一種利用微波照射的簡單、有效且加速的酶催化體外核酸修飾及合成方法

2023-04-28 15:43:36

專利名稱：一種利用微波照射的簡單、有效且加速的酶催化體外核酸修飾及合成方法
技術領域：
本發明涉及利用2300至2500MHz、600至900瓦特輸出功率的不間斷短暫(brief)微波照射5至120秒的、簡單、有效、且加速的酶催化體外核酸修飾及合成方法，；以及進一步，利用所述方法的裝置。
背景技術：
對於分子生物學家來說核酸酶促反應是重要的。分子生物學中最常使用的酶促反應有位點特異性切割、連接、去磷酸化、磷酸化(激活)和體外DNA和RNA合成反應。這些反應由不同的酶例如限制性內切核酸酶、連接酶、磷酸酶、激酶、DNA聚合酶、反轉錄酶和RNA聚合酶完成。這些反應產物在分子生物學中有廣泛的用途。
幾種限制性內切核酸酶(RENs)的發現開創了現代分子生物技術。這些酶通過在相對鏈上產生切割而催化雙鏈DNA的序列特異性水解切割。
連接酶是另一種重要的酶，它能夠通過在雙鏈DNA的相容性末端和DNA-DNA和DNA-RNA雜合體中的單鏈切口之間形成磷酸二酯鍵來修飾核酸。[Engler，M.J.和Richardson，C.C.(1982)，The Enzymes(Boyer，P.D，ed)第5卷，p.3，Academic Press，San Diego]。DNA連接酶催化反應的產物是基因克隆和操作所必需的。
磷酸酶催化核酸末端磷酸基團的去除[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)Molecular cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork]並且是在克隆和用[γ32P]ATP做末端標記中降低載體背景所必需的。
多核苷酸激酶通過從ATP的γ位轉移或交換磷酸基團至多核苷酸羥基末端(雙和單鏈DNA和RNA)以及核苷3』單磷酸來對核酸進行修飾[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，(1989)Molecularcloning，A Laboratory Manual，second edition，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York]。
由相應的聚合酶催化的模板指導的DNA和RNA合成是在重組DNA研究中常規進行的。DNA模板指導的DNA合成用於通過切口平移製備放射性標記的雜交探針[Rigby等人(1977)，J.Biol.Chem.113237]、DNA片段標記和用於連接的末端填平反應、第二鏈cDNA合成、聚合酶鏈式反應(PCR)、DNA測序等。
由反轉錄酶催化的RNA模板指導的DNA合成是cDNA合成以及經RT-PCT的基因擴增所必需的。DNA模板指導的RNA合成(轉錄)被用於RNA聚合酶特異性啟動子的鑑定、耦聯的轉錄和翻譯反應以及製備高度標記的RNA探針等。
這些方法在傳統上是通過在保持於使酶表現最大活性的適宜溫度下的水浴中溫育來完成的。根據特定酶和底物及其濃度，溫育時間從幾分鐘至幾小時。為實現特定目的，大多數反應常常需要連續完成，因為一個反應的產物就是另一個反應的底物。即使這些反應中的大多數需要幾分鐘至幾小時，為完成特定反應組的總時間還是相當高的。通常優選給出較長的反應時間以保證反應完全。
傳統方法的缺陷是反應時間長，而且分子生物學家不得不花費他們大量的寶貴時間用這些酶來完成這項耗時的試驗。加速酶催化反應的一種途徑是激活酶或底物之中任一或兩者。有機反應通常通過加熱來促進，但是由於酶而使這並非總是可行的，因為大多數酶都是容易熱失活的。加速化學或生物反應的另一途徑是使用微波作為能量來源。實際上，使用微波來加速有機反應的速率很早就已知了。
1986年，Gedbye等人和Giguere等人證明了通過微波照射可以非常快的進行許多有機反應[Gedye，R.N.等人，Tetrahedron Lett.(1986)，26，279；Giguere，R.J等人，Tetrahedron Lett.(1986)，27，4945-4948]。自此後，許多作者在大量有機反應中證實了「微波誘導的有機反應增強」(MORE)化學的多樣性，例如催化氫化反應、Diels-Alder反應、自由基反應、醯化作用、脫醯化作用等[Bose.A.K，等人，Res.Chem.Intermed.(1994)20，1-11；Bose.A.K等人，J.Org.Chem.(1991)56，6968-6970；Nahar，P.Tetrahedron Lett.(1997)，38，7253-7254]。實踐中所有這些反應都在以2450MHz的頻率和約700瓦特的最大輸出功率下於家用微波爐中完成。通常這些微波爐根據不同的輸出功率有10級水平，第十級水平具有最大輸出功率而第一級具有微波爐的最低輸出功率。儘管微波反應的主要優點是時間上的大大減少，但是也報導了反應的選擇性或特異性[Nahar，P.TetrahedronLett.(1997)，38，7253-7254]。
微波能量已被成功應用於蛋白質分析[Akins，Jr.等人；U.S.專利號5,403,747和5,478,748]和免疫組織化學[Boon，M.E.等人；Am.J.Clin.Pathol.(1989)，Boon，M.E.等人；In Microwave Cookbook ofPathologyThe art of Microscopic Visualisation]。還研究了利用微波照射的腺苷三磷酸的水解[Jahngen，E.G.E.等人J.Org.Chem.(1990)55，3406-3409]。
