用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物及其製法的製作方法

2023-04-28 10:25:21

專利名稱：用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物及其製法的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因生物醫藥，尤其是含有人溶菌酶藥物及其製法。
背景技術：
21世紀的今天，耐藥菌的發展令人觸目驚心。所謂耐藥菌就是細菌對藥物產生抗性，是細菌多次與藥物接觸後，對藥物的敏感性減小甚至消失，致使藥物對細菌的敏感性降低甚至無效。其中耐藥菌包括金黃色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌MRSE、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌屬、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、丙酸桿菌、不動桿菌、枸櫞酸桿菌、沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌等。主要是對下列藥品產生耐藥性克拉黴素、羅紅黴素、阿莫西林、萬古黴素、德可黴素、廣譜青黴素、甲氧西啉類、頭孢類、青黴素鈉、青黴素鉀、磺胺類。
具體的耐藥標準是(抑菌圈直徑mm)


從細菌的耐藥發展史可以看出，在某種新的抗生素出現以後，就有一批耐藥菌株出現。開發一種新的抗生素一般需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產生只要2年的時間，抗生素的研製速度遠遠趕不上耐藥菌的發展速度。目前急需開發一種針對不同耐藥菌株均有效的「超級抗生素」用於臨床治療。
重組人溶菌酶它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4-β-N-溶菌酶或者稱粘肽N-乙醯基胞壁醯水解酶。它能切斷細菌細胞壁的肽聚糖中N-乙醯葡萄糖胺和N-乙醯胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯結，破壞肽聚糖支架，細菌在內部滲透壓的作用下細胞脹裂開，引起細菌裂解。人和動物細胞無細胞壁結構亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細胞無毒性作用。重組人溶菌酶除可以直接裂解細菌外，還有抗病毒、抗腫瘤、抗炎和免疫調節作用。中國專利03110824.5國已記載基因重組人溶菌酶製藥對抗耐藥菌有明顯療效，對抗病毒有明顯療效。但其劑型一般為現有的普通劑型，對於用藥途徑和藥物的吸收可以進一步提高。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，劑型合理，使用方便快捷，釋藥速度快，作用迅速，療效顯著。
本發明為實現上述目的所採用的技術方案是用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，劑型為氣霧吸入劑。
所述藥物含有活性1500U～30000U/ml人溶菌酶。
所述人溶菌酶藥物為治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的肺炎或預防肺炎的藥物；為治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的氣管炎或預防氣管炎的藥物；為治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的咽喉炎或預防咽喉炎疾病的藥物；為治療由病毒(RNA、DNA病毒)或非典型肺炎(SAES)、細菌、耐藥菌引起的氣管炎、肺炎及肺膿腫的藥物。
所述人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(穀氨酸-丙氨酸)2或(穀氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
氣霧劑應在避菌環境下配置，各種用具、容器等須用適應的方法清潔、滅菌，在整個操作過程中應注意防止微生物的汙染。(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)製備工藝流程如下容器與閥門系統的處理和裝配→藥物的配製和分裝→填充拋射劑→質量檢查→成品(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)。
具體製法氣霧吸入劑療法的作用大致可以分為三種；其一，微小水滴為吸入氣流及氣道內膜上水蒸氣的充分來源，因而可使氣道充分溼化，從而維持氣道內粘液纖毛系統的正常清楚功能；其二，液滴在氣道內膜的沉積可以刺激咳嗽而促進氣道的淨化；期三，治療藥物以霧滴形式進入氣道則成為其直接而有效的投藥途徑。現代氣霧療法的目的，都不外乎希望從這些方面入手來收到淨化氣道的臨床治療效果。
