一種多肽固相合成法的製作方法

2023-04-28 16:42:21 1

專利名稱：：一種多肽固相合成法的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種多肽固相合成法，尤其涉及一種利用數位化模式確定工藝條件的固相合成多肽的方法。
背景技術：
：目前多肽的合成工藝主要有兩種，分別為液相合成法和固相合成法，多肽液相合成基於將單個N-a保護胺基酸反覆加到生長的氨基成份上。多肽固相合成一般以樹脂為起始原料，逐個連接胺基酸得到多肽粗品，為了防止副反應的發生，參加反應的胺基酸的側鏈都是被保護的。而反應物的羧基端是游離的，並且在反應之前必須活化。現階段本領域多採用固相合成法，其優點主要表現在最初的反應物和產物都是連接在固相載體上，因此可以在一個反應容器中進行所有的反應，便於自動化操作，加入過量的反應物可以獲得高產率的產物，同時產物很容易分離。在多肽固相合成中，胺基酸的極性以及空間位阻和縮合位置都會對多肽的合成難易程度造成影響。一般情況下，在縮合位置相同的條件下，胺基酸極性越大，縮合難度越小，空間位阻越大，縮合難度越大；胺基酸極性越小，縮合難度越大，空間位阻越小，縮合難度越小。同一個胺基酸縮合位置越靠後，縮合難度越大；縮合位置越靠前，縮合難度越小。因此在多肽合成過程中，要充分綜合考慮胺基酸的極性以及空間位阻和縮合位置。在縮合反應過程中，反應時間和反應溫度決定著最終產物的純度和收率。反應時間過長，胺基酸鏈會從固相樹脂中脫落，導致收率降低。反應時間過短，又不能達到反應終點，導致最終產物純度降低。反應溫度過低，也會造成反應到不了終點，反應溫度過高，很易發生消旋副反應。雖然目前多肽固相合成技術已採用全自動多肽合成儀來完成多肽固相合成反應程序，但如何根據不同反應物質所具有的不同極性參數、空間位阻和縮合位置來確定其合成反應過程中的反應時間和反應溫度現已成為多肽固相合成反應中的一個尚待解決的問題。
發明內容本發明的目的在於提供一種多肽固相合成法，其縮合反應時間和溫度可依據多肽固相合成反應中待反應的胺基酸的極性參數、空間位阻和縮合位置來確定。按照所得到的反應溫度及時間利用全自動多肽合成儀進行多肽的合成，可提升產物收率，並降低了副反應發生率。本發明提供的全自動多肽合成儀的縮合反應溫度和縮合反應時間是如下設定的首先，將由表一得到的待反應胺基酸的極性參數、空間位阻和縮合位置參數代入公式d=a+b+0.017n中求得d值，式中a為極性參數，b為空間位阻，0.017n為縮合位置參數，d為綜合縮合參數tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7脯氨酸的縮合時間為180-240分鐘，縮合溫度為30-35°C。本發明所提供的多肽固相合成法，採用了數位化模式，將反應物的極性以及空間位阻標示成參數，根據多次實驗總結的經驗公式c^a+b+0.017n，計算出反應物的綜合縮合參數d;再根據多次試驗經驗總結出的表二，得到反應所需的反應溫度和反應時間。按照所得到的反應溫度及時間利用全自動多肽合成儀進行多肽的合成，提升了產物收率，降低了副反應發生率。利用數位化模式進行固相合成得到的多肽，經過常規方法的分離、純化，收率與常規方法相比提升10%以上，產品起始純度提高5%。圖1示出本發明的多肽固相合成法所合成的生長抑素的HPLC數據；圖2示出常規多肽固相合成法所合成的生長抑素的HPLC數據。具體實施例方式下面將通過具體實施例對本發明進行詳細描述。應當理解，這裡描述的實施例只用於舉例說明，並不用於限制本發明。實施例l、生長抑素的固相合成法本發明所述的固相合成法實施例Al將樹脂裝入全自動多肽合成儀的肽反應瓶中，將第一個經過羧基活化的胺基酸溶液加入全自動多肽合成儀的肽反應瓶中，根據下述表一計算綜合縮合參數d，根據綜合縮合參數d對照下述表二在控制程序中輸入相應的反應溫度和反應時間，進行縮合。按以上方法依次進行後面胺基酸的縮合，直到最後一個第14位胺基酸的縮合結束，得到帶全保護基的樹脂，洗滌全側鏈保護的肽樹脂後取出，自然乾燥。加入切肽試劑進行切肽後進行減壓濃縮、洗滌，通入純氧，氧化後濃縮、過濾、純化。tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9具體操作為配料(1)稱取H-Cys(Trt)-2-C1-Trt-Resin樹脂20g裝於全自動固相合成儀(美國SCBio公司，型號CS936S)的反應瓶中，加入二甲基甲醯胺(DMF)適量，溶脹2小時。