數位研究者已經研究了微波照射對生物聚合物的效應，尤其是對酶和DNA。然而，關於微波照射對生物分子的效應卻有著相反的報導。在一些情況中，微波被用於使小型試驗動物的大腦酶失活[Galli Claudio和Racagni Giogio，Methods in enzymology，(1982)86，636-642]。然而，Byus，C.V.等人，已經發現用微波能量使得培養細胞鳥氨酸脫羧酶活性提高[Byus等人，Cancer Res.(1988)48，4222-4226]。還有報導說同時觀察到了細胞酶活性的增強和抑制[Dutta，S.K.和Verma，M.Current Scince(1989)58，58-63；Dutta，S.K.和Verma，M.CurrentScince(1988)57，779-786]。Maleev，V.Ya.等人不能發現DNA增強微波吸收後的任何效果(Maleev，V.Ya.等人。Biopolymers(1987)26，1965-1970)。然而，根據Narasimhan等人，DNA分子暴露於微波後能夠表現出單鏈斷裂、雙鏈斷裂、局部鏈分離等[Narasimhan，V.和Huh，W.K.；Biochem.International(1991)25，363-370]。
儘管Jhingan(U.S.專利號5,350,686)報導了用限制性酶對核酸的消化，但是在之前並未報導微波對核酸合成及修飾的酶促反應的增強。作者通過利用處於最低功率水平(該水平是標準微波爐700瓦特輸出功率的10％)的微波能用限制酶消化了DNA。反應過程中，作者還利用了一系列的時間間隔，在這些間隔中沒有對反應混合物施加微波功率。在該方法中，大多數酶用於消化反應的總反應時間介於6至15分鐘。然而，當一些質粒DNA對照樣品在37℃溫育時，它們產生完全消化產物。從該試驗，並不清楚微波照射多大程度影響了上述酶促反應，因為大多數反應時間內酶都並未獲得適當的微波。在這些情況中似乎時間比微波扮演了更重要的角色。
已經報導的、微波介導的酶催化大分子修飾的方法(U.S.專利號5,350,686)有幾個缺陷，例如(1)所費時間不夠吸引人。在微波爐外37℃下相同時間內一些限制酶的消化反應有可能得到相當的結果，(2)該方法需要一系列間隔，在這些間隔中微波功率並不施加於反應混合物，(3)酶促反應沒有一致的條件。在大多數情況中，作者對使用限制酶的消化反應使用了不同的微波暴露時間，以及(4)由於(a)長反應時間和(b)反應條件的非一致性使得該方法的自動化不太奏效。
申請人在本發明中已經克服了所有上述缺陷。對於任何反應都需要一個最適宜的條件。最適宜的熱能使得酶促反應加速，在溫和條件下(低於最適宜條件)反應減緩，而在劇烈條件下(高於最適宜條件)酶失活。對於利用微波能的反應來說也是一樣。如果沒有保持最適宜條件，那麼酶促反應就可能被破壞或者給出不完全反應產物。在本發明中，發現了適宜的反應條件，其中大多數與已報導的方法相反、或者在現有技術中是未知的。
此外，除酶和底物之外，藉助微波的酶促反應大大依賴於反應混合物的組成。緩衝液、其pH、鹽濃度和其它成分在酶促反應中起重要作用，更特別是在微波中完成反應的時候。我們已經發明了，在含有50％(v/v)甘油的稀釋緩衝液中，當限制酶持續暴露於高功率微波下時會失活，甚至暴露很短的時間(15秒及以上)，而在37℃的常規反應中它保持有活性。當需要稀釋高濃度酶時稀釋緩衝液由供應商推薦。
與Jhingan(U.S.專利號5,350,686)所報導的工作相反，我們現在已經發明，生物大分子的酶促修飾可以在微波爐最高輸出功率設置下完成，該微波爐在2450MHz頻率和700瓦特功率下工作。此外，我們還發現，在微波介導的酶促反應過程中不需要間斷，這再次與上述工作相反。
發明目的本發明的主要目的是提供快速有效的酶促反應方法，以產生在分子生物學和重組DNA技術及其它領域中必需的這些酶催化反應的特異性產物。
本發明的另一目的是提供一種方法，它簡單、可重複並且不需要另外的專門技術或昂貴的儀器。
本發明的再一目的是提供一種方法，它能夠以簡單的方式自動化以在單個裝置中完成生物技術或分子生物學中使用的大多數酶促反應。
本發明的另一目的還是，開發涉及照射但不導致對酶不利效果的方法。
發明概述本發明涉及利用2300至2500MHz、600至900瓦特輸出功率的不間斷短暫微波照射5至120秒的、簡單、有效、且加速的酶催化體外核酸修飾及合成方法，；以及進一步，利用所述方法的裝置。
發明詳述因此，本發明涉及一種利用不間斷短暫微波照射的簡單、有效、且加速的酶催化體外核酸修飾及合成方法。
在本發明的一種實施方式中，提供了在小微量離心管中或小片石蠟膜(parafilm)上的反應混合物，它含有(i)選自限制性內切核酸酶、連接酶、磷酸酶、激酶、反轉錄酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶的酶，(ii)用作所選擇酶的底物的選自DNA、RNA或寡核苷酸的生物分子，(iii)適合特定酶的緩衝液以及(iv)其它成分。
在本發明另一實施方式中，將載有反應混合物的所述微量離心管或石蠟膜片放進微波爐。
在本發明進一步的另一實施方式中，用頻率介於2300至2500MHz的微波以介於600至900瓦特的輸出功率持續照射所述微量離心管或石蠟膜。
在本發明進一步的另一實施方式中，時間介於5至120秒。
在本發明進一步的另一實施方式中，通過加入乙二胺四乙酸(EDTA)和/或在75℃水浴中加熱3-15分鐘使反應終止，之後加入凝膠上樣染料。
在本發明進一步的另一實施方式中，用瓊脂糖凝膠電泳、放射自顯影、放射性計數、和常規程序中所使用的其它技術對反應產物進行分析。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中核酸選自DNA、RNA、和寡核苷酸。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所用的其它成分選自MgCl2、MgSO4、NaCl、KCl、CH3COOK、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、亞精胺、BSA、triton x-100、核苷酸、模板DNA、模板RNA、和寡核苷酸引物。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中限制性內切核酸酶選自Hind III、BamHI、EcoRI、Hae III、Bgl II、Pst I、Bst E II、和Bst NI。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所用的連接酶是T4 DNA連接酶。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所用的激酶是T4多核苷酸激酶(TPNK)。