人紅血球生成素基因在穩定轉染的哺乳動物細胞中的高水平表達的製作方法
2023-04-28 00:43:16
專利名稱：人紅血球生成素基因在穩定轉染的哺乳動物細胞中的高水平表達的製作方法
本申請是申請號為98115963.X，申請日為87年6月26日，發明名稱為「製備相當於人紅血球生成素基因片段的核苷酸序列的方法」的發明專利申請的分案申請。
本發明一般地涉及基因工程領域，具體說與重組基因的糖蛋白產物表達有關，更具體地說與從穩定轉染的細胞中高水平地表達有生物活力的人紅血球生成素有關。
紅血球生成素這一激素在調節紅血球生成、紅血細胞的形成以及由貧血導致的紅血球生成素缺乏中起著重要作用。由於缺少純的材料，對這個激素做詳細研究以及試圖用它進行替補治療一直都很困難。
人紅血細胞的產生，需要腎臟分泌成熟糖蛋白形式的紅血球生成素。在恆態時，這個激素在循環血液中濃度為每毫升10至18毫單位(128-230微微克)，在嚴重的組織供氧不足(缺氧)刺激下，它的水平可以增加一千倍。提高激素水平可觸發骨髓中感受幹細胞群的增生和分化，激活成熟紅細胞中血紅蛋白的合成，加速紅細胞從骨髓釋放進入循環，從而增加紅細胞量，改善供氧不足的局面。缺乏紅血球生成素的病人如慢性腎臟病人，常患有嚴重的貧血症。
紅血球生成素是一個34-38千道爾頓的糖蛋白，分子量的約40％是糖類提供的。至少一個二硫橋是活力所需的，對此激素的結構所知甚少，其合成的詳情也未全清楚。最近分離到的CDNA和基因組克隆，提供了分析紅血球生成素產生的調節控制的機會，但是，還沒有表達足夠數量的有生物活力的人紅血球生成素以用於替補治療。
按照本發明公開的內容，有生物活力的人紅血球生成素可以由穩定轉染的哺乳動物細胞系進行高水平表達(每升上清液超過二百萬名義滴度單位)，這就為臨床應用純的人紅血球生成素提供了巨大的來源。紅血球生成素的這一驚人的高水平表達，是通過用人紅血球生成素基因的Apa I限制片段轉染宿主細胞系實現的。Apa I限制片段的意義鏈有
圖1所示的核苷酸序列。
圖1表示含有人紅血球生成素基因序列的2426個鹼基對的Apa I限制片段；圖2繪出了含有2426個鹼基對的Apa I限制片段的有代表性的質粒表達載體(pD11-Ep)；圖3描繪的是另一個帶有Apa I限制片段的表達載體(pBD-Ep)。
在較好的實施方案中，如圖1所示的通過基因工程構建的Apa I限制片段被插入如圖2和圖3所示的哺乳動物表達載體中，然後將表達載體引入哺乳動物細胞系以發展穩定轉染的細胞，產生大量有生物活力的人紅血球生成素。所選擇的人紅血球生成素基因的Apa I限制片段要能最高效率地轉錄紅血球生成素信使RNA，有效地轉譯RNA和進行轉譯後的修飾，以生成具有生物活力的成熟紅血球生成素糖蛋白。具體地說，重要的是將紅血球生成素基因5′端幹擾序列除去，而保留增強子序列。為了保存有潛在價值的增強子序列，Apa I限制片段中的內含子也被保留。在基因的3′端某些3′非轉譯序列也被保留，使推測的調控序列最適化。由Apa I片段提供的增強表達為以下實例所證實，在下述實例中，該片段與兩個啟動子和兩個細胞系合用均得到穩定的高水平表達的紅血球生成素。
提出下列實例是用以闡述發明的優越性，並幫助普通的專門技術人員掌握和應用本發明。這些實例無論如何都不是企圖限制本發明公開的範圍，或本專利證書所提供的保護。
實例1.基因克隆的提取在入噬菌體中構建的人基因組文庫(Cell，151157-1174，1978)用低嚴緊度雜交條件及在Cell，38287-297，1984(特此引證)中所述的寡核苷酸探針混合物進行篩選寡核苷酸混合物系用Applied Biosystems合成儀製備，用32P-ATP及T4多核苷酸激酶作末端標記。設計的合成寡核苷酸相應於氨基末端部分的胺基酸序列H2N-Ala-Pro-？-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-？-Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala24此序列得自Yanagawa等人(J.Biol.Chem.2592707-2710，1984)從再生障礙貧血病人尿中純化的人蛋白質。