(2)胺基酸縮合液的配製稱取Fmoc-Ser(tBu)-OH11.50g，Fmoc-Thr(tBu)-OHU.93g，Fmoc陽Phe陽OH11.63g，Fmoc-Thr(tBu)-OH11.93g，Fmoc-Lys(Boc)-OH14.06g，Fmoc-Trp-OH12.80g，Fmoc匿Phe陽OH11.63g，Fmoc-Phe-OH11.63g，Fmoc-Asn(Trt)-OH17.90g，Fmoc-Lys(Boc)-OH14.06g，Fmoc—Cys(Trt)-OH17.58g，Fmoc—GIy-OH8.93g，Fmoc-Ala-OH9.34g並分別裝入於13個三角瓶中，再向每個三角瓶中分別加入二環己基碳二亞胺(DCC)和DMF溶解，濾去沉澱，將濾液加入全自動合成儀儲備瓶中，備用。(3)配製30%哌啶DMF溶液、DMF(分析純)、二氯甲烷(DCM)(分析純)，分別加入全自動合成儀原料儲備瓶中。2、縮合在上述表一中查到所述各種胺基酸的極性參數，空間位阻及縮合位置，計算出綜合縮合參數d，再根據d在上述表二中査出相應的反應溫度和時間。所述各種胺基酸(按順序)參數d及相應的反應溫度及時間詳見下表三表三各種胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表tableseeoriginaldocumentpage10將表三中計算好的數據輸入全自動化固相合成儀的控制系統的SOM(生長抑素)2號程序中，運行SOM2號程序脫除9-芴甲氧羰基(Fmoc-)，縮合完後用配製好的DMF和DCM洗滌6次，當縮合進行到距理論反應結束時間還差十分鐘時，用茚三酮乙醇溶液檢測是否達到反應終點。若反應達到終點時，用30%哌啶DMF溶液洗滌1次，再用DMF洗滌3次。重複以上縮合步驟進入下一個胺基酸的縮合程序。直到所述13個胺基酸均縮合完畢，關閉固相合成儀。3、切肽所述14個胺基酸反應縮合完畢後，80%的三氟乙酸(TFA)水溶液中加入5%苯酚配製為切肽試劑，按每10ml切肽試劑中加入精確稱量的lg全保護的生長抑素樹脂的比例加入切肽試劑和生長抑素樹脂，反應1小時。反應結束後將切肽後所得溶液裝入三角瓶，加入乙醚，收集沉澱，晾乾。4、檢測精確量取上述所得沉澱lg置於100ml容量瓶中，加入醋酸(分析純)定容到100ml，搖勻，用分析型高效液相色譜儀檢測，檢測結果如圖l所示。5、結果tableseeoriginaldocumentpage11由圖1可得使用本發明所述的固相合成法合成的生長抑素峰面積為236.375，歸一化法主峰面積百分比為76.70%(不含溶劑峰)。實施例A2在本實施例中，除縮合時間及縮合溫度外，其餘反應步驟及其反應條件均與實施例Al相同。本實施例縮合時間及溫度按表四確定表四各種胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12實施例A3在本實施例中，除縮合時間及縮合溫度外，其餘反應步驟及其反應條件均與實施例Al相同。本實施例縮合時間及溫度按表五確定表五各種胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表tableseeoriginaldocumentpage12實施例A4在本實施例中，除縮合時間及縮合溫度外，其餘反應步驟及其反應條件均與實施例Al相同。本實施例縮合時間及溫度按表六確定表六各種胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14精確量取上述所得沉澱lg置於100ml容量瓶中，加入20%醋酸溶液(w/w)定容到100ml，搖勻，用分析型高效液相色譜儀檢測，檢測結果如圖2所示。5、結果:縮合前樹脂重縮合後樹脂增重20.0g43.03g由圖2可得使用常規縮合法合成生長抑素峰面積為197.935，歸一化法主峰面積百分比為69.53%(不含溶劑峰)。實施例Al-A5實驗所得的合成生長抑素峰面積和歸一化法主峰面積百分比均大於B法所得數據，由此得出Al-A5方法得到的生長抑素的收率和純度均超過常規技術所得。以下以實施例A1的數值與B法做比較來驗證該結論比較A1、B兩種方法得到的生長抑素的收率和純度在兩種方法下運用的樹脂量和各胺基酸的量均相同的條件下，由圖1和圖2給出的數據可看出，A法合成生長抑素峰面積為236.375，歸一化法主峰面積百分比為76.70%(不含溶劑峰)；B法合成生長抑素峰面積為197.935，歸一化法主峰面積百分比為69.53%(不含溶劑峰)。因此，A法比B法在合成生長抑素上純度提高76.70%-69.53%=7.17%。合成工序純度的提高將有利於後續的分離工序，並直接影響到最終成品的質量並最終有利於成品質量。A法比B法在合成生長抑素上收率提高(236.375*40.01-197.935*43.03)/(197.935*43.03)=11.04%。本發明所述的多肽固相合成法合成而得的生長抑素無論在產品收率還是在純度上，都明顯的優於常規合成法合成而得的生長抑素。