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所用的磷酸酶是牛腸鹼性磷酸酶(CIP)。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中聚合酶選自大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段、T7 RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所用的反轉錄酶是禽成髓細胞瘤病毒-反轉錄酶(AMV-RT)。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所用的DNA選自基因組DNA、λ噬菌體DNA、質粒DNA、杆狀病毒DNA、植物DNA、和哺乳動物DNA。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中核酸的雙重消化使用了不只一種限制性內切核酸酶。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中雙重消化所用的限制性內切核酸酶是EcoRI和Hind III。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中微波照射可以在能夠產生微波的任何裝置或腔室中完成。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中所述方法可通過經特異設計的裝置部分或完全自動化。
在本發明進一步的另一實施方式中，適於完成酶促反應的裝置如上所述。
在本發明進一步的另一實施方式中，反應室由磁電管、排氣扇、纖維光學溫度計、冷卻系統、和旋轉反應平臺組成。
在本發明進一步的另一實施方式中，基於微處理器的計算手段以給出通過適宜硬體軟體完成不同反應的預編程序命令。
在本發明進一步的另一實施方式中，其中在約2450MHz頻率、100瓦特至800瓦特的輸出功率下工作的磁電管是微波來源。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明涉及生物分子位點特異性切割、修飾及合成的快速有效方法。更特別的是，描述了利用短暫不間斷微波照射通過酶催化反應生產經過設計的生物分子。所發明的方法可適用於生物技術，更特別的是分子生物學、基於酶的工業加工以及汙水處理，還適於相關領域的自動化。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明特別涉及通過被微波增強的酶促反應快速有效進行生物分子位點特異性切割、修飾、及體外合成的方法。本發明特別涉及通過短暫持續而不間斷微波照射實施酶催化核酸位點特異性切割、修飾和體外合成的快速有效方法。優選的微波頻率為2000至2800MHz，輸出功率為500至900瓦特。優選的微波照射時間是5至120秒。在更特別由限制性內切核酸酶、連接酶、磷酸酶、激酶、反轉錄酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的反應中實現核酸切割、修飾及合成。這些酶促反應的特異性產物對於分子生物學和重組DNA技術中的基因操作是必需的。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明涉及一種快速製備酶催化反應產物的方法。本發明特別涉及一種完成酶催化的核酸的位點特異性切割、修飾和體外合成的快速、有效方法。核酸的合成、修飾和切割更特別地是在反應中由限制性內切核酸酶、連接酶、磷酸酶、激酶、DNA聚合酶、反轉錄酶和RNA聚合酶催化獲得。這是一種完成位點特異性切割、連接、去磷酸化、磷酸化(kination)和體外DNA和RNA合成反應的非常快速的方法。這些酶催化反應的特異性產物對於分子生物學和重組DNA技術中的基因分析和操作來說是必需的。
在本發明進一步的另一實施方式中，為實現本發明目的並克服酶促反應已知方法的不足，通過微波介導的酶促反應為核酸的位點特異性切割、修飾和體外合成提供了一種快速有效的方法。本發明中完成了分子生物學中使用的酶促反應，即位點特異性切割、連接、去磷酸化、磷酸化(激活)，體外DNA合成和體外RNA合成。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明包括(a)將含有酶、底物、適宜緩衝液和其它成分(如實施例中所述)的反應混合物在處於微波爐最高輸出功率(700瓦特)的微波爐中短暫且不間斷地暴露於微波。
在本發明進一步的另一實施方式中，該方法在5至120秒內導致核酸的位點特異性切割、修飾和體外合成。由本發明方法完成的酶促反應顯示了使該方法多樣化的可重複結果。為大分子，更特別是核酸，的切割、修飾和合成公開了對酶-底物反應混合物的短暫且不間斷微波暴露不超過140秒這一新發現。
在本發明進一步的另一實施方式中，就目前已知對酶催化的核酸位點特異性切割、修飾和體外合成而言這是一種非常快速的方法。本發明方法中的體外合成包括DNA模板指導的DNA和RNA合成和RNA模板指導的DNA合成(反轉錄)。該方法具有自動化的潛力。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明的新穎性是，大多數反應在5-150秒內完成，其中微波效應得到時間效應的清楚證實。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明的另一新穎性是這一發現處於含有50％(v/v)甘油的稀釋緩衝液中的限制性酶短時間暴露於高輸出功率的微波能時它會喪失其酶促特性。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明的另一新穎性是，處於消化緩衝液中的限制性酶短時間(至少140秒)不間斷暴露於高輸出功率(700瓦特)的微波能時它會保持其活性。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明的另一新穎性是與已經報導的方法相反其反應條件更加一致，在已經報導的方法中大多數情況下，由不同限制性酶做的DNA消化需要不同的反應條件。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明的另一新穎性是幾乎所有通常在分子生物學中使用的酶促反應可以通過本發明的方法完成。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明的另一新穎性是可以通過簡單的方式將本發明自動化以在單一的裝置中完成大部分酶促反應。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明通過微波誘導的酶促反應，即位點特異性切割、連接、去磷酸化、磷酸化(激活)、體外DNA合成和體外RNA合成，為核酸的位點特異性切割、修飾和體外合成提供了一種快速有效的方法。該方法包括將含酶反應混合物在處於最高功率水平的微波爐中短時間不間斷地暴露於微波。酶促反應是精細的方法，其中不適當的條件會妨礙結果。
