一種褐飛蝨基因Nl19243及其編碼產物與應用的製作方法
2023-04-28 09:02:56 1
一種褐飛蝨基因Nl19243及其編碼產物與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一個褐飛蝨基因Nl19243及其編碼產物與應用，該基因Nl19243具有SEQ?ID?No.1的DNA序列。該序列由787個核苷酸鹼基組成，包含一個由654個核苷酸構成的完整的編碼框，編碼含有217個胺基酸殘基的小分子量蛋白。研究發現該基因與褐飛蝨的存活有關。構建Nl19243的RNAi載體，轉入水稻中，在轉基因水稻體內表達Nl19243基因的dsRNA，可以達到提高水稻對褐飛蝨抗性的目的。本發明將在作物育種，特別是在水稻抗蟲育種中得到廣泛應用。
【專利說明】—種褐飛蝨基因N"9243及其編碼產物與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別地，涉及一種褐飛蝨基因#77似幻及其編碼產物與應用。
【背景技術】
[0002]水稻(Oirza sativa L.)是中國乃至全球最重要的糧食作物之一。在中國，水稻的年種植面積約為3000萬hm2，佔糧食作物種植面積近1/2，稻穀產量佔糧食總產量的45%。近年來，中國水稻種植面積有所下降，但稻穀產量仍然維持在糧食總產量的40%左右，水稻的產量直接關係到中國的糧食安全。但全國每年由於水稻病蟲害造成的水稻產量損失巨大，雖經防治仍然造成經濟損失400萬-500萬噸，重災年份甚至顆粒無收。因此如何通過減少蟲害來增加糧食產量，是當今人類必需要面對的迫切問題。
[0003]稻飛風屬於半翅目Hemiptera,飛風科Delphacidae,主要包括褐飛風Nilaparvata lugens (Stal)、白背飛風 Soga tel la furcifera (Horvath)、灰飛風Laodelphax s tri a tel Ius Fall6n等,是我國水稻作物上的重要害蟲。近些年來,稻飛風主要種類之一的褐飛蝨，更是接連大暴發，對我國的水稻糧食產量造成了嚴重損失。20世紀80年代以來，褐飛蝨在我國的年發生面積為1330-2000萬hm2，約佔水稻種植面積的50%，年損失稻穀達10-15億Kg。2005年，褐飛蝨再次在我國南方稻區爆發，引起水稻大面積乾枯倒伏，造成嚴重損失。據浙江省農業廳調查統計，2005年浙江省第5代褐飛蝨發生量每667m2達30萬頭以上的有66.7萬hm2，佔水稻總種植面積的86% ;每667m2在100萬頭以上的有33.3萬hm2,佔42 % ;最聞田塊的發生量達到每667m2 1000萬頭以上；絕收的面積達5333hm2，造成直接水稻產量損失120萬噸。在針對褐飛蝨的綜合防治體系中，種植抗蟲水稻品種是控制蟲害最經濟有效的方法之一。但褐飛蝨致害性因為具有可變性，往往造成抗蟲水稻品種使用年限的極大縮短，因此亟需通過褐飛蝨致害性變異規律和形成原因的研究，培育出抗褐飛蝨不同致害性的水稻新品種，從而最終實現褐飛蝨的可持續控制。
[0004]RNA幹擾(RNA interf`erence, RNAi)是指外源或內源的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)特異性地引起基因表達沉默的現象，目前利用RNAi技術對昆蟲基因進行功能研究已有較多的報導，但對於利用RNAi防治害蟲還沒有好的研究實例。至今，國內外已嘗試利用水稻表達相關基因dsRNA的方法來沉默稻飛蝨的相應基因，從而達到控制稻飛蝨的目的。這些基因，主要有蛻皮激素受體基因(ecdysteroidreceptor,及?./?)、乙酸膽喊酯酶基因(Acetylcholinesterase,、幾丁質合成酶基因(chitin synthetase, CS)、魚尼丁受體基因(ryanodine receptor,辦允)、己糖轉運蛋白基因(hexose transporter gene, ΛΜΤ7 )、羧妝酶基因(carboxypeptidase gene, A7car)和類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶(rypsin -like serine protease, NI try)等。