建立版納甜龍竹芽尖高效再生體系的方法

2023-04-28 09:03:41 2

建立版納甜龍竹芽尖高效再生體系的方法
【專利摘要】一種版納甜龍竹芽尖高效再生體系的建立方法，按如下五個步驟進行：一是側芽愈傷組織的誘導培養，二是愈傷組織的繼代培養，三是幼苗的分化培養，四是幼苗的生根培養，五是再生植株的煉苗和移栽。本發明涉及一種以竹子的側芽芽尖為外植體的植物組培方法，是對以竹子側芽為外植體經組培獲得高效胚性愈傷組織的誘導率的有益嘗試，採用本方法能夠使外植體高效誘導出愈傷組織，建立高效的體細胞再生體系，為該竹子遺傳轉化和細胞工程研究創造有利條件，為利用轉基因技術育種奠定了良好的基礎，本方法簡單易行、利於推廣，實施條件寬鬆，效果顯著。
【專利說明】建立版納甜龍竹芽尖高效再生體系的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物組織培養技術，具體是以版納甜龍竹的芽尖為外植體，經過愈傷組織誘導、分化、生根，實現高效再生，以更進一步為農桿菌遺傳轉化工作打好基礎。
【背景技術】
[0002]版納甜龍竹(Dendrocalamus hamiltonii)屬於禾本科竹亞科牡竹屬，是世界三大甜龍竹之一，為優良的筍材兩用竹種。由於傳統育種方法存在消耗竹種多、繁殖係數低等缺點，採用基因工程對竹子進行品種改良已成為當前生物【技術領域】研究的重點與難點。版納甜龍竹基因轉化主要是農桿菌侵染法，作為基因轉化的受體系統要求具有高效的再生能力、穩定的遺傳特性、便捷的外植體來源、對農桿菌敏感等。因此，採用便捷的外植體建立高效穩定的再生體系一直是科研工作者追尋的目標。竹類植物的組織培養起步於1968年，之後，對牡竹屬(Dendrocalamus),箣竹屬(Bambusa)、寒竹屬(Chimonobambusa)等多種竹子以種胚為外植體已建立起了再生體系，但由於竹子較難開花，有效種子較難獲得，因而具有很大的局限性，不能根據科研者的需要隨時進行取材、實驗。以芽尖為外植體可以免受季節限制，取材方便，更具有普遍性與可行性。本專利申請以芽為外植體探索得到了高的胚性愈傷組織誘導率，建立了高效穩定的再生體系，為遺傳轉化奠定堅實的基礎，對此，尚未見有關資料的報導。