在本發明進一步的另一實施方式中，本發明人已經發現了在微波爐最高功率水平微波下(700瓦特)暴露5至120秒的短時間後的酶促活性。我們的結果與報導(U.S.專利號5,350,686)相反，該報導中在更低的功率水平下微波暴露後酶失活。這可能是由於這一事實，現有技術使用了15至31分鐘這一長得多的照射時間以及不同次數的間隔。本發明人通過在最高功率水平下短時間不間斷微波照射完成了酶促反應。
附圖詳述附

圖1。
HindIII暴露於700瓦特微波的穩定性。
將消化緩衝液中的HindIII暴露於微波不同時間0(泳道1)、30(泳道2)、50(泳道3)、70(泳道4)、90(泳道5)、110(泳道6)和130(泳道7)秒。對照射了不同時間的HindIII通過λDNA消化進行檢測——將它們暴露於700瓦特的微波50秒。在1.0％瓊脂糖凝膠的各泳道中，載入1.0μg經消化的DNA(實施例1)。
附圖2經700瓦特微波照射的、DNA的限制性內切核酸酶消化。
用20.0μl反應體積中的2.0μg DNA、1.0μl各自消化緩衝液中的各酶完成了以下λDNA經HindIII(泳道2)、BamHI(泳道3)、EcoRI(泳道4)的消化，λDNA經EcoRI和HindIIII的雙重消化(泳道5)，以及PstI對豌豆凝集素cDNA克隆在PUC19載體PstI位點的消化(泳道6)。在EcoRI消化緩衝液中用HindIII和EcoRI完成了雙重消化。對照反應(泳道1)中，20.0μl HindIII消化緩衝液中使用了2.0μg λDNA，不含酶。在1.0％瓊脂糖凝膠各泳道中加載了1.0μgDNA(實施例2)。
附圖3在微波爐中由T4 DNA連接酶催化的λHindIII片段的連接以及由HindIII催化的所連接DNA的片段化。
泳道1載有在HindIII消化緩衝液中經微波照射50秒的未經切割的λDNA(1.0μg)。泳道2代表經HindIII切割的λDNA(1.0μg)，其通過將反應混合物暴露於微波50秒製備而得。泳道3載有在經HindIII切割的λDNA的連接反應中獲得的產物，其中連接反應在37℃經45分鐘完成。泳道5載有在經HindIII切割的λDNA的連接反應中獲得的產物，其中連接反應在微波照射下20秒完成。將在泳道3和5中得到的DNA再次用HindIII通過微波照射50秒進行切割，並分別載入1.0％瓊脂糖凝膠的泳道4和6中。這些泳道中各自含有1.5μg DNA(實施例3)。
附圖460mer寡核苷酸經T4多核苷酸激酶的激活(kination)。
60mer寡核苷酸(5』CCCCGCCCCGCG 3』)5經T4多核苷酸激酶在微波下暴露20(泳道1)、30(泳道2)、50(泳道3)和0(泳道4)秒(實施例5b)的激活。
附圖5。泳道1。
微波介導的經大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段的DNA合成。
HindIII消化λDNA，之後用大腸桿菌DNA聚合酶I完成末端補齊反應所得產物的1％瓊脂糖凝膠的放射自顯影。這兩個反應都分別通過700瓦特微波照射50和20秒完成(實施例7)。
附圖5。泳道2。
微波介導的消化、去磷酸化、和激活反應。
TPNK催化已經用CIP去磷酸化的DNA EcoRI片段的激活。產物的1％瓊脂糖凝膠的放射自顯影，所述產物如下製得對λDNA進行EcoRI消化，之後用CIP對EcoRI片段5』-末端去磷酸化，並用TPNK對已經去磷酸化的EcoRI片段5』-末端激活(實施例5a)。
附圖6微波介導的、經AMV-RTase的E-選擇蛋白mRNA模板指導的cDNA合成。
當AMV-RTase催化反應產物於48℃在45分鐘內(泳道2)用Tf1 1DNA得到了一個501bp特異性cDNA，所述反應產物通過微波照射10(泳道1)、30(泳道3)和50(泳道4)秒得到。RT-PCR反應產物在1.4％瓊脂糖凝膠中做分析(實施例8)。
附圖7微波介導的、經AMV-RTase的合成mRNA模板指導的cDNA合成。
當AMV-RTase催化反應產物於48℃在45分鐘內(泳道3)用Tf1 1 DNA聚合酶進行PCR擴增時得到了一個323bp特異性cDNA，所述反應產物通過微波照射30(泳道5)和50(泳道6)秒得到。RT-PCR反應產物在1.4％瓊脂糖凝膠中做分析。在對照反應中，泳道2(45分鐘48℃)和泳道4(50秒微波暴露)未添加RNA模板(1151nt體外合成的RNA，獲自Promega)。泳道1中，載有pBR 322 BstN1標記DNA(實施例9)。
表1現有技術與本發明的比較以及本發明相對現有技術的優點



在本發明進一步的另一實施方式中，本發明包括經微波誘導的酶促反應完成的核酸位點特異性切割、修飾和體外合成，即限制性內切核酸酶消化、連接、去磷酸化、磷酸化(kination)、體外DNA合成、反轉錄和體外RNA合成，的快速有效方法。該方法包括將含有酶和底物的混合物在處於最大輸出功率的微波爐中短期連續暴露於微波。
在本發明進一步的另一實施方式中，該方法導致核酸在5至120秒內的高度選擇性特異性切割、修飾和合成。所有反應進行不同的微波暴露持續時間以尋找最適宜的反應時間。各自的酶在微波照射下對其反應混合物所產生的產物與通過常規方法在最適宜溫度(37℃或以下)進行30分鐘至數小時所產生的一致。在微波爐外進行相同時間(與由微波介導的反應所使用的時間一樣)的對照反應未產生目的反應產物。用或不用酶時出現的非特異性DNA條帶的缺失顯示，微波既不誘導非特異性核酸酶活性也不導致由本發明反應條件產生的DNA片段化。
