培育的乾巴菌菌種的乾巴菌菌絲及擴繁技術，將有效的增加野外乾巴菌菌絲數量並保護野生乾巴菌的資源。
[0003]由於野生乾巴菌是雲南特有的珍稀野生食用菌，尤以生長在滇中的雲南松森林裡面的味道最佳，由於屬於外生菌根菌，很難實現人工栽培，雖然目前存在一些人工栽培的方法，均存在成活率低、不能保證菌種栽培繁殖的穩定性等等問題，因此，開發一種能解決上述技術問題的乾巴菌分離培養方法是非常必要的。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種乾巴菌菌種的分離培養方法。
[0005]本發明的目的是這樣實現的，包括採樣、表面滅菌、分離及純培養步驟，具體包括:
A、採樣:在雲南松林地中選擇生長Γ7天以內的乾巴菌子實體進行採樣並進行保藏；
B、表面滅菌:將採集的乾巴菌子實體進行表面滅菌處理；
C、分離及純培養:從滅菌處理後的乾巴菌子實體掰開，切取0.Γ0.2cm的乾巴菌子實體置入由馬鈴薯15(T250g、葡萄糖l(T30g、瓊脂2(T30g、蛋白腖5?7g、松樹皮和/或松毛4(T60g、磷酸二氫鉀2?4g、硫酸鎂4?6g製備得到的乾巴菌組織分離培養基的培養基平面或試管斜面中，於2(T26°C下避光培養36?72h，再接種至由棉籽殼或蕎籽4(T70g、松木屑和/或松毛3(T50g、麩皮(Tl5g、石膏粉0.5^1.5g製備得到的乾巴菌固體培養基的培養基平面或試管斜面中，於2(T26°C下避光培養6?8天得到目標物，移入乾巴菌固體培養基的試管斜面保存。
[0006]本發明是選用野生乾巴菌的幼嫩子實體活體，在雲南松生長乾巴菌的林地現場採集，迅速組織分離，用松樹皮、松木屑、松毛等針葉林廢棄物做培養基質培養得到，得到的乾巴菌菌種繁殖穩定性好、成活率達99.9%以上且長勢良好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1為本發明實施例1製備得到的乾巴菌長勢示意圖；
圖2為本發明實施例2製備得到的乾巴菌長勢示意圖；
圖3為本發明實施例3製備得到的乾巴菌長勢示意圖。
【具體實施方式】
[0008]下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。
[0009]本發明所述乾巴菌菌種的分離培養方法，包括採樣、表面滅菌、分離及純培養步驟，具體包括:
A、採樣:在雲南松林地中選擇生長Γ7天以內的乾巴菌子實體進行採樣並進行保藏；
B、表面滅菌:將採集的乾巴菌子實體進行表面滅菌處理；
C、分離及純培養:從滅菌處理後的乾巴菌子實體掰開，切取0.Γ0.2cm的乾巴菌子實體置入由馬鈴薯15(T250g、葡萄糖l(T30g、瓊脂2(T30g、蛋白腖5?7g、松樹皮和/或松毛4(T60g、磷酸二氫鉀2?4g、硫酸鎂4?6g製備得到的乾巴菌組織分離培養基的培養基平面或試管斜面中，於2(T26°C下避光培養36?72h，再接種至由棉籽殼或蕎籽(T70g、松木屑和/或松毛3(T50g、麩皮(Tl5g、包穀芯和/或包穀面(T40g、石膏粉0.5?1.5g製備得到的乾巴菌固體培養基的培養基平面或試管斜面中，於2(T26°C下避光培養6?8天得到目標物，移入乾巴菌固體培養基的試管斜面保存。
[0010]A步驟中所述的保藏為密封(T4°C低溫保藏。
[0011]A步驟所述的保藏的時間為8?24h。
[0012]B步驟中所述的表面滅菌處理是用65?75%的酒精進行表面消毒滅菌處理。
[0013]C步驟中所述的乾巴菌組織分離培養基由馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂25g、蛋白腖6g、松樹皮和/或松毛50g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂5g製備得到，pH值為6.5^7.5，其製備方法如下:
A、前處理:將馬鈴薯洗淨去皮，按配方比例稱取，切成0.Γ0.6cm片，加固液體積比f 3倍的水於95?110°C煮Γ6π?η，，用雙層紗布過濾得到濾液a ;按配方比例稱取松樹皮和/或松毛，加固液體積比2飛倍的水於95?100°C下熬煮r1min，過濾，得到濾液b ；