重組人溶菌酶氣霧吸入劑劑型與其它途徑給藥具有更突出的特點。1、肺部具有較大的吸收表面積和較薄的吸收層。肺部的肺泡表面積之和約為100m2，而且肺泡上皮很薄，布滿毛細血管。這不僅可以使小分子氣體快速交換，而且可以吸收很多大分子藥物。2、肺部的代謝酶活性較低，沒有各種消化酶的存在和幹擾，使得多肽和蛋白質類藥物可以穩定存在，藥物吸收後不先經過肝臟，降低首過效應。3、肺部環境比較穩定，藥物停留時間較長，吸收很慢的藥物也可以有很好的生物利用度。4、肺部霧化吸入劑的使用不受環境影響，設備技術簡單，使用方便快捷。肺部給藥通常被認為具有釋藥速度快，作用迅速等特點。壓縮霧化吸入機的氣體霧化顆粒直徑在1～5微米是固定的，霧化顆粒直徑1～3微米之間的佔70％，所以，70％的藥物能夠達到下呼吸道和肺部病灶，能夠達到理想的臨床治療效果。本發明涉及一種重組人溶菌酶氣霧吸入劑的新用途，特別是涉及製藥領域中重組人溶菌酶氣霧吸入劑針對呼吸道由病毒、細菌和耐藥菌引起的疾病在製藥中的新用途。
為了更好地理解本發明的實質，下面將用重組人溶菌酶氣霧吸入劑的藥效試驗及結果來說明其在製藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶菌種發酵液以配製220毫升培養基為準，用磷酸8毫升、硫酸鎂4克，硫酸鉀5克，氫氧化鉀1.5克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌後接種甘油管種子，搖床轉數為每分鐘250轉，培養溫度為20-35℃，在恆溫床上培養30-45小時。進行種子罐培養，最後進行生產罐培養。將發酵表達完成的培養液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液，測蛋白純度、測活性保存。將純度95％以上的合格的基因重組人溶菌酶蛋白濃縮液製得氣霧吸入劑、1500U～30000U/ml備用。
一對小鼠的模型試驗A、耐藥肺炎球菌上呼吸道感染所致小鼠肺炎模型的製備選用健康昆明種小鼠10隻，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥肺炎球菌用滴鼻方式感染小鼠上呼吸道致小鼠肺炎10隻，感染後即用重組人溶菌酶氣霧吸入劑30000U/ml/20g鼠給藥，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶氣霧劑對耐藥肺炎球菌上呼吸道感染所致小鼠肺炎有明顯療效。結果如下表

B、耐藥金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠氣管炎、支氣管炎模型的製備選用健康昆明種小鼠20隻，雌雄各半，體重為18-22克，分兩組，每組10隻，選取一定量的耐藥金葡球菌用滴鼻方式感染小鼠上呼吸道致小鼠氣管炎10隻、支氣管炎10隻，感染後即用重組人溶菌酶氣霧吸入劑3000U/ml/20g鼠給藥，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶氣霧劑對耐藥金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠氣管炎、支氣管炎有明顯療效。結果如下表

C、耐藥化膿性鏈球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化膿性咽喉炎模型的製備
選用健康昆明種小鼠10隻，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥化膿性鏈球菌用滴鼻方式感染小鼠上呼吸道感染所致小鼠急慢性咽喉炎10隻，感染後即用重組人溶菌酶氣霧吸入劑30000U/ml/20g鼠給藥，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶氣霧吸入劑對耐藥化膿性鏈球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化膿性咽喉炎有明顯療效。結果如下表

D、耐藥化膿性鏈球菌上呼吸道感染所致小鼠扁條體炎模型的製備選用健康昆明種小鼠10隻，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的化膿性鏈球菌用滴鼻方式感染小鼠上呼吸道致扁條體炎小鼠10隻，感染後即用重組人溶菌酶氣霧吸入劑30000U/ml/20g鼠給藥，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶氣霧吸入劑對化膿性鏈球菌感染所致扁條體炎有明顯療效。結果如下表

E、厭氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎模型的製備選用健康昆明種小鼠10隻，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的厭氧性球菌用滴鼻方式感染小鼠上呼吸道致小鼠口腔炎10隻，感染後即用重組人溶菌酶氣霧吸入劑3000U/ml/20g鼠給藥，觀察一周，每日六次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶氣霧吸入劑對厭氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎有明顯療效。結果如下表

F、基因重組人溶菌酶氣霧吸入劑對金黃色葡萄球菌MRSA BAA-42肺部感染小鼠的治療作用藥物和對照藥受試藥基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme，HLZ)活性單位30000u/mg，由大連奇龍生物技術研究所提供，實驗前用PBS配成所需濃度。