在本發明進一步的另一實施方式中，研究了HindIII在最高功率水平(700瓦特)下在微波中暴露0-130秒的穩定性。觀察到，在700瓦特下照射0-130秒後，HindIII在含有50％甘油(v/v)的稀釋緩衝液中失去其活性。
在本發明進一步的另一實施方式中，相反，發現在700瓦特下微波照射0-130秒後，相同的酶(HindIII)在其消化緩衝液(反應混合物的總甘油含量為6.25％v/v)中是穩定的(實施例1，附圖1)。
在本發明進一步的另一實施方式中，我們已經發現，通過本發明的方法，即在最高功率水平對反應混合物不間斷持續微波照射，可以完成限制性內切核酸酶消化。這與報導的方法相反，在已報導的方法中發現酶在最高功率水平喪失其活性。
在本發明進一步的另一實施方式中，該方法導致核酸在相當少的時間內以最高特異性(經過消化的DNA是可再連接的)的高度選擇性消化。當含有底物DNA、酶和相容緩衝液的混合物暴露於最高功率水平的微波時，限制性酶例如BamHI、EcoRI、HindIII、HaeIII、BglII、PstI和BstEII的內切核酸酶活性被增強。在典型試驗中，當暴露於微波30-70秒後，在20μl反應體積中1μg λDNA被5-20單位(如New EnglandBiolabs所定義的)各限制性酶完全消化(實施例2，附圖2)。在暴露於微波的相同時間內，還發現底物DNA用兩種酶例如EcoRI和HindIII的雙重消化也是完全的。經本發明方法的限制性內切核酸酶消化的另一優點是，該方法對於很寬範圍內的限制性內切核酸酶以及底物DNA都相當一致。底物DNA包括λ噬菌體、杆狀病毒、質粒、植物和哺乳動物。用本發明的、和常規的程序，通過連接反應來核實根據本發明方法的限制性酶催化的底物DNA位點特異性切割。
在本發明進一步的另一實施方式中，由HindIII產生的交錯切割的DNA片段和由HaeIII產生的平末端DNA片段在10至15秒內通過微波照射被T4 DNA連接酶完全連接。根據各常規方法於16℃ 8小時完成對照試驗。
在本發明進一步的另一實施方式中，將由限制性內切核酸酶產生的DNA片段(由常規的以及本發明的方法)用作連接反應的底物，將所連接的DNA再次用相同的酶做限制性內切核酸酶消化時產生了相同的特異性片段(實施例3，附圖3)。
在本發明進一步的另一實施方式中，修飾的核酸即去磷酸化的、磷酸化的和連接的DNA是分子生物學中的重要工具。反應混合物在微波中暴露10-60秒內得到了充足量的所有這些產物，與常規方法相比這是一個顯著縮短的反應時間。因此，用牛腸鹼性磷酸酶(CIP)在微波中經20-50秒的不同時間完成了對由限制性內切核酸酶所產生的DNA片段的末端磷酸基團去磷酸化。當微波介導的反應產物(去磷酸化DNA)不能被T4 DNA連接酶連接但是可以被T4多核苷酸激酶(實施例4)激活時，該反應產物即得到驗證。去磷酸化的、限制性內切核酸酶切割的DNA片段被T4多核苷酸激酶(TPNK)和[γ32P]ATP在微波爐中10至50秒內磷酸化。用三氯乙酸可沉澱計數和放射自顯影兩者估測DNA的磷酸化。在30秒微波反應內獲得的磷酸化程度與由37℃常規反應20分鐘得到的相同(實施例5)。
在本發明進一步的另一實施方式中，還用合成寡核苷酸作為微波爐內激活反應以及之後的去磷酸化反應的底物。對於核酸這兩個反應都以相同的效率發生(實施例5b，附圖4)。在本發明進一步的另一實施方式中，本發明方法中的酶催化體外合成包括DNA模板指導的DNA和RNA合成和RNA模板指導的DNA合成(反轉錄)。
在本發明進一步的另一實施方式中，以切口DNA模板(切口平移)和帶有3』凹陷末端的交錯切割限制性內切核酸酶片段為模板通過微波照射完成了由大腸桿菌DNA聚合酶I催化的DNA依賴的DNA合成。在微波爐中完成了經不同時間的切口平移。DNA合成通過三氯乙酸(TCA)可沉澱計數中[α32P]dCTP的摻入來監控。發現，每微克切口DNA在45秒微波反應中的TCA可沉澱計數與在16℃下常規反應60分鐘的相同。然而發現，在30秒微波反應中所獲得的結果比常規反應的結果要差，而在60秒內獲得的結果比常規反應給出的結果要好(實施例6)。
在本發明進一步的另一實施方式中，通過本發明方法在切口平移中所合成DNA的保真性進一步通過與模板DNA(非切口的)的Southern雜交來驗證。當將含大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段和帶3』凹陷末端的DNA模板的反應混合物暴露於微波時，在20秒內產生了平末端DNA。發現，20秒微波照射中的DNA合成程度與37℃ 30分鐘完成的對照試驗中的相同。微波暴露較少的時間顯示不完全的結果，而較長的時間顯示相同或稍好的結果。微波下合成的DNA經(i)[α32P]dCTP的摻入、(ii)放射自顯影和(iii)與平末端載體DNA(實施例7；附圖5，泳道1)連接，來確定。
在本發明進一步的另一實施方式中發現，RNA聚合酶和反轉錄酶的催化活性在微波影響下加速。因此，用兩個模板RNA和模板特異性引物通過不同時間的微波照射完成了由禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(AMV-RT)催化的RNA指導的DNA(cDNA)合成。發現最適宜的暴露時間是50秒，它給出了與對照反應中相同的合成量，對照反應通過常規方法於48℃ 45分鐘完成。甚至在微波暴露10秒鐘內就出現了可以感知的反應程度。經Tf1聚合酶在反轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)中監控擴增後的cDNA合成(實施例8，附圖6和實施例9，附圖7)。
在本發明進一步的另一實施方式中，DNA指導的RNA合成(轉錄)需要特異性DNA序列(啟動子)以使RNA聚合酶與模板DNA結合引發轉錄。分別用pSPT 18和pSPT 19-新DNA模板(Boehringer MannheimGermany，Cat No.999644)完成了由T7 RNA聚合酶催化的RNA體外合成。通過[α32P]UTP摻入和特定大小轉錄物的合成檢測了由對反應混合物微波照射介於5-20秒不同時間得到的產物。發現在5秒微波反應中得到的三氯乙酸可沉澱計數幾乎與在37℃ 20分鐘完成的常規反應中得到的相同。