另外，從縮合時間上來看，用常規合成法合成生長抑素共需26小時，而使用本發明所述的多肽固相合成法合成生長抑素只需22小時35分鐘。因此，本發明所述的多肽固相合成法在生長抑素合成方面的運用可大大提高合成效率、產品純度及收率，是一種具有很高優越性的新型多肽固相合成方法。實施例2、降鈣素的固相合成法實施例C1將樹脂裝入全自動多肽合成儀的反應瓶中，將一胺基酸溶液加入全自動多肽合成儀的反應瓶中，根據前述表一計算綜合縮合參數d，根據綜合縮合參數d對照前述表二在控制程序中輸入相應的反應溫度和反應時間，進行縮合。按以上方法將其餘胺基酸逐個進行縮合，直到最後一個胺基酸的縮合結束，得到帶全保護基的樹脂，將全側鏈保護的肽樹脂洗滌後取出，紅外燈下乾燥。加入切肽試劑進行切肽後再進行減壓濃縮、洗滌，加入濃氨水調至弱鹼性後室溫下攪拌，調至酸性後濃縮、過濾、純化。具體操作如下配料(1)稱取4-甲苯氫胺樹脂(MBHAResinx型樹脂)10g裝於全自動固相合成儀(美國SCBio公司，型號CS936S)反應瓶中，加入DMF適量，溶脹2小時。(2)胺基酸縮合液的配製稱取Fmoc-L-Pro9.177g，Fmoc-Thr(tBu)-OH10.812g,Fmoc-Gly-OH10.108g，Fmoc-Ser(tBu)-OH10.428g，Fmoc-Gly-OH8.087g，Fmoc-Thr&Bu)-OH10.812g,Fmoc-Asn(Trt)-OH16.230g,Fmoc-Thr(tBu)-OH10.812g，Fmoc-Arg(pbf)-OH17.646g,Fmoc-L-Pro9.177g，Fmoc-Tyr(tBu;-OH12.498g,Fmoc-Thr(tBu)-OH10.812g,Fmoc-Gln(Trt)-OH16.61lg,Fmoc-Leu9.612g，Fmoc-Lys(Boc;OH12.744g，Fmoc-His(Trt)-OH16.856g,Fmoc-Leu9.612g,Fmoc陽Glu(OtBu)-OH11.573g,Fmoc—Gln(Trt)陽OH16.61lg，Fmoc—Ser(tBu)陽OH10.428g，Fmoc—Leu9.612g，Fmoc-Lys(Boc)陽OH12.744g，Fmoc-Gly陽OH8.087g，Fmoc-Leu9.612g，Fmoc-Val-OH9.232g，Fmoc-Cys(Trt)隱OH15.93lg，Fmoc-Thr(tBu)-OH10.812g，Fmoc-Ser(tBu)-OH10.428g，Fmoc-Leu9.612g，Fmoc漏Asn(Trt)-OH16.230g，Fmoc-Ser(tBu)-OH10.428g，Fmoc-Cys(Trt)-OH15.931g，分別裝入三角瓶中，再向所述各個三角瓶中分別加入DCC和DMF溶解，濾去沉澱，將濾液加入全自動合成儀儲備瓶中，備用。(3)配製30%哌啶DMF溶液、DMF溶液(請給出濃度)、DCM溶液(請給出濃度)分別加入全自動合成儀的原料儲備瓶中。2、縮合在前述表一中查到各胺基酸的極性參數，空間位阻及縮合位置，計算出綜合縮合參數d，再根據綜合縮合參數d在前述表二中查出相應的反應溫度和時間。各胺基酸(按順序)參數d及相應的反應溫度及時間詳見下表表八各胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表胺基酸名稱綜合縮合參數d縮合時間(分鐘)縮合溫度(°C)FmoC"L-Pro不符合本公式24034Fmoc-Thr(tBu)-OH0.5347531Fmoc-Gly-OH0.4515527Fmoc-Ser(tBu)-OH0.5687529Fmoc-Gly-OH0.4855529Fmoc-Thr(tBu)-OH0.6029033Fmoc-Asn(Trt)-OH0.71912033tableseeoriginaldocumentpage17將表五中計算好的數據輸入全自動化固相合成儀的控制系統的c(ffi素)l號程序中，運行C1號程序，固相合成儀按照程序開始進入第一個胺基酸的縮合。脫除9-芴甲氧羰基(Fmoc-)縮合完後用配製好的DMF和DCM洗滌6次，當縮合進行到距理論反應結束時間還有十分鐘時，用茚三酮乙醇溶液檢測是否達到反應終點。若經檢測反應已達到終點，用307。哌啶DMF溶液洗滌1次，再用DMF洗滌3次。重複以上縮合步驟進入下一個胺基酸的縮合程序。直到所述32個胺基酸均縮合完畢，關閉固相合成儀。3、切肽所述32個胺基酸反應縮合完畢後，將鮭魚降鈣素樹脂取出洗滌後，紅外燈下晾乾。用80%的TFA水溶液中加入5%苯酚配製為切肽試劑，按每10ml切肽試劑中加入精確稱量的lg全保護的鮭魚降鈣素樹脂的比例加入切肽試劑和鮭魚降鈣素樹脂，反應1小時。