為了減少這段胺基酸序列密碼子的簡併程度，採用了Grantham等(Nu-cleic Acids Research，843-59，1981)和Jaye等(Nucleic Acids Research，112325-2335，1983)的密碼子使用規律。這些規律考慮到了脊椎動物DNA中二核苷酸CpG相對地稀少，和適當地避免A:G潛在錯配。第24位胺基酸最可能是門冬醯胺(J.Biol.Chem 2592707-2710，1984)。對於胺基酸序列谷-丙-賴-谷-丙-谷-門冬醯胺，2組各72種相應於預期的密碼子序列被合成，第一組是20核苷酸探針，為TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)-GCTTC，第二組在第18位將T換為C。對於胺基酸序列谷-門冬醯胺-異亮-蘇-門冬-甘，構建一組序列為AGC TCC TCC ATC AGT ATT ATT T(c/t)的23核苷酸探針。
用寡核苷酸探針雜交到的噬菌斑，於低密度下重篩選直到純化。在起始的陽性噬菌體克隆通過噬菌斑純化後，Jacobs等發表了紅血球生成素基因的進一步的序列資料(Nature，313806-810，1985)。根據這一資料構建了寡核苷酸，並用於驗證陽性克隆，用EcoRI限制性酶酶解陽性克隆，用凝膠電泳純化其插入片段DNA，再用標準技術連結入預先用EcoRI限制性酶解的pUC13質粒中。藉助雙脫氧核苷酸鏈終止法測定DNA序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467，1977)，此測定使用dATP(α-35S)和通用的17核苷酸引物，或在選定的區域使用特殊的寡核苷酸引物進行。32P-ATP從ICN獲得，酶從New EnglandBiolabs或Bethesda Research Laboratories獲得。
大約4.8×106個噬菌體被雙份硝酸纖維素濾膜雜交法篩選。三個不同的克隆在噬菌斑純化過程中保持陽性，其DNA插入片段作限制圖譜和部分雙脫氧序列測定。三個克隆中有兩個顯然含有紅血球生成素基因的全部信息。這些克隆的限制圖譜及其2426個鹼基對的Apa I片段的序列(見圖1)與最近Jacobs等發表的人紅血球生成素基因序列(Nature，313806-810，1985)基本相同。在這個增殖的文庫中提出的含有紅血球生成素基因的噬菌體頻度之低-約2×106個噬菌體中有1個-與紅血球生成素基因在人染色體基因組中以單拷貝存在的說法相符。用紅血球生成素基因的Apa I片段或其它限制片段與總人染色體DNA作Southern吸印雜交，只顯現單一雜交區帶，沒有其它高度同源的DNA區域。
實例2.ApaI限制片段的選擇為構建表達載體，紅血球生成素基因的Apa I限制片段按Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467，1977所述的技術(特此引證)製備得到。簡言之，提取的噬菌體DNA用限制酶Apa I(Bethesda Research Laboratories)酶解，然後在1％瓊脂糖凝膠上分離，電泳洗脫，酚抽提和乙醇沉澱。此片段通過如實例1中的部分測序法驗證。
參照圖1，插入的Apa I限制片段含有58個鹼基對的5′非翻譯序列(0001-0058核苷酸)，後面是推測的27個胺基酸的信號肽編碼序列、成熟蛋白、四個推測的插入序列和222個鹼基對的3′非編碼DNA序列。在基因的5′端，Apa I位點是在蛋白序列的起始密碼子ATG(0058)上遊58個鹼基對處。選擇這個5′端位點(0001)是為了避免緊靠Apa I限制位點上遊的一個假起始點，同時又保存了被認為是對核糖體有效地結合和加工很重要的調控序列。選擇3′端的Apa I位點(2426)，以在大多數3′非翻譯區保留推測的加工信號，並除去更下遊的序列。使用完整的紅血球生成素基因，包括其內含子序列，是為了保留在內含子中潛在的調節和增強子序列，它們可能在紅血球生成素基因的表達或蛋白質的修飾和分泌方面發揮作用。