在本發明進一步的另一實施方式中，所有反應在約2450MHz頻率、最大輸出功率約700w下工作的家用微波爐(BPL，India)中完成。所有反應在處於最高功率水平(水平10)下的微波爐中實施，這意指700瓦特輸出功率的100％磁電管工作循環，這意味著磁電管負載循環為700瓦特輸出功率的100％。
在本發明進一步的另一實施方式中，如同常規程序，通過緩衝液、底物和酶以確定體積相繼混合進行反應。在本發明進一步的另一實施方式中，所有這些酶催化反應在常規反應所使用的pH和離子環境中完成。反應混合物被置於微量離心管中並置於微波爐轉盤的中心。優選將反應混合物暴露於微波5-120秒。在微波照射期間，保持微量離心管不加蓋。微波照射結束後通過加入乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0)和/或於75℃加熱3-15分鐘立即使反應終止。通過常規方法例如瓊脂糖凝膠電泳、放射自顯影、三氯乙酸(TCA)可沉澱計數、連接、激活、雜交、和轉化，來分析反應產物。將用本發明方法做的所有反應結果與在常規反應中得到的作比較，其中，所述常規反應通過將反應混合物在對該酶的適宜溫度水浴中孵育而完成。
對於核酸的位點特異性切割、修飾和合成，本發明是對迄今現有方法的獨特改進實例。
以下實施例描述了本發明的細節，僅通過舉例說明的方式產生，且由此不應被解釋為對本發明範圍的限制。可以預計，如同下文中所要求的該發明可以在其範圍內作出各種修飾。
實施例1消化緩衝液中的HindIII在暴露於700瓦特微波後的穩定性。
5μl(100單位)HindIII用16μl 10×HindIII消化緩衝液(100mM Tris HCl，pH7.9，500mM NaCl，100mM MgCl2，10mM DTT)與107μl水的混合物稀釋至144μl後，以16μl等分量置於微量離心管中。將各等分量在700瓦特(功率水平10)微波下暴露不同時間0、30、50、70、90、110和130秒。通過常規和微波介導反應對λDNA的消化來檢測各經照射的酶。
向各管中加入4μl(2.0μg)λDNA後用經照射酶完成消化。將其半量放入微量離心管，並如同常規方法一樣在37℃孵育4小時。
在微波介導的反應中，將餘下的一半點在一張石蠟膜上，將膜置於微波爐中心並用700瓦特微波照射50秒。
全部反應產物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，其中各孔中載有1.0μg消化的DNA(附圖1)。
實施例2700瓦特微波照射對DNA的限制性內切核酸酶消化。
將反應混合物點在石蠟膜上在微波爐內50秒同時完成所有消化。在20.0μl反應體積中用2.0μg DNA、1.0μl各自緩衝液中的各酶完成了HindIII、BamHI、EcoRI對λDNA的消化、EcoRI和HindIIII對λDNA的雙重消化以及PstI對豌豆凝集素cDNA克隆在PUC19載體PstI位點的消化。在EcoRI消化緩衝液完成了HindIII和EcoRI的雙重消化。對照反應在20.0μl HindIII消化緩衝液中使用了2.0μg λDNA，不使用酶。每μl酶含有20.0(HindIII和EcoRI)或10.0(BamHI和pstI)單位。1.0％瓊脂糖凝膠各泳道加載1.0μg DNA(附圖2)。
實施例3通過微波照射用HindIII消化λDNA之後用T4 DNA連接酶作連接反應8.0μg DNA在1.5-ml微量離心管內的160.0μl含有5.0μl(100單位)HindIII和16.0μl 10×HindIII消化緩衝液的反應體積中在微波爐內消化50秒，製備了用於連接反應的HindIII片段。
將含有6.0μg HindIII片段、2.0μl 10×連接緩衝液(50mMTris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM DDT、1mM ATP和25μg/mlBSA)和20粘附單位(cohesive unit)T4 DNA連接酶(New EnglandBiolab.Inc.USA)的20.0μl連接反應混合物以10.0μl等分量分置於兩個0.5ml微量離心管中。將一個含有反應混合物的管暴露於微波20秒，另一管在37℃保持45分鐘。65℃加熱5分鐘使反應終止。如上述再通過微波照射用HindIII切割各微量離心管中的一半DNA(1.5μg)。餘下的一半用於通過瓊脂糖凝膠電泳確證連接片段的產生。
在對照試驗中，未切割的λDNA(1.0μg)在HindIII消化緩衝液中用700瓦特微波照射50秒以找出是否有非特異性切割(附圖3)。
實施例4經鹼性磷酸酶的去磷酸化反應。
用5單位牛腸鹼性磷酸酶(Boehringer Mannheim)在含有1.0μgDNA、10mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl2、50mM NaCl和1mM DTT的20μl反應體積於微波爐中完成了λEcoRI片段5』磷酸基團的去磷酸化。微波暴露30秒後，通過加入2μl 0.5mM EDTA(pH8.0)之後於75℃溫育15分鐘使反應終止。DNA通過苯酚-氯仿抽提除去蛋白質，最後用乙醇沉澱。發現由此獲得的經磷酸酶處理的DNA片段不能被T4 DNA連接酶連接但是可以被多核苷酸激酶有效的激活，這證實了30秒內去磷酸化的功效。
實施例5經T4多核苷酸激酶的激活反應。
a)如實施例2中所述用EcoRI經50秒內微波照射使λDNA片段化。
如上述在微波爐中用1.0μg DNA和1.0單位CIP在1.5ml微量離心管內的20.0μl反應體積中完成了經CIP的去磷酸化反應。
將20μl含有T4多核苷酸激酶(Bangalore Genei)、70mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、5mM DTT和20μCi[γ32P]ATP(Sp.活性＞4000Ci/mmole)的反應混合物點在石蠟膜上並暴露於微波20秒，由此完成了0.5μg λDNA去磷酸化EcoRI片段的5』羥基基團的磷酸化。通過加入EDTA(pH8.0)至5mM(終濃度)之後加熱至65℃10分鐘使反應終止。通過旋轉柱(spin column)Sephadex G-50凝膠過濾除去未摻入的放射活性。通過載入0.1μl的反應體積利用放射自顯影驗證DNA片段的磷酸化。