【發明內容】

[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種建立版納甜龍竹芽尖高效再生體系的方法。
[0004]解決該技術問題採用如下技術方案:本建立版納甜龍竹芽尖高效再生休系的方法包括以下步驟:
[0005](1)側芽愈傷組織的誘導培養:從生長健壯的無病斑和蟲疤的版納甜龍竹植株中取側芽為外植體，自來水下衝洗lh，用質量比濃度為I %的次氯酸鈉真空抽濾15分鐘，無菌水衝洗5-6次，在超淨工作檯上切長度為1±0.2cm的芽尖，接種於誘導培養基中，基本培養基MS (Murashige and Skoog),添加外源激素2,4_D即2,4-二氯苯氧乙酸和6-BA即6-節基腺嘌呤，2，4-D濃度為3-5mg.L—1，6-BA濃度為0.5-lmg.L-1，再添加500mg.L-1的CH即水解酪蛋白、500mg.L—1的Pro即脯氨酸和500mg.L—1的Gln即穀氨醯胺；調節pH為5.7,在25±2°C溫度中暗培養，誘導培養30±2d，愈傷組織形成；
[0006](2)愈傷組織繼代培養:取淡黃色顆粒狀愈傷組織接種於繼代培養基中，繼代培養基的基本培養基為MS，添加外源激素為濃度0.1-0.5mg.l-1的2，4-D，有機添加物、pH值和誘導培養基相同，在25±2°C溫度中暗培養30±2d ；
[0007](3)分化培養:選緻密顆粒狀的愈傷組織在分化培養基中誘導幼苗分化，分化培養基以MS為基本培養基，添加濃度為l_2mg.l-1的6-BA、濃度為0.3-0.5mg.l-1的NAA即萘乙酸、濃度為0-2mg.l-1的KT即激動素:pH值5.7，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C ；[0008](4)生根培養:當分化培養出的再生植株長至4_6cm高時移入生根培養基中進行生根培養，基本培養基為1/2MS，添加外源激素為3-511^171的IBA即吲哚丁酸，pH值5.7，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C ；
[0009](5)再生植株的煉苗和移栽:3-4周後根長粗、健壯時，將試管苗置於光強為200001ux的強光下煉苗一周後從試管中取出苗，用40±2°C的溫水洗淨根部的培養基，移栽於泥炭:珍珠巖:蛭石的體積比為1:1:1的混合基質中進行單株套袋培養，每天澆一次透水，一周後剪去塑科套袋兩角，兩周後脫去套袋，待長出新葉時移栽至溫室，培養出健壯的再生植株苗。
[0010]本發明的有益效果是:採用本方法最高愈傷組織誘導率為86.7%，最高幼苗分化率為51.7%，最高生根率為95%:能夠使外植體高效誘導出愈傷組織，建立高效的體細胞再生體系，為該竹子遺傳轉化和細胞工程研究創造有利條件，為利用轉基因技術育種奠定了良好的基礎。本方法實施步驟簡單易行，實施條件寬鬆，效果非常顯著。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為芽尖正在誘導的愈傷組織形態圖。
[0012]圖2為緻密顆粒狀愈傷組織形態圖。
[0013]圖3為柔軟水潰狀的愈傷組織形態圖。
[0014]圖4為變綠的愈傷組織形態圖。
[0015]圖5為緻密顆粒 狀愈傷組織分化出苗形態圖。
[0016]圖6為版納甜龍竹再生苗形態圖。
[0017]圖7為版納甜龍竹再生苗生根形態圖。
[0018]圖8為煉苗移栽後的植株形態圖。
[0019]圖9為愈傷組織誘導階段五種基本培養基的誘導率對比圖。
[0020]圖10為愈傷組織誘導階段2，4_D不同濃度的誘導率對比圖。
[0021]圖11為愈傷組織誘導階段6-BA不同濃度的誘導率對比圖。
[0022]圖12為愈傷組織誘導階段不同有機添加物的誘導率對比圖。
【具體實施方式】
[0023]本發明以下結合附圖和實施例作進一步詳述:
[0024]本建立版納甜龍竹芽尖高效再生體系的方法的步驟如下:
[0025](I)側芽愈傷組織的誘導培養:從生長健壯的無病斑和蟲疤的版納甜龍竹植株中取側芽為外植體，自來水下衝洗lh，用質量比濃度為I %的次氯酸鈉真空抽濾15分鐘，無菌水衝洗5-6次，在超淨工作檯上切長度為1±0.2cm的芽尖，接種於誘導培養基中，基本培養基MS (Murashige and Skoog),添加外源激素2,4_D即2,4-二氯苯氧乙酸和6-BA即6-節基腺嘌呤，2，4-D濃度為3-5mg.L—1，6-BA濃度為0.5, Img.L-1，再添加500mg.L-1的CH即水解酪蛋白、500mg.L—1的Pro即脯氨酸和500mg.L—1的Gln即穀氨醯胺:調節pH為5.7,在25±2°C溫度中暗培養，誘導培養30±2d，愈傷組織形成；
[0026](2)愈傷組織繼代培養:取淡黃色顆粒狀愈傷組織接種於繼代培養基中，繼代培養基的基本培養基為MS，添加外源激素為濃度0.1-0.5mg.L-1的2，4-D，有機添加物、pH值和誘導培養基相同，在25±2°C溫度中暗培養30±2d ；
[0027](3)分化培養:選緻密顆粒狀的愈傷組織在分化培養基中誘導幼苗分化，分化培養基以MS為基本培養基，添加濃度為l_2mg.L-1的6-BA、濃度為0.3-0.5mg.L-1的NAA即萘乙酸、濃度為0-2mg.l-1的KT即激動素；pH值5.7，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C:
[0028](4)生根培養:當分化培養出的再生植株長至4_6cm高時移入生根培養基中進行生根培養，基本培養基為1/2MS，添加外源激素為3-511^171的IBA即吲哚丁酸，pH值5.7，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C:
[0029](5)再生植株的煉苗和移栽:3-4周後根長粗、健壯時，將試管苗置於光強為200001ux的強光下煉苗一周後從試管中取出苗，用40±2°C的溫水洗淨根部的培養基，移栽於泥炭:珍珠巖:蛭石的體積比為1:1:1的混合基質中進行單株套袋培養，每天澆一次透水，一周後剪去塑料套袋兩角，兩周後脫去套袋，待長出新葉時移栽至溫室，培養出健壯的再生植株苗。
[0030]下面將與本發 明相關的試驗與附圖進行介紹:
[0031]圖1-圖8，可以從附圖本身結合各對應的【專利附圖】