儘管利用這些轉基因水稻品系，可以在一定程度上降低相關基因的轉錄水平，但對褐飛蝨的致死效果並不明顯。因此，至今為止，國內外尚沒有克隆到褐飛蝨的相關靶標基因，可以通過轉基因水稻沉默該基因而達到控制褐飛蝨的目的。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種褐飛蝨基因N119243及其編碼產物與應用。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
一種褐飛蝨基因N119243,它具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
[0007]一種權利要求1所述基因#77似幻的編碼蛋白，它包含SEQ ID N0.2的胺基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID N0.2的胺基酸殘基序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID N0.2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質。
[0008]一種權利要求1所述基因N119243在轉基因植物中的應用。
[0009]一種權利要求1所述基因N119243在作物育種中的應用。
[0010]一種權利要求1所述基因N119243在轉基因動物中的應用。
[0011]本發明的有益效果是，通過對褐飛蝨唾液腺轉錄組分析獲得了 #77似幻基因全長；然後以N119243基因片段為模板合成相應dsRNA，並利用注射目的片段dsRNA的方法分^Nl19243基因在RNAi沉默後，褐飛蝨中N119243 mRNA的表達水平及相應存活率；利用轉基因技術將褐飛蝨基因N119243轉化入水稻體內，使該轉基因水稻表達基因的dsRNA片段。利用該轉基因技術證實轉入犯7化?幻基因的轉基因水稻對褐飛蝨均具有極好的抗蟲效果。該基因的分離克隆，對於作物的抗蟲育種，尤其對水稻的抗稻飛蝨育種將起到重要的促進作用。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是褐飛蝨#77似幻基因⑶S全長電泳圖，圖中，I泳道為褐飛蝨PCR電泳結果；M 為 DL2000 Marker ；
圖2是褐飛蝨注射dsRNA後對其mRNA表達水平的抑制作用柱狀圖，圖中，dsNl19243指注射 20nI Ν119243 dsRNA (10 μ g/ μ I)的褐飛蝨 'dsGFP 指注射 20nI GFP dsRNA(10 μ g/μ I)的褐飛蝨；星號表示組與組之間存在顯著差異(*，P〈 0.05，Student』 s 1-tests),柱形圖為平均數±標準誤(n=3)；
圖3是褐飛蝨注射dsRNA後對其存活率的影響圖，圖中，dsNl19243指注射20nlN119243 dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飛蝨；指注射 20nl GFP dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飛蝨；Ck指未注射dsRNA的褐飛蝨。星號表示dsNl19243組與dsGFP組之間存在顯著差異(**，P〈 0.01.Student’s ?-tests ),線形圖為平均數土標準誤(n=4);
圖4是含基因的水稻遺傳轉化載體質粒結構示意圖；
圖5是褐飛蝨取食轉基因水稻對其mRNA水平抑制作用的柱狀圖，圖中，ASl:取食轉基因NI19243 dsRNA水稻品系AS I的褐飛蝨NI19243 mRNA量；AS2:取食轉基因NI19243 dsRNA水稻品系AS2的褐飛蝨Λ77似幻mRNA量；WT:取食非轉基因水稻的褐飛蝨N119243 mRNA量；圖中星號表示取食轉基因品系(ASl或AS2)與WT之間存在極顯著差異(**，P〈 0.01.Student’s 1-tests),柱形圖為平均數土標準誤(n=5);