b)如上所述用微波照射不同時間(0，50，30和20秒)完成了T4多核苷酸激酶對0.1μg 60mer寡核苷酸(5』CCCCGCCCCGCG 3』)55』羥基基團的磷酸化(附圖4)。
實施例6經大腸桿菌聚合酶I的DNA合成。
將含有1μg切口λ噬菌體DNA或苜蓿銀紋夜蛾核型多角體(Autographa Californica nucleopolyhedrosis)病毒(AcNPV)DNA模板(用5毫微微克Dnase I處理)、5單位大腸桿菌DNA聚合酶I(NEB)、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgSO4、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA，pentax fraction V)、未標記dATP、dTTP、dGTP(各1nM)、100μCi[α32P]dCTP(Sp.活性＞4000Ci/mmole)的50μl反應體積在微波爐內保持不同時間，完成大腸桿菌DNA聚合酶I催化的DNA合成反應。暴露於微波後加入4μl 0.25M EDTA(pH8.0)使反應終止。經小Sephadex G-50柱離心除去未摻入放射性核苷酸後用三氯乙酸(TCA)沉澱檢測法測定使用各DNA模板的DNA合成。45-秒微波反應中合成的DNA量與在16℃ 60分鐘完成的常規反應中合成的相同。經本發明方法合成的標記DNA與模板DNA的未標記限制性內切核酸酶消化物有效雜交。
實施例7經大腸桿菌聚合酶I Klenow片段的DNA合成在微波爐中20μl反應體積內完成由大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段催化的DNA合成，其中所述反應體積內含有1μg HindIIIλ噬菌體DNA片段(如實施例1所述由微波照射產生的)、1μl(8單位)大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段、50mM Tris HCl(pH7.2)、10mMMgSO4、1mM DTT、50μg/ml BSA、4pmoles[α32P]dCPT(Sp.act.＞4000μCi/mmole)和2n moles各dTTP、dATP、dGTP。將反應混合物點至石蠟膜上，暴露於微波20秒，之後加入4μl 0.25M EDTA(pH8.0)使反應終止。如果使用的是放射性核苷酸，則通過Sephadex G-50旋轉柱除去未摻入的核苷酸。通過TCA可沉澱計數測定DNA合成對模板DNA 3』凹陷末端的補平，並通過放射自顯影以及與平末端載體DNA的連接來確證DNA合成的特異性。由本發明微波反應合成DNA的程度與37℃用常規方法30分鐘得到的相同(附圖5，泳道1)。
實施例8用AMV-RTase完成的、微波介導的E-選擇蛋白mRNA模板指導的cDNA合成。
利用E-選擇蛋白[Tucker等人(1991)J.Biol.Chem.，266，2466-2473]和特異性正向引物，通過將反應混合物分別暴露於微波10、30和50秒，完成了三組不同的由禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(AMV-RTase)催化的cDNA合成試驗。加入模板特異性正向和反向引物和Tf1 DNA聚合酶對第一鏈cDNA反應產物進行擴增後通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定了具有特定大小的cDNA。對E-選擇蛋白mRNA模板所用的正向和反向引物分別是5』-GAGTGGGCATGTGGAATGATG-3』和3』-GGTCTCGGAAGTCACATGGA-5』。將AMY反轉錄酶失活(94℃下2分鐘)後經40循環(94℃ 30秒/變性，60℃ 1分鐘/退火，68℃ 2分鐘/延伸)完成了第二鏈cDNA合成和PCR擴增。50μl反應體積中的RT-PCR反應組合物為50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM亞精胺、10mM DTT、0.2mM dNTP(每種)、1μM正向引物、1μM反向引物、1mM MgSO4、5單位AMV-Rtase和5單位Tf1 DNA聚合酶。加入RNA起始該反應。除了E-選擇蛋白mRNA及其引物，所有RT-PCR反應成分均獲自Promega。
特定大小擴增產物的形成，對於E-選擇蛋白mRNA模板，在本發明以及常規方法中該大小都為501bp，證實了mRNA的特異性第一鏈cDNA合成。50秒內合成的擴增cDNA量比在常規反應中得到的要多(附圖6)。
實施例9用AMV-RTase完成的、微波介導的合成mRNA模板指導的cDNA合成。
利用合成的mRNA模板(獲自Promega的1151nt體外合成的RNA)和特異性正向引物，通過將反應混合物分別暴露於微波10、30和50秒，完成了三組不同的由禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(AMV-Rtase)催化的cDNA合成試驗。加入模板特異性正向和反向引物和Tf1 DNA聚合酶對第一鏈cDNA反應產物進行擴增後通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定了具有特定大小的cDNA。對合成的mRNA模板所用的正向和反向引物分別是5』GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3』和3』GACTGAACTGCCGCCGA-5』。特定大小擴增產物的形成，對於合成的mRNA模板，在本發明以及常規方法中該大小都為323bp，證實了mRNA的特異性第一鏈cDNA合成。50秒內合成的擴增cDNA量比在常規反應中得到的要多。
將AMV反轉錄酶失活(94℃下2分鐘)後經40循環(94℃ 30秒/變性，60℃ 1分鐘/退火，68℃ 2分鐘/延伸)完成了第二鏈cDNA合成和PCR擴增。50μl反應體積中的RT-PCR反應組合物為50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM亞精胺、10mM DTT、0.2mMdNTP(每種)、1μM正向引物、1μM反向引物、1mM MgSO4、5單位AMV-Rtase和5單位Tf1 DNA聚合酶。加入RNA起始該反應。所有RT-PCR反應成分均獲自Promega。