【附圖說明】，一目了然看清，不另作介紹。
[0032]圖9為版納甜龍竹芽尖接種到五種不同基本培養基中愈傷組織誘導率情況對比圖。基本培養基選用1/2MS、MS、B5、Heller、White (各種基本培養基配方詳見:王蒂，植物組織培養，北京:中國農業出版社，2004)。圖中可看出MS基本培養基中愈傷組織誘導率顯著高於其他四種基本培養基，達85%，且愈傷組織絕大部分(61.7%)為淡黃色、顆粒狀的良好愈傷組織，與其他基本培養基誘導的良好愈傷組織(26.6% -43% )差異顯著。綜上所述，版納甜龍竹芽尖愈傷組織誘導的最適宜基本培養基為MS培養基。
[0033]圖10為版納甜龍竹芽尖接種到不同濃度2，4_D培養基中愈傷組織誘導率情況對比圖。2，4-D濃度梯度為0、0.1、0.3、l、3、10mg.L'圖中可看出不添加2，4-D及低濃度(0.1mg.L-1)時，沒有愈傷組織產生；隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織誘導率逐漸提高，濃度為3mg.1/1時達到85%且誘導的愈傷組織大多呈黃色、鬆脆顆粒狀，增殖較快，與其它處理達到顯著性差異，增加到IOmg.L-1時，愈傷組織誘導率下降，愈傷組織多疏鬆、水質團狀，愈傷組織增殖較慢。綜上所述，版納甜龍竹芽尖愈傷組織誘導的最適宜2，4-D濃度為3mg eL10
[0034]圖11為版納甜龍竹芽尖接種到不同濃度6-BA培養基中愈傷組織誘導率情況對比圖。6-BA濃度梯度為0、1、2、41^.!^。圖中可看出隨著6-BA濃度的增加愈傷組織誘導率呈下降趨勢，但當6-BA濃度為Img.L-1時，緻密顆粒狀的良好愈傷組織誘導率為最高，達63.3%，利於增殖分化，與其他處理達到顯著差異。綜上所述，版納甜龍竹芽尖愈傷組織誘導的最適宜6-BA濃度為Img.L'
[0035]圖12為版納甜龍竹芽尖接種到不同有機添加物的誘導培養基中愈傷組織誘導率情況對比圖。有機添加物為 500mg.L 1QUOOmg.L 1Pro^SOOmg.L 1GlruSOmg.L 1Ads、500mg.L 1YE 即酵母提取物、500mg.L ^H+SOOmg.L 1Glr^SOOmg.L 1Pro0 圖中可看出有機添加物對版納甜龍竹芽尖愈傷組織誘導沒有顯著作用，各處理與對照之間愈傷組織誘導率沒有顯著性差異。其中酵母提取物誘導的愈傷組織水化嚴重，增殖培養中愈傷組織多褐化；而水解酪蛋白、脯氨酸與穀氨醯胺的組合處理誘導的愈傷組織約有63.3%為顆粒狀鬆脆的良好愈傷組織，與其它處理達到顯著性差異。綜上所述，基本培養基中添加SOOmg.!/1水解酪蛋白、500mg.L-1脯氨酸與500mg.l-1穀氨醯胺時有利於改善版納甜龍竹芽尖愈傷組織誘導率及其質量。
[0036]表1正交實驗處理的版納甜龍竹愈傷組織分化情況對比表
[0037]
【權利要求】
1.版納甜龍竹芽尖高效再生體系的建立方法，其特徵是按下列步驟進行: (1)側芽愈傷組織的誘導培養:從生長健壯的無病斑和蟲疤的版納甜龍竹植株中取側芽為外植體，自來水下衝洗lh，用質量比濃度為I %的次氯酸鈉真空抽濾15分鐘，無菌水衝洗5-6次，在超淨工作檯上切長度為1±0.2cm的芽尖，接種於誘導培養基中，基本培養基MS (Murashige and Skoog),添加外源激素2,4-D即2,4_ 二氯苯氧乙酸和6-BA即6_苄基腺嘌呤，2，4-D濃度為3-5mg.L—1，6-BA濃度為0.5-lmg.L-1，再添加500mg.L-1的CH即水解酪蛋白、500mg.L—1的Pro即脯氨酸和500mg.L—1的Gln即穀氨醯胺:調節pH為5.7,在25±2°C溫度中暗培養，誘導培養30±2d，愈傷組織形成: (2)愈傷組織繼代培養:取淡黃色顆粒狀愈傷組織接種於繼代培養基中，繼代培養基的基本培養基為MS，添加外源激索為濃度0.1-0.5mg.L-1的2，4-D，有機添加物、pH值和誘導培養基相同，在25±2°C溫度中暗培養30±2d ； (3)分化培養:選緻密顆粒狀的愈傷組織在分化培養基中誘導幼苗分化，分化培養基以MS為基本培養基，添加濃度為l_2mg.L-1的6-BA、濃度為0.3-0.5mg.L-1的NAA即萘乙酸、濃度為Ojmg-L-1的KT即激動索;pH值5.7，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C; (4)生根培養:當分化培養出的再生植株長至4-6cm高時移入生根培養基中進行生根培養，基本培養基為1/2MS，添加外源激素為3-511^171的IBA即吲哚丁酸，pH值5.7，光強24001ux，光周期 16/8h，溫度 25±2°C ； (5)再生植株的煉苗和移栽:3-4周後根長粗、健壯時，將試管苗置於光強為200001UX的強光下煉苗一周後從試管中取出苗，用40±2°C的溫水洗淨根部的培養基，移栽於泥炭:珍珠巖:蛭石的體積比 為1:1:1的混合基質中進行單株套袋培養，每天澆一次透水，一周後剪去塑料套袋兩角，兩周後脫去套袋，待長出新葉時移栽至溫室，培養出健壯的再生植株苗。
【文檔編號】A01H4/00GK103782909SQ201410041069
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】林新春, 周玲, 王曉芹 申請人:浙江農林大學