對照藥克拉黴素效價948U/mg，中國藥品生物製品檢定所標準品。
實驗菌株2002年於臨床分離的耐藥金黃色葡萄球菌MRSA BAA-42，為四川大學華西醫學中心贈送。
儀器1治療用霧化器德國白瑞公司生產的壓縮噴霧器(PAR1.BOY)，該設備用於噴霧人溶菌酶治療用。
2BL 3100型，BS 200S-WE1型電子天平，北京賽多利斯天平公司生產。
小鼠細菌性肺炎治療實驗(1)菌液製備及模型建立挑取受試菌菌苔，用生理鹽水衝洗後，用麥氏比濁管校正菌液濃度為2#MCF，約2.7×1011CFU/ml的濁度，再分別用生理鹽水稀釋至10-1，10-2，10-3菌液濃度，分別給小鼠滴鼻感染(先將小鼠用戊巴比妥麻醉，30mg/kg，ip)，每隻小鼠0.05ml。觀察小鼠體症變化，並於感染後48h活殺部分小鼠，取全肺組織勻漿，用生理鹽水10倍稀釋，吸取0.1ml至盛有MH瓊脂平皿表面，35℃隔夜培養，革蘭氏染色，鏡檢，並做活菌計數。同時觀察記錄小鼠死亡個數，並抽取部分小鼠肺組織作病理組織觀察。
細菌培養陽性，肺中細菌數≥100CFU/ml，病理組織學觀察肺組織出現明顯充血，水腫，炎性細胞浸潤等病理組織學變化。同時小鼠死亡率在50％以上則表明模型成功。
取致小鼠出現肺部病理變化並50％致死的菌量做為最低致死菌量(LD50)用該菌量作為治療實驗感染菌量。
(2)感染小鼠及分組選取健康昆明種小鼠，體重17-20克，以戊巴比妥麻醉(30mg/kg，ip)，吸取相當於10倍LD50的菌液對小鼠進行滴鼻感染(0.05ml/只鼠)，具體方法同上，共感染300隻。取感染成功小鼠，按體重隨機分為10組，每組30隻。
(3)藥物治療劑量設計重組人溶菌酶臨床霧化治療時藥液的濃度為15000u/ml，初步擬定劑量為15000u/次，每日一次，即0.5mg/次/日。按體表面積推算至小鼠劑量為1.3×10-3mg/只(20g體重計)，由於人通氣量9000ml/分相當於小鼠通氣量24ml/分的375倍，人用單次劑量0.5mg/70kg相當於小鼠劑量1.3×10-3mg/20g的384倍，上二者較為接近。所以設定用臨床人用濃度0.5mg/ml對小鼠進行霧化治療，另考慮到臨床人用氣霧劑吸入溶菌酶氣體利用率較高，而小鼠在霧化缸內只能靠自身呼吸吸入含藥氣體，故只有延長吸入時間才能確保吸入藥量，設定為0.5小時。在0.5mg/ml濃度基礎上再配製0.25mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml共四個濃度劑量組作為治療時的藥液濃度。(見下表)重組人溶菌酶氣霧吸入劑實驗分組給藥劑量 每組組別(mg/ml)動物數(只)1.正常組等體積NS 302.感染對照組等體積NS 303.克拉黴素組10 304.克拉黴素組5 305.克拉黴素組2.5306.克拉黴素組1.25 307.人溶菌酶組2 308.人溶菌酶組1 309.人溶菌酶組0.53010.人溶菌酶組 0.25 30將同一組動物同時放入超聲霧化器內，用PAR1.BOY壓縮霧化吸入不同濃度的人溶菌酶液對小鼠進行霧化治療(見下圖)，每日兩次，連續5天。
(4)檢測方法各組以感染當日計算，連續觀察14天，逐日記錄動物發病情況和死亡數，並於感染後第14天，各組抽取2-3隻小鼠活殺，取全肺勻漿後做細菌學檢測，剩餘動物活殺後取全肺，稱重後固定於10％甲醛溶液中，送病理檢查。
細菌培養接種細菌後24h，每組取部分小鼠活殺，取出全肺稱重，加入2ml滅菌PBS液勻漿10倍稀釋，吸取0.1ml於空白MH瓊脂平板，35℃培養24h，取每個平板上菌落數在30～300CF的培養平板計數，若相鄰兩個級別濃度組織液接種平板的菌落數均為30～300 CFU，則取低濃度的菌落數計數(每份組織液同時做3個平板，計算其平均值)。於給藥後5，7，14天同法各組隨機抽取2隻小鼠做細菌培養。
病理檢測解剖小鼠後，先肉眼觀察肺與胸壁，隔胸膜的粘連情況，肺體積及肺病灶大小，肺表面充血，水腫，實變及不張情況。取出全肺組織用10％的甲醛溶液固定，取材。脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，在光鏡下觀察肺組織的病理變化。
死亡率及半數有效劑量ED50的計算 自感染日起，連續觀察記錄14天內死亡動物數及其存活率，平均存活天數，與感染對照組進行比較。按Bliss法，運用NDST軟體計算半數有效劑量ED50值及其95％可行限。
實驗結果細菌培養結果細菌檢測結果見表1。重組人溶菌酶氣霧吸入劑2，1，0.5mg/ml第1天，第3天和第5天小鼠全肺中細菌數明顯低於感染模型組，且具有顯著性差異(P＜0.05)，至第14天，人溶菌酶給藥組細菌基本轉陰，≤10CFU/ml。
病理檢測結果各組動物肺組織的病理檢測結果見表2。病理檢測結果表明霧化吸入基因重組人溶菌酶(HLZ)(2，1，0.5mg/ml)對小鼠肺組織病理變化程度均顯著較感染模型組輕，至給藥後第7、14天，治療組小鼠肺組織基本恢復正常。
存活率及ED50值重組人溶菌酶氣霧吸入劑(HLZ)2、1、0.5mg/ml對金葡菌MRSA BAA-42感染小鼠肺炎治療的存活率依次為76.7％、56.7％、46.7％和40％，平均存活天數分別為12.93±2.05天、11.23±3.36天、10.3±3.77天、9.30±4.08天，其存活率及存活天數均顯著高於感染對照組(較感染模型組提高30-60％，P＜0.05)。其半數有效劑量ED50為0.53mg/ml(0.20-0.90mg/ml)，見表3、表4。