實施例10經T7 RNA聚合酶的RNA合成。
分別用經EcoRI切割的pSPT18-neo和pSPT19-neo DNA(BoehringerMannheim，Germany)在20μl反應體積中完成了由SP6和T7 RNA聚合酶催化的RNA合成。每一反應混合物含有0.5μg DNA模板，0.5mM各ATP、GTP、CTP、UTP，40mM Tris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM DTT。為進行標記合成，用50μCi[α32P]UTP(＞400Ci/mmol)替代了0.5mM UTP。將反應混合物暴露於微波照射20秒，之後加入2μl 0.25M EDTA(pH8.0)使反應終止。在TCA可沉澱計數中通過[α32P]UTP的摻入測定了RNA合成。發現由本發明方法合成的TCA可沉澱RNA比在37℃下45分鐘完成的常規方法多。通過甲醛-瓊脂糖凝膠測定了用冷NTPs合成的RNA的大小，發現它與用常規方法得到的相同。
工業實用性本發明提供了可用於經短暫不間斷微波照射快速有效製備由酶催化反應產生的產物的方法。本發明的方法適於生物技術，更特別是適於分子生物學、工業加工和汙水處理。本發明方法也適於相關領域中的自動化。本發明的基於微波的方法對於快速位點特異性DNA切割、寡核苷酸和DNA修飾、以及核酸體外合成特別有用。反應包括DNA的限制性內切核酸酶消化，核酸連接、去磷酸化、激活、及體外合成。
其中獲得的產物是分子生物學的關鍵，且為基因組作圖、DNA擴增、DNA測序、基因表達、目的產物純化、重組DNA技術中的基因操作等所需。本發明適於分子生物學中的自動化。
優點1.位點特異性切割、DNA和寡核苷酸的修飾、以及核酸合成中反應時間的大大減少是本發明的主要優點。對於限制性內切核酸酶消化、連接、去磷酸化、磷酸化(激活)、反轉錄、體外DNA合成和體外RNA合成，反應時間降至5-70秒。
2.分子生物學以及其它領域中使用的幾乎所有酶促反應可以通過本發明的方法在極短的時間內完成，這節省了寶貴的時間並因此使本方法經濟且全能化。
3.反應條件非常簡單，而且不需要任何貴重的設備。
4.本發明的方法可用於分子生物學自動化。
5.本發明的方法可用於涉及酶促反應的生物技術工業。
權利要求
1.一種利用了不間斷短暫微波照射的簡單、有效、且加速的體外酶催化核酸修飾和合成方法，所述方法包括步驟(a)在小微量離心管或小片石蠟膜上提供反應混合物，該反應混合物含有(i)選自限制性內切核酸酶、連接酶、磷酸酶、激酶、反轉錄酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶的酶(ii)選自DNA、RNA或寡核苷酸的生物分子，以用作所選擇酶的底物，(iii)適於特定酶的緩衝液以及(iv)其它成分，(b)將載有所述反應混合物的所述微量離心管或石蠟膜片置於微波爐內，(c)用600至900瓦特的輸出功率、2300至2500MHz的頻率的微波持續照射所述微量離心管或石蠟膜，(d)持續5至120秒，(e)加入乙二胺四乙酸(EDTA)和/或在75℃水浴中加熱3-15分鐘使反應終止，之後加入凝膠上樣染料，(f)用瓊脂糖凝膠電泳、放射自顯影、放射計數和常規方法中使用的其它技術分析反應產物。
2.如權利要求1中所要求的方法，其中核酸選自DNA、RNA和寡核苷酸。
3.如權利要求1中所要求的方法，其中其它成分選自MgCl2、MgSO4、NaCl、KCl、CH3COOK、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、亞精胺、BSA、triton x-100、核苷酸、模板DNA、模板RNA和寡核苷酸引物。
4.如權利要求1中所要求的方法，其中限制性內切核酸酶選自Hind III、BamHI、EcoRI、Hae III、Bgl II、Pst I、Bst E II和BstNI。
5.如權利要求1中所要求的方法，其中所用的連接酶是T4 DNA連接酶。
6.如權利要求1中所要求的方法，其中所用的激酶是T4多核苷酸激酶(TPNK)。
7.如權利要求1中所要求的方法，其中所用的磷酸酶是牛腸鹼性磷酸酶(CIP)。
8.如權利要求1中所要求的方法，其中聚合酶選自大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段、T7 RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。
9.如權利要求1中所要求的方法，其中所用的反轉錄酶是禽成髓細胞瘤病毒-反轉錄酶(AMV-RT)。
10.如權利要求1中所要求的方法，其中所用的DNA選自基因組DNA、λ噬菌體DNA、質粒DNA、杆狀病毒DNA、植物DNA和哺乳動物DNA。
11.如權利要求1中所要求的方法，其中使用了不只一種限制性內切核酸酶以用於核酸雙重消化。
12.如權利要求11中所要求的方法，其中為雙重消化所用的限制性內切核酸酶是EcoRI和Hind III。
13.如權利要求1中所要求的方法，其中微波照射可以在其中可以產生微波的任何裝置或腔室中完成。
14.如權利要求1中所要求的方法，其中所述方法可以通過專門設計的裝置被部分或完全自動化。
15.適於完成權利要求1的酶促反應的裝置，其中所述裝置含有(a)由磁電管、排氣扇、纖維光學溫度計、冷卻系統和旋轉反應平臺組成的反應腔，(b)基於微處理器的計算手段，以通過適宜硬體和軟體給出完成不同反應的預編程命令。
16.如權利要求15中要求的裝置，其中磁電管是微波來源，在約2450MHz的頻率、100瓦特至800瓦特的輸出功率下工作。
全文摘要
本發明涉及利用2300至2500MHz、600至900瓦特輸出功率的不間斷短暫微波照射5至120秒的、簡單、有效、且加速的酶催化體外核酸修飾及合成方法，以及進一步，利用所述方法的裝置。
文檔編號C12P19/00GK1650002SQ02829418
公開日2005年8月3日 申請日期2002年7月4日 優先權日2002年6月14日
發明者R·H·達斯, P·納哈爾 申請人:科學與工業研究會