反應結束後將切肽後所得溶液裝入三角瓶，加入乙醚，收集沉澱。4、檢測精確稱量上述所得沉澱lg置於100ml容量瓶中，加入醋酸(分析純)定容到100ml，搖勻，用分析型高效液相色譜儀檢測。5、結果本發明所述的多肽固相合成法合成的鮭魚降鈣素的產品收率和純度如下表所示:tableseeoriginaldocumentpage18實施例C2在本實施例中，除縮合時間及縮合溫度外，其餘反應步驟及其反應條件均與實施例Cl相同。本實施例縮合時間及溫度按表九確定表九各種胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表tableseeoriginaldocumentpage18tableseeoriginaldocumentpage19實施例C3在本實施例中，除縮合時間及縮合溫度外，其餘反應步驟及其反應條件均與實施例C1相同。本實施例縮合時間及溫度按表十確定表十各種胺基酸參數d及相應的反應溫度及時間表tableseeoriginaldocumentpage20tableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23權利要求1.一種多肽固相合成方法，其特徵在於，利用多肽合成儀進行多肽合成時，其縮合反應溫度和縮合反應時間是如下設定的首先，將由表一得到的待反應胺基酸的極性參數、空間位阻和縮合位置參數代入公式d＝a+b+0.017n中求得d值，式中a為極性參數，b為空間位阻，0.017n為縮合位置參數，d為綜合縮合參數表一胺基酸名稱極性參數空間位阻縮合位置參數甘氨酸GlyG0.350.05實際縮合過程絲氨酸SerS0.200.30實際縮合過程丙氨酸AlaA0.350.10實際縮合過程蘇氨酸ThrT0.200.30實際縮合過程纈氨酸ValV0.300.40實際縮合過程異亮氨酸IleI0.250.35實際縮合過程亮氨酸LeuL0.240.35實際縮合過程酪氨酸TyrY0.150.40實際縮合過程苯丙氨酸PheF0.220.40實際縮合過程組氨酸HisH0.150.35實際縮合過程脯氨酸ProP不符合本公式不符合本公式不符合本公式天冬氨酸AspD0.150.40實際縮合過程甲硫氨酸MetM0.20.40實際縮合過程穀氨酸GluE0.10.35實際縮合過程色氨酸TrpW0.250.45實際縮合過程賴氨酸LysK0.100.40實際縮合過程半胱氨酸CysC0.150.40實際縮合過程精氨酸ArgR0.10.40實際縮合過程天冬醯胺AsnN0.20.40實際縮合過程穀氨醯胺GlnQ0.180.45實際縮合過程然後，根據所得的綜合縮合參數d，由表二得到相應縮合反應的縮合反應時間及縮合反應溫度表二綜合縮合參數縮合時間(分鐘)縮合溫度(℃)0.0-0.120-2520-240.1-0.220-2521-250.2-0.330-3521-250.3-0.435-4025-290.4-0.555-6025-290.5-0.675-8029-330.6-0.790-9530-340.7-0.8120-12533-370.8-0.9200-20535-390.9-1.0200-20540-442.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，根據所得的綜合縮合參數d，由表十三得到相應縮合反應的縮合反應時間及縮合反應溫度tableseeoriginaldocumentpage33.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述待反應胺基酸為脯氨酸時，其縮合時間為180-600分鐘，縮合溫度為30-35°C。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述合成的多肽為2-50個胺基酸組成的多肽。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述合成的多肽為14肽或32肽。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述合成的14肽為生i《卬素。7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述合成的32肽為P^丐素。全文摘要本發明涉及一種多肽固相合成法，尤其涉及一種利用數位化模式確定工藝條件的固相合成多肽的方法。本發明的多肽固相合成法可提升產物收率，並降低了副反應發生率。文檔編號C07K1/04GK101531699SQ20091013613公開日2009年9月16日申請日期2009年4月30日優先權日2009年4月30日發明者馮樸純,濤賴申請人:昆明積大製藥有限公司