結果表明重組人溶菌酶氣霧吸入劑對金葡菌MRSA BAA-42致小鼠肺部感染具有較好的治療作用，其半數有效劑量ED50為0.53mg/ml。霧化吸入2，1，0.5，0.25mg(ml次)-1，其小鼠14天存活率分別為76.7，56.7，46.7和40％。平均存活天數分別為12.93±2.05天、11.23±3.36天、10.3±3.77天、9.30±4.08天，與感染對照組比較有顯著性的差異(P＜0.05)。以上實驗結果表明，重組人溶菌酶氣霧吸入劑對小鼠細菌性感染肺炎有較好保護治療作用。
表1重組人溶菌酶氣霧吸入劑對小鼠肺部感染金葡菌MRSA BAA-42的細菌檢測結果霧化吸入 動物 給藥後活菌數(CFU/ml)(n＝3)感染細菌 藥物(mg/ml.次)只數第0天 第1天 第3天 第5天第14天金葡菌2(60000u/只)5350±21.5253.80±22.88 165.80±16.0△△76.70±11.60***△△2.50±1.46***MRSABAA-425.0×106人溶菌酶 1(30000u/只)5350±21.5254.20±25.42***172.70±17.62**△△78.30±17.86**△△3.5±0.20***0.5(15000u/只)5350±21.5350.60±21.5 241.90±16.62 134.60±13.58 57.60±15.37**6.0 5350±21.5241.9±16.62 134.60±13.58 57.60±15.37**10.0±8.00***克拉黴素 3.0 5350±21.5246.30±19.03 141.10±18.54 60.70±13.98 24.0±2.00***1.5 5350±21.5247.10±21.31 146.90±13.55 64.40±15.69 28.0±2.60***感染對照組-- 5350±21.5275.60±21.60 194.30±17.60 86.70±12.88 130.1±193.4與感染對照組比*P＜0.05，**p＜0.01與克拉黴素組(0.75mg/ml)相比△P＜0.05，△△P＜0.01
表2重組人溶菌酶氣霧吸入劑各給藥組小鼠肺組織病理檢測結果

表3重組人溶菌酶氣霧吸入劑對小鼠金葡菌MRSA BAA-42所致細菌性肺炎的小鼠死亡分布氣霧劑給藥後死亡數(只)累計組存活率平均存活期 較模型組存活吸入 存活別(％) (天，X±s)提高率(％)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14(mg/ml) 數(只)正常- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 030 100 - 83.3對照感染- 0 0 6 3 2 8 2 3 1 0 0 0 0 05 16.7 --模型0.75 0 0 4 4 3 4 4 2 3 1 0 0 0 05 16.7 7.67±4.01 0.001.5 0 0 4 4 3 4 0 2 0 1 0 0 0 012 40.0 8.70±4.65 23.3克拉黴素30 0 0 0 0 4 4 4 0 0 0 0 0 018 60.011.20±3.53***43.360 0 0 0 0 4 4 2 0 0 0 0 0 020 66.711.60±3.48***50.00.25 0 0 1 2 3 3 5 4 0 0 0 0 0 012 40.09.30±4.08*23.30.50 0 0 2 2 3 4 5 0 0 0 0 0 014 46.710.3±3.77***△ 30.0人溶菌酶11.23±3.36***△1 0 0 0 0 1 2 3 4 1 2 0 0 0 017 56.7 40.0△△12.93±2.05***△2 0 0 0 0 0 0 0 2 2 1 2 0 0 023 76.7 60.0△△注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***p＜0.001與克拉黴素組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001
G、重組人溶菌酶藥物體外預防、抑制冠狀病毒的試驗1、驗證藥物重組人溶菌酶蛋白含量4.3mg，30000U/mg，由大連奇龍生物技術研究所提供2、陽性對照藥物注射用更昔洛韋 批號020802 由湖北科益藥業股份有限公司提供。
3、細胞人宮頸癌傳代細胞(HELA)由本室提供。
4、病毒冠狀病毒04號分離株(SARS病人血清04號標本)由佑安醫院提供。
5、CO2培養箱NUAIR US AUTO FLOW提供6、(XSZ-D2)由重慶光學儀器廠生產7、其它試劑、器材等均由本室提供。
試驗方法1.重組人溶菌酶對HELA細胞的毒性測定HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃、5％CO2培養2小時，加入驗證藥物，重組人溶菌酶倍比稀釋為6000ug/ml～11.7ug/ml，陽性對照藥物更昔洛韋稀釋為6000ug/ml～11.7ug/ml，每濃度接種3孔，每孔100μl，同時設正常細胞對照，37℃ 5％CO2孵箱培養6天，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化(CPE)，以25％以下形態變化為「+」，26％～50％形態變化為「++」，51％～75％形態變化為「+++」，76％～100％形態變化為「++++」，用Reed-Muench法，計算藥物半數中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。