圖6是褐飛蝨取食轉基因水稻對其存活率的影響圖，圖中，ASl:取食轉基因dsRNA水稻品系ASl的褐飛蝨；AS2:取食轉基因N119243 dsRNA水稻品系AS2的褐飛蝨；WT:取食非轉基因水稻的褐飛蝨；圖中星號表示取食轉基因品系(ASl或AS2)與WT之間存在顯著差異(**，P〈 0.01.Student’s ?-tests ),線形圖為平均數土標準誤(n=5);
圖7是轉基因dsRNA水稻品系對褐飛蝨的耐害性實驗圖，圖中，AS1，AS2:轉基因#77似幻dsRNA水稻品系；WT:非轉基因水稻。
【具體實施方式】
[0013]本發明通過構建褐飛蝨唾液腺轉錄組文庫進行高通量測序的方法獲得轉錄組數據，初步得到CDS全長序列。首先在CDS序列的5』端和3』端非編碼區設計一對引物AW^OCDS-Fl和AW^mj-CDS-RI。再提取褐飛蝨mRNA並反轉錄成cDNA，以此cDNA為模板，以Λ77似OCDS-FI和Λ77似OCDS-Rl為引物進行常規PCR反應，獲得Λ77似幻CDS全長序列並連接到PMD19-T克隆載體，轉化入大腸桿菌感受態細胞(TGl)，搖菌，送菌液測序(南京金斯瑞公司)。測序結果與轉錄組獲得的犯7化?幻CDS全長序列進行比對驗證。隨後在CDS序列中選取425bp長度的片段設計合成dsRNA，並用注射法對目的基因進行RNAi，檢測其對目的基因mRNA表達水平抑制效果及對褐飛蝨存活率的影響。並通過轉基因技術獲得含基因dsRNA的水稻轉基因突變體。通過生物測定，證明Λ77化?幻基因dsRNA在水稻中具有很好的抗蟲效果。對該基因的分離和克隆以及生物學功能的分析，對於作物的抗蟲育種，尤其對水稻抗褐飛蝨育種將起到重要的促進作用。
[0014]實現本發明的具體技術步驟如下:
!,NI19243基因的分離和序列分析
利用對褐飛蝨唾液腺轉錄組測序的方法，獲得表達基因資料庫，並篩選到犯2化?幻基因，初步得到N119243 CDS全長序列。提取褐飛蝨唾液腺mRNA並反轉錄成cDNA，以該cDNA為模板，以Λ77似幻基因5』端和3』端非編碼區設計Λ77似幻-CDS-Fl和AW^OCDS-Rl為引物，PCR擴增⑶S (圖1)全長序列後連接入PMD19-T克隆載體，轉化入大腸桿菌感受態細胞(TGl)，挑取6個克隆送南京金斯`瑞公司測序，每個分別測通2次。測序結果，用NCBIBlast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列比對分析。獲得基因DNA序列，見序列表SEQ ID N0.1表示的序列。根據該序列的開放閱讀框(ORF)，推算出該基因編碼蛋白的胺基酸序列，如SEQ ID N0.2所示。
[0015]2、褐飛蝨Λ77似幻dsRNA合成及其RNAi效果
以I中構建的載體為模板，設計帶T7啟動子的引物AsNl19243----Υ, AsNl19243----義和 ds6F/M7-F、dsft^-TT-R, PCR 擴增 N119243 基因 425bp 片段和 GFP 基因 860bp 片段，以這兩片段為模板合成與純化dsRNA和dsRNA。分別對褐飛蝨注射dsRNA和GFP dsRNA進行RNAi。首先檢測褐飛蝨注射dsRNA後，對其體內N119243 mRNA表達水平的影響。結果發現:對褐飛蝨利用注射dsRNA的方法的確可以誘導靶基因RNAi，使靶基因表達持續被抑制(圖2)。我們還測定了注射dsRNA的褐飛蝨在水稻上的存活率，結果表明，與注射dsRNA相比，基因沉默後存活率顯著降低(圖3)。
[0016]3.轉dsRNA水稻品系的獲得及其對褐飛蝨抗性的檢測
構建含基因N119243 dsRNA水稻遺傳轉化載體(圖4)，構建的表達載體以電擊法轉化農桿菌，獲得含有表達載體的工程農桿菌，以本實驗成熟的農桿菌轉基因方法侵染水稻愈傷，愈傷經抗性篩選後獲得整合了目的基因的愈傷組織，再經分化培養基和生根培養基中培養，獲得含基因dsRNA的轉基因水稻。對水稻植株進行觀察未發現植株生理缺陷，能獲得正常世代。生物測定試驗表明，與對照的非轉基因水稻相比，褐飛蝨成蟲在含Λ77似幻基因dsRNA的水稻上取食，Λ77似幻mRNA水平顯著降低(圖5)，褐飛蝨存活率明顯降低(圖6)。耐蟲性實驗表明，接褐飛蝨為害16天後，作為對照的非轉基因水稻基本枯死，而含#77似幻基因dsRNA的AS1、AS2轉基因水稻品系僅外面的葉片枯黃(圖7)。