B、配製:合併濾液a和濾液b，於95?110°C下加入配方比例的瓊脂粉、葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒攪拌融化，移入試管或培養皿中，於壓力1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌30?40min製備得到。
[0014]C步驟中所述的乾巴菌固體培養基由棉籽殼50g、松木屑35g、麩皮14g和石膏粉Ig製備得到，PH值為6.5^7.5，其製備方法如下:
A、前處理:按配方比例稱取棉籽殼，加入固液體積比2?4倍的水於2(T26°C下浸泡18?30h，過濾，得到濾液c ;
B、配製:在濾液c中加入配方比例的松木屑、麩皮和石膏粉，拌勻並調節含水量為60?65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌10(Tl40min製備得到。
[0015]C步驟中所述的乾巴菌固體培養基由松木屑30g、松毛20g、麩皮10g、包穀芯30g、包穀面9g和石膏粉Ig製備得到，pH值為6.5^7.5，其製備方法如下:
A、前處理:按配方比例稱取包穀芯和松毛，加入固液體積比2?3倍的水於2(T26°C下浸泡24?48h，過濾得到濾液d;
B、配製:在濾液d中加入配方比例的松木屑、麩皮、包穀面和石膏粉，拌勻並調節含水量為60?65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌10(Tl40min製備得到。
[0016]C步驟中所述的乾巴菌固體培養基由蕎籽70g、松木屑29g和石膏粉Ig製備得到，pH值為6.5^7.5，其製備方法如下:
A、前處理:按配方比例稱取蕎籽，加入固液體積比2?3倍的水於2(T26°C下浸泡40?72h，過濾得到濾液e;
B、配製:在濾液e中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌勻並調節含水量為60飛5%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌10(Tl50min製備得到。
[0017]乾巴菌的鑑別特徵:
1、乾巴菌子實體生長是一層一層向外生長；
2、乾巴菌菌絲體10天後，一波一波或一圈一圈的乾巴菌菌絲體中間出現黑色分泌物，培養時間越長，白色菌絲苔越厚，分泌的黑色素越深；
3、乾巴菌菌絲是適應生長在含有松樹皮汁的培養基中，且菌絲長勢旺，菌絲白，用松木屑、松毛、松樹汁液及針葉林廢棄物作培養基質培養乾巴菌，長勢強，菌絲體一波一波、一圈一圈的向下生長，20多天後分泌黑色素。
[0018]注:在人工培養的食用菌中，除茯苓、豬苓、隱孔菌等少數幾個菌種的培養基質可利用針葉林廢棄物做培養料，其他木腐菌是不能利用針葉林木屑的，針葉林木屑中的松油脂對菌絲有毒害作用。而乾巴菌的生長卻有賴於針葉林木屑中的松油脂。
[0019]實施例1
—乾巴菌組織分離培養基製備
培養基配方:馬鈴薯150g、葡萄糖10g、瓊脂20g、蛋白腖5g、松樹皮40g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂4g，其製備方法如下:
將馬鈴薯洗淨去皮,按配方比例稱取,切成0.4cm的片，加固液體積比I倍的水於95°C煮4min，，用雙層紗布過濾得到濾液a ;按配方比例稱取松樹皮，加固液體積比2倍的水於95°C下熬煮4min，過濾，得到濾液b ；合併濾液a和濾液b，於95°C下加入配方比例的瓊脂粉、葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4和MgSO4,用玻璃棒攪拌融化，移入試管或培養皿中，於壓力
1.5Kg/cm2、溫度121°C滅菌3(T40min製備得到。
[0020]實施例2
—乾巴菌組織分離培養基製備
培養基配方:馬鈴薯250g、葡萄糖30g、瓊脂30g、蛋白腖7g、松樹皮40g、松毛20g、磷酸二氫鉀4g、硫酸鎂6g，其製備方法如下:
將馬鈴薯洗淨去皮，按配方比例稱取，切成0.6cm的片，加固液體積比3倍的水於I10C煮6min，用雙層紗布過濾得到濾液a ;按配方比例稱取松樹皮和松毛，加固液體積比5倍的水於100°C下熬煮lOmin，過濾，得到濾液b ;合併濾液a和濾液b，於110°C下加入配方比例的瓊脂粉、葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒攪拌融化，移入試管或培養皿中，於壓力1.5Kg/cm2、溫度121°C滅菌40min製備得到。
[0021]實施例3
—乾巴菌組織分離培養基製備
培養基配方:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂25g、蛋白腖6g、松毛50g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂5g，其製備方法如下:
將馬鈴薯洗淨去皮,按配方比例稱取,切成0.5cm片，加固液體積比2倍的水於100°C煮5min，用雙層紗布過濾得到濾液a ;按配方比例稱取松樹皮和/或松毛，加固液體積比4倍的水於98°C下熬煮8min，過濾，得到濾液b ；合併濾液a和濾液b，於100°C下加入配方比例的瓊脂粉、葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒攪拌融化，移入試管或培養皿中，於壓力1.5Kg/cm2、溫度124°C滅菌35min製備得到。
[0022]實施例4
——乾巴菌固體培養基製備
培養基配方:棉籽殼50g、松木屑35g、麩皮14g和石膏粉lg，其製備方法如下:
按配方比例稱取棉籽殼，加入固液體積比2倍的水於20°C下浸泡30h，過濾，得到濾液；在濾液中加入配方比例的松木屑、麩皮和石膏粉，拌勻並調節含水量為60%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度126°C滅菌10min製備得到。
[0023]實施例5
——乾巴菌固體培養基製備
培養基配方:棉籽殼70g、松木屑40g、麩皮15g和石膏粉1.5g,其製備方法如下:
按配方比例稱取棉籽殼，加入固液體積比4倍的水於26°C下浸泡18h，過濾，得到濾液；在濾液中加入配方比例的松木屑、麩皮和石膏粉，拌勻並調節含水量為65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度126°C滅菌140min製備得到。
[0024]實施例6
——乾巴菌固體培養基製備
培養基配方:棉籽殼20g、松木屑30g、麩皮1g和石膏粉0.5g，其製備方法如下:
按配方比例稱取棉籽殼，加入固液體積比3倍的水於23°C下浸泡24h，過濾，得到濾液；在濾液中加入配方比例的松木屑、麩皮和石膏粉，拌勻並調節含水量為63%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度126°C滅菌130min製備得到。
[0025]實施例7
——乾巴菌固體培養基製備
培養基配方:松木屑30g、松毛20g、麩皮10g、包穀芯30g、包穀面9g和石膏粉lg，其製備方法如下:
按配方比例稱取包穀芯和松毛，加入固液體積比2倍的水於20°C下浸泡24h，過濾得到濾液，在濾液中加入配方比例的松木屑、麩皮、包穀面和石膏粉，拌勻並調節含水量為60%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121°C滅菌10min製備得到。
[0026]實施例8
——乾巴菌固體培養基製備
培養基配方:松木屑20g、松毛10g、麩皮10g、包穀芯35g、包穀面5g和石膏粉1.5g，其製備方法如下:
按配方比例稱取包穀芯和松毛，加入固液體積比3倍的水於26°C下浸泡48h，過濾得到濾液，在濾液中加入配方比例的松木屑、麩皮、包穀面和石膏粉，拌勻並調節含水量為65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度126°C滅菌140min製備得到。
[0027]實施例9
——乾巴菌固體培養基製備
培養基配方:松木屑5g、松毛30g、麩皮15g、包穀芯15g、包穀面20g和石膏粉0.5g，其製備方法如下:
按配方比例稱取包穀芯和松毛，加入固液體積比3倍的水於25°C下浸泡30h，過濾得到濾液，在濾液中加入配方比例的松木屑、麩皮、包穀面和石膏粉，拌勻並調節含水量為62%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121°C滅菌120min製備得到。
[0028]實施例10
蕎籽70g、松木屑25g和石膏粉1.5g，其製備方法如下:
按配方比例稱取蕎籽，加入固液體積比2倍的水於20°C下浸泡40h，過濾得到濾液，在濾液中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌勻並調節含水量為60%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度126°C滅菌10min製備得到。
[0029]實施例11
蕎籽50g、松木屑35g和石膏粉0.5g，其製備方法如下:
按配方比例稱取蕎籽，加入固液體積比3倍的水於26°C下浸泡72h，過濾得到濾液，在濾液中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌勻並調節含水量為65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121°C滅菌150min製備得到。
[0030]實施例12
蕎籽50g、松木屑30g和石膏粉lg，其製備方法如下:
按配方比例稱取蕎籽，加入固液體積比2.5倍的水於2(T26°C下浸泡48h，過濾得到濾液，在濾液中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌勻並調節含水量為64%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121°C滅菌120min製備得到。
[0031]實施例13
在江川縣安化鄉雲南松林地選擇生長Γ7天以內的乾巴菌子實體進行採樣，在現場將採集到的乾巴菌子實體用75%的酒精棉球作表面消毒處理，掰開子實體，用解剖刀切取
0.1cm的乾巴菌子實體置入實施例2製備的培養基中，置20°C下避光培養36h後菌絲萌發，挑取尖端菌絲再接入實施例6製備的培養基中，於20°C下避光培養6天得到目標物。本實施例製備得到的菌絲潔白，層次分明，長勢旺，轉色好，見附圖1，經鑑別，目標物為乾巴菌。
[0032]實施例14
在江川縣安化鄉雲南松林地選擇生長Γ7天以內的乾巴菌子實體進行採樣，將採集到的乾巴菌子實體用75%的酒精棉球作表面消毒處理，掰開子實體，用解剖刀切取0.2cm的乾巴菌子實體置入實施例1製備的培養基中，置26°c下避光培養48h後菌絲萌發，挑取尖端菌絲再接入實施例5製備的培養基中，於26°C下避光培養8天得到目標物。本實施例製備得到的菌絲潔白，層次分明，長勢旺，轉色好，見附圖2，經鑑別，目標物為乾巴菌。
[0033]實施例15
在江川縣安化鄉雲南松林地選擇生長Γ7天以內的乾巴菌子實體進行採樣，將採集到的乾巴菌子實體用75%的酒精棉球作表面消毒處理，掰開子實體，用解剖刀切取0.15cm的乾巴菌子實體置入實施例1製備的培養基中，置25°C下避光培養72h後菌絲萌發，挑取尖端菌絲再接入實施例5製備的培養基中，於26°C下避光培養7天得到目標物。本實施例製備得到的菌絲潔白，層次分明，長勢旺，轉色好，見附圖3，經鑑別，目標物為乾巴菌。
【權利要求】
1.一種乾巴菌菌種的分離培養方法,其特徵在於包括米樣、表面滅菌、分離及純培養步驟，具體包括: A、採樣:在雲南松林地中選擇生長Γ7天以內的乾巴菌子實體進行採樣並進行保藏； B、表面滅菌:將採集的乾巴菌子實體進行表面滅菌處理； C、分離及純培養:將滅菌處理後的乾巴菌子實體掰開，切取0.Γ0.2cm的乾巴菌子實體置入由馬鈴薯15(T250g、葡萄糖l(T30g、瓊脂2(T30g、蛋白腖5?7g、松樹皮和/或松毛4(T60g、磷酸二氫鉀2?4g、硫酸鎂4?6g製備得到的乾巴菌組織分離培養基的培養基平面或試管斜面中，於2(T26°C下避光培養36?72h，再接種至由棉籽殼或蕎籽(T70g、松木屑和/或松毛3(T50g、麩皮(Tl5g、包穀芯和/或包穀面(T40g、石膏粉0.5?1.5g製備得到的乾巴菌固體培養基的培養基平面或試管斜面中，於2(T26°C下避光培養6?8天得到目標物，移入乾巴菌固體培養基的試管斜面保存。