2.在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的毒力的測定冠狀病毒04號的分離(SARS病人血清分離)HELA細胞以每毫升40萬濃度接種試管，37℃ 5％CO2培養24小時，棄掉培養液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃轉鼓培養5小時後，加入維持液1ml，同時設正常細胞對照，33℃轉鼓培養5～7天。細胞出現CPE變化後，採用PCR的方法檢測冠狀病毒，04號標本PCR陽性，確定為冠狀病毒分離株。用終末稀釋法純化病毒2次，PCR檢測冠狀病毒仍為陽性，經免疫螢光測定雙份SARS病人血清，IgM陽性，IgG4倍升高，確定為冠狀病毒。採用病毒CPE法測定其效價。
病毒CPE法HELA細胞以每毫升40萬濃度接種96孔培養板，37℃5％CO2培養24小時，加入病毒液，病毒稀釋10-1～10-5，5個濃度，每濃度3孔，每孔100μl，設正常細胞對照，37℃5％CO2培養5～7天，每24小時在倒置顯微鏡下觀察記錄細胞形態變化(CPE)以25％以下變化為「+」，26％～50％變化為「++」，51％～75％為「+++」，76％～100％變化為「++++」，用Reed-Muench法，計算病毒半數感染濃度TCID50。3、重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的抑制作用HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃5％CO2孵箱培養24小時，細胞培養至單層，棄掉培養液，加入100 TCID50的冠狀病毒液，置37℃5％CO2吸附2小時後，棄掉病毒液，加入不同濃度的重組人溶菌酶藥液，藥物選用對細胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個濃度即750μg/ml～1.46μg/ml，陽性對照藥物更昔洛韋為2倍稀釋10個濃度即6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細胞孔內，每濃度3孔，同時設正常細胞對照和病毒對照，置37℃5％CO2培養箱培養5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對照出現+++—++++時結束試驗，用Reed-Muench法，計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(TI)判斷藥效，試驗重複三次。
4、重組人溶菌酶對冠狀病毒04號的預防作用HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃ 5％CO2孵箱培養24小時，細胞培養至單層，棄掉培養液，加入不同濃度的重組人溶菌酶藥液，藥物選用對細胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個濃度即750μg/ml～1.46μg/ml，陽性對照藥物更昔洛韋為2倍稀釋13個濃度即6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細胞孔內，每濃度3孔，置37℃ 5％CO2吸附2.5小時後，加入100 TCID50的冠狀病毒液，同時設正常細胞對照和病毒對照，置37℃ 5％CO2培養箱培養5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對照出現+++—++++時結束試驗，用Reed-Muench法計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(TI)判斷藥效，試驗重複三次。
試驗結果1.重組人溶菌酶對HELA細胞的毒性試驗結果重組人溶菌酶最大無毒濃度(TD0)為750±0μg/ml，半數中毒濃度(TD50)為1500±0μg/ml陽性對照藥物注射用更昔洛韋最大無毒濃度(TD0)為＞6000±0μg/ml，半數中毒濃度(TD50)為＞6000±0μg/ml。
2.在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號毒力測定結果(TCID50)冠狀病毒04號半數感染量(TCID50)為10-33、重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的抑制作用(以下試驗數據為三次試驗結果的均值)重組人溶菌酶CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為23.4±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為46.8±0μg/ml，治療指數(TI)為16。
陽性對照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為11.7μg/ml±0，最小有效濃度(MIC)為23.44μg/ml±0，治療指數(TI)為256。