[0017]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明範圍。
[0018]實施例UN119243基因的獲得和序列分析
1)褐飛蝨唾液腺RNA的提取、質量檢測及總cDNA第一鏈合成；
2)從總cDNA第一鏈中以聚合酶鏈式反應(PCR)令恢N119243⑶S片段 上遊引物(SEQ ID N0.3): 5』- GTCCCGTTCACGACACTA -3』
下遊引物(SEQ ID N0.4): 5』- TCTGATATTTCAACTGCCTC -3』
PCR 擴增條件:98°C X3min—(98°C X30sec ^ 55 °C X30sec ^ 72 °C X50sec) X30循環一72°C X lOmin，得到特異PCR擴增產物見附圖1。
[0019]3) pMD19- NI19243克隆載體構建及基因鹼基解析
PCR產物通過克隆入Takara公司pMD19_T載體獲得pMD19tV/7^￥J載體，並通過熱擊法轉入TGl大腸桿菌，將含pMD19- NI19243載體的TGl菌液送南京金斯瑞公司測序。用NCBI Blast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列比對分析，獲得序列表中的序列SEQ ID N0.1。將此cDNA的基因命名為Λ77似幻。
[0020]實施例2、褐飛蝨犯7似幻ds`RNA合成及注射法RNAi效果
I)從上述PMD19- Λ77似幻克隆載體中以聚合酶鏈式反應(PCR)敬％ NI19243中間425bp片段，並繼續合成N119243 dsRNA片段。同時以質粒為模板，PCR獲得GFP中間860bp片段，並繼續合成GFP dsRNA片段dsN119243-Tl-￥ (SEQ ID N0.5):
5』 - GGATCCTAATACGACTCACTATAGG TGGCTCACTCGTACTTCTT -3』
dsN119243-Tl~R (SEQ ID N0.6):
5』 - GGATCCTAATACGACTCACTATAGG CCACTTCACTCCGTCCTG -3』
dsGFP-Tl-V (SEQ ID N0.7):
5』 -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG _3』
dsft^-TT-R (SEQ ID N0.8):
5』 -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCAGCAGGACCATGTGATCGCGC _3』
PCR擴增條件:
NI19243..98°C X3min —(98°C X30sec —62°C X30sec —72°C X30sec)X30 循環—72°C XlOmin
GFP: 98 °C X3min —(98 °C X30sec — 62 V X30sec — 72 V X50sec) X 30 循環—72°C X IOmin。
[0021]2)對上述PCR產物進行割膠回收，並以回收產物為模板，用MEGA Script kit(Ambion, Austin, TX, USA)試劑盒合成目的基因 N119243 和 GFP 的 dsRNA。[0022]3)利用TransferMan NK2型顯微注射儀(eppendorf,Germany)對褐飛風進行目的基因dsRNA的顯微注射操作。注射部位一般選在褐飛蝨腹面前胸和中胸節間膜，每頭飛蝨注射20nl dsRNA (10ug/ul)，注射後先移入人工氣候箱內新鮮水稻苗上恢復24h，隨後接到處於分櫱期寄主水稻上生測。
[0023]4)吸取褐飛蝨3齡若蟲進行犯7化?幻基因dsRNA注射，並轉接到水稻上取食，每兩天每處理隨機取I頭褐飛蝨樣品直到第8天，抽取總RNA，然後反轉錄成cDNA第一鏈。結合下面定量引物，用Taqman法檢測注射dsRNA對褐飛蝨mRNA表達水平的影響。
[0024]N119243 定量引物