2.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於A步驟中所述的保藏為密封(T4°C低溫保藏。
3.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於A步驟所述的保藏的時間為8?24h。
4.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於B步驟中所述的表面滅菌處理是用65?75%的酒精進行表面消毒滅菌處理。
5.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於C步驟中所述的乾巴菌組織分離培養基由馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂25g、蛋白腖6g、松樹皮和/或松毛50g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂5g製備得到，pH值為6.5^7.5，其製備方法如下: A、前處理:將馬鈴薯洗淨去皮，按配方比例稱取，切成0.Γ0.6cm片，加固液體積比f 3倍的水於95?110°C煮Γ6π?η，用雙層紗布過濾得到濾液a ;按配方比例稱取松樹皮和/或松毛，加固液體積比2飛倍的水於95?100°C下熬煮r1min，過濾，得到濾液b ； B、配製:合併濾液a和濾液b，於95?110°C下加入配方比例的瓊脂粉、葡萄糖、蛋白腖、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒攪拌融化，移入試管或培養皿中，於壓力1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌30?40min製備得到。
6.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於C步驟中所述的乾巴菌固體培養基由棉籽殼50g、松木屑35g、麩皮14g和石膏粉Ig製備得到，pH值為6.5^7.5，其製備方法如下: A、前處理:按配方比例稱取棉籽殼，加入固液體積比2?4倍的水於2(T26°C下浸泡18?30h，過濾，得到濾液c; B、配製:在濾液c中加入配方比例的松木屑、麩皮和石膏粉，拌勻並調節含水量為60?65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌10(Tl40min製備得到。
7.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於C步驟中所述的乾巴菌固體培養基由松木屑30g、松毛20g、麩皮10g、包穀芯30g、包穀面9g和石膏粉Ig製備得到，PH值為6.5^7.5，其製備方法如下: A、前處理:按配方比例稱取包穀芯和松毛，加入固液體積比2?3倍的水於2(T26°C下浸泡24?48h，過濾得到濾液d; B、配製:在濾液d中加入配方比例的松木屑、麩皮、包穀面和石膏粉，拌勻並調節含水量為60?65%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌10(Tl40min製備得到。
8.根據權利要求1所述的乾巴菌菌種的分離培養方法，其特徵在於C步驟中所述的乾巴菌固體培養基由蕎籽70g、松木屑29g和石膏粉Ig製備得到，pH值為6.5^7.5，其製備方法如下: A、前處理:按配方比例稱取蕎籽，加入固液體積比2?3倍的水於2(T26°C下浸泡40?72h，過濾得到濾液e; B、配製:在濾液e中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌勻並調節含水量為60飛5%，移入菌種瓶或塑膠袋中，封口，於1.5Kg/cm2、溫度121?126°C滅菌10(Tl50min製備得到。
【文檔編號】C05G3/00GK104381023SQ201410739268
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】羅星野, 羅健, 陳天蓉 申請人:羅星野, 羅健, 陳天蓉