4、重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的預防作用(以下試驗數據為三次試驗結果的均值)重組人溶菌酶CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為5.9±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為11.7±0μg/ml，治療指數(TI)為64。
陽性對照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為11.7μg/ml±0，最小有效濃度(MIC)為23.44μg/ml±0，治療指數(TI)為256。
以上試驗結果表明重組人溶菌酶藥物有預防和抑制冠狀病毒的作用，預防冠狀病毒的效果優於抑制試驗結果。
本發明對重組人溶菌酶氣霧吸入劑發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域，其安全無毒副作用，有很好的藥用前景；製備工藝簡單，使用更方便。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述實施例1基因重組人溶菌酶的製備1、搖瓶種子製備以配製200毫升培養基為基準，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸鎂)1-5克，K2SO4(硫酸鉀)2-6克，KOH(氫氧化鉀)1-3克，CaSO42H2O(硫酸鈣)1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌後接種甘油管種子，搖床轉數為每分鐘250轉，培養溫度為20-35℃，在恆溫床上培養36-48小時。
2、種子罐培養以種子罐最大體積1升為基準，配製培養基用H3PO4(磷酸)25-19毫升，MgSO4(硫酸鎂)13-17克，CaSO42H2O(硫酸鈣)0.4-0.8克，K2SO4(硫酸鉀)16-20克，KOH(氫氧化鉀)2.12-6.12克，加蒸餾水至500毫升，高壓滅菌後接種搖床種子；發酵反應器操作參數溫度為20-32℃，PH值為2.0-8.0；溶解氧濃度為10-60％，當培養液中的細胞密度提高至OD200左右，種子培養結束。
3、生產罐培養以10升為生產罐配製培養基，用H3PO4(磷酸)93-97毫升，MgSO4(硫酸鎂)51-55克，CaSO42H2O(硫酸鈣)19-23克，K2SO4(硫酸鉀)61-65克，KOH(氫氧化鉀)13-17克加蒸餾水至7升，高壓滅菌後接種種子罐種子，發酵反應器操作參數溫度控制在25-32℃，PH值為4.0-8.0，溶解氧濃度為10-60％；當培養液中細胞達到一定密度後，向培養液中流加甲醇誘導，此階段的持續時間50-60小時，然後放罐培養結束。
純化工藝將含有基因工程表達的人溶菌酶的畢赤酵母菌培養液用10-50萬截流分子量膜超濾，收集濾液；用3000-8000截流分子量超濾，收集濃液；濃液上羧甲基纖維素，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫液，過G-50柱除鹽，測定蛋白量、純度、和溶菌酶活性。(純度99.8％活性8萬單位/ml)。
氣霧吸入劑的製備氣霧劑應在避菌環境下配置，各種用具、容器等須用適應的方法清潔、滅菌，在整個操作過程中應注意防止微生物的汙染。(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)製備工藝流程如下容器與閥門系統的處理和裝配→藥物的配製和分裝→填充拋射劑→質量檢查→成品(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)1、容器的處理在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成洗淨、滅菌、烘乾氣霧劑罐備用。採用德國菲弗公司生產的氣霧劑泵，用三氯甲烷燻蒸滅菌備用。
2、藥物的配製和分裝取重組人溶菌酶純度95％以上、活性15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶溶液，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸鹽緩衝液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常溫下混合均質，(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)配製成100萬U/ml重組人溶菌酶氣霧吸入劑成品。按分散體系配置後，分別經過質量檢查，定量分裝在已準備好的容器內，安裝閥門，紮緊封帽。
3、拋射劑的填充拋射劑的充填方法分為壓罐法，將已分裝藥物的容器裝上閥門，紮緊封帽，先抽去容器內的空氣，以免影響容器內的壓力，然後通過壓力灌裝機將定量的拋射劑壓灌入內。進入成品檢定。