N119243 -FP (SEQ ID N0.9):5』 - ATCCAGGCATCAGGCTCTAAA -3』
N119243 -RP (SEQ ID N0.10):5』 - TGGAGTTTGAGCCAATGAGTG -3』
Λ77似幻探針(SEQ ID N0.11):5』 - ACCCTTTCACAGTCGGGCACCAG - 3』
內參actin定量引物
actin -FP (SEQ ID N0.12):5，- ATGAAACCGTCTACAACTCG -3，
actin -RP (SEQ ID N0.13):5』 - GGAAACCTTGTTACGACTT -3，
actin 探針(SEQ ID N0.14):5』 - CGTCGACATCCGTAAGGACCT - 3，
5)按照上述注射方法給同一批次發育一致的褐飛蝨3齡若蟲進行dsRNA注射。同一組實驗分別設3種處理:注射20nl N119243 dsRNA (5 μ g/μ I)的似幻、注射20nl GFPdsRNA (10 μ g/ μ I)的d`sGFP以及未注射dsRNA的CK。褐飛蝨注射後先恢復24h，再接到處於分櫱期的水稻上生測。連續生測6天，每24h觀察一次，及時將死亡個體移出，計算存活率。每處理設4次重複，每重複注射15頭若蟲。
[0025]實施例3、轉基因#77似幻dsRNA水稻抗蟲功能研究
1、設計正向和反向引物，PCR擴增出第155到第579的長425bp的#77似幻基因DNA片段。
[0026]2、以DNA亞克隆方法將#77似幻基因片段正向和反向同時插入到pMECE載體中，獲得含正反向連入#77似幻基因片段的RNAi表達載體PMECEtV77^M?(圖4)。
[0027]3、將PMECEtV77^￥J，以電擊法轉入農桿菌EHA105，獲得農桿菌工程細胞系。以農桿菌轉染法侵染水稻愈傷組織，共侵染水稻愈傷在含有潮黴素的NBDS培養基上培養，第I次篩選20天。當新的抗性愈傷長出後，將抗性愈傷從母體上剝離，轉入新的篩選培養基NBDS2，一個抗性愈傷即為一個株系。抗性愈傷經繼代擴繁後，在預分化培養基MS-PG上，26-28°C、避光，培養7-10天；然後，轉入分化培養基MS-RG，16h光照、26_28°C培養2_3周，愈傷先轉綠後分化出Ttl代植株。
[0028]4、Ttl代轉基因植株獲得的T1代種子，經含潮黴素的培養基篩選，去除未含有N119243的植株，並單株種植。收穫T2代種子，對每個單株的種子進行鑑定。獲得轉#77似幻基因的純合品系，用於後面的生物學功能分析。
[0029]5、轉基因品系和非轉基因水稻都進行褐飛蝨為害試驗，比較褐飛蝨取食轉基因水稻後，其體內mRNA表達水平、存活率等指標，並比較轉基因品系和非轉基因水稻耐害能力方面的差異，從而分析犯7化?幻在抗褐飛蝨中的重要作用。
【權利要求】
1.一種褐飛蝨基因#77似幻，其特徵在於，它具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
2.—種權利要求1所述褐飛蝨基因#77似幻的編碼蛋白，其特徵在於，它包含SEQ IDN0.2的胺基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID N0.2的胺基酸殘基序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID N0.2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQID N0.2衍生的蛋白質。
3.一種權利要求1所述褐飛蝨基因在轉基因植物中的應用。
4.一種權利要求1所述褐飛蝨基因Λ77處￥?在作物育種中的應用。
5.一種權利要求1所述褐飛蝨`基因#77化?^?在轉基因動物研究中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103820461SQ201410041114
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】婁永根, 陳紅丹, 紀銳, 李恆 申請人:浙江大學