實施例2在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成洗淨、滅菌、烘乾氣霧劑罐備用。採用德國菲弗公司生產的氣霧劑泵，用三氯甲烷燻蒸滅菌備用。取重組人溶菌酶純度95％以上、活性15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶溶液，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸鹽緩衝液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常溫下混合均質，(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)配製成15000u U/ml重組人溶菌酶氣霧吸入劑成品。按分散體系配置後，分別經過質量檢查，定量分裝在已準備好的容器內，安裝閥門，紮緊封帽。先抽去容器內的空氣，以免影響容器內的壓力，然後通過壓力灌裝機將定量的拋射劑壓灌入內。進入成品檢定。
實施例3
取重組人溶菌酶純度95％以上、活性30000U/ml重組人溶菌酶溶液，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸鹽緩衝液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常溫下混合均質，(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)配製成30000U/ml重組人溶菌酶氣霧吸入劑成品。按分散體系配置後，分別經過質量檢查，定量分裝在已準備好的容器內，安裝閥門，紮緊封帽。
權利要求
1.用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是劑型為氣霧吸入劑。
2.根據權利要求1所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是人溶菌酶藥物為治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的肺炎或預防肺炎的藥物。
3.根據權利要求1所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是為治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的氣管炎或預防氣管炎的藥物。
4.根據權利要求1所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是為治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的咽喉炎或預防咽喉炎疾病的藥物。
5.根據權利要求1所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是為治療由病毒(RNA、DNA病毒)或非典型肺炎(SAES)、細菌、耐藥菌引起的氣管炎、肺炎及肺膿腫的藥物。
6.根據權利要求1、2、3、4或5所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是藥物含有活性1500U～30000U/ml人溶菌酶。
7.根據權利要求1、2、3、4或5所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是採用德國菲弗公司出品的每次100ul氣霧泵，每次750U～30000U。
8.根據權利要求1、2、3、4或5所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，其特徵是人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(穀氨酸-丙氨酸)2或(穀氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
9.根據權利要求1、2、3、4或5所述的用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物製法，其特徵是取重組人溶菌酶純度95％以上、活性15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶溶液，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸鹽緩衝液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常溫下混合均質，(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)配製成15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶氣霧吸入劑成品。按分散體系配置後，分別經過質量檢查，定量分裝在已準備好的容器內，安裝閥門，紮緊封帽，進入成品檢定。
全文摘要
本發明涉及基因生物醫藥，尤其是含有人溶菌酶藥物及其製法。用於抗病毒抗耐藥菌的人溶菌酶藥物，劑型為氣霧吸入劑。可作為製備治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的咽炎、氣管炎、肺炎等疾病的治療製藥中的應用。做成重組人溶菌酶氣霧吸入劑直接吸入氣管、肺部給藥治療，具有安全無毒副作用，製備工藝簡單，使用方便，有很好的藥用前景。
文檔編號A61P11/00GK1583170SQ200410020738
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月10日 優先權日2004年6月10日
發明者安米 申請人:安米