實例3.帶有Apa I限制片段的表達質粒的構建包含完整的人紅血球生成素基因的2426鹼基對的Apa I限制片段被插入兩個表達載體pD11和pBD，二者分別基於不同的哺乳動物啟動子。
質粒表達載體pD11是從前述的質粒衍生的(Nucleic AcidsResearch，13841-857，1985，此處特予引證)，含有猴腎病毒40(SV 40)的增強子序列和複製起始區，以及腺病毒2的主要晚期啟動子和三重引導序列。人紅血球生成素基因組序列的Apa I片段(圖1)為凝膠純化，單鏈末端用T4 DNA聚合酶補齊，用Bam HI連接子連接二個平末端，將組建物插入pD11的單一Bam HI限制位點，以從一個強啟動子直接轉錄紅血球生成素的基因。
組建的帶有Apa I片段(Ep)的表達質粒pD11-Ep的結構繪如圖2。質粒pD11是由PML的EcoRI(RI)位點插入以下成分所構成，即含有350鹼基對的腺病毒左側末端(0-1)，SV-40複製起始區和增強子序列(E)，腺病毒的主要晚期啟動子(MLP)，腺病毒2的三重引導序列(L1-3)，第三個引導序列的5′拼接位點(5′SS)，免疫球蛋白的3′拼接位點(3′SS)，以及SV-40晚期多聚腺苷酸信號(pA)。重組的質粒在E.Coli HB101中克隆，氯化銫等密度離心純化，表達質粒pD11-Ep大約為6500鹼基對，構建產物為限制圖譜及部分雙脫氧測序法驗證。
pBD含有金屬硫蛋白I啟動子序列(MT-1，Glanville，Durham and Palmiter，Nature，292267-269，1981特此引證)和帶有二氫葉酸還原酶(DHFR)選擇標記序列的pUC質粒。參照圖3，此2426鹼基對的Apa I限制片段(Ep)插入pBD的唯一SmaI限制位點，形成表達質粒pBD-Ep。pBD-EP的DHFR序列與SV-40的複製起始序列和增強子序列以及肝炎病毒B表面抗原聚腺苷酸序列相連。pBD-Ep的構建基本如上述的pD11-Ep。
雖然在這些確證實驗中使用質粒載體，但也設想了改用病毒或逆病毒表達載體，以相似的方式將Apa I紅血球生成素基因片段引入寄主細胞系。適合此目的的DNA病毒包括腺病毒或BPV(牛乳頭狀瘤病毒)，而合適的逆病毒也是已知的和現成的。很清楚這樣的逆病毒(RNA)載體將攜帶Apa I限制片段的反義鏈，即相應於圖1的意義鏈的RNA轉錄產物序列，或其等價物。逆病毒載體亦將包括將病毒基因組反轉錄及將病毒DNA整合入寄主基因組所需的跨染色體作用因子的序列。
實例4.哺乳動物細胞的轉染二種哺乳動物細胞系，各用pD11-Ep和pBD-Ep轉染。哺乳動物細胞系COS-7(猴腎)和BHK(幼大鼠腎)保存在含10％胎牛血清的改良Dul becco基本培養基中。細胞傳代至50-70％融合時，用磷酸鈣法轉染(Virology，52456-467，1973)。BHK系從腎上皮細胞而來，一般認為它們是最可能在哺乳動物貧血或缺氧時產生出天然狀態紅血球生成素的，因此，這些細胞有可能識別紅血球生成素Apa I片段上關鍵性的調控序列，有效地加工和產生出紅血球生成素糖蛋白。
為做細胞的臨時表達，在100毫米培養皿中加入20微克總DNA，其中10微克帶有紅血球生成素基因的pD11-Ep質粒，及10微克載體鮭魚精子DNA，48小時後，收集上清液，400g離心10分鐘，除去細胞及顆粒，於-20℃冰凍，細胞亦分別收集，單獨用pD11-EP轉染臨時表達結果見表1，數據是每型細胞各三次實驗而來。
表1
觀察到的哺乳動物細胞系COS-7或BHK分泌到上清液中的紅血球生成素，比以前報導的編碼紅血球生成素cDNA或用整個紅血球生成素基因作的臨時表達都要高約80倍。
為建立產生高水平紅血球生成素的穩定細胞系，COS-7或BHK細胞用pD11-EP和pDHFR-1a質粒同時轉染(後者為包含二氫葉酸還原酶cDNA的相似的哺乳動物表達載體)。轉染步驟改為用5微克pD11-EP質粒，5微克pDHFR-1a質粒和10微克載體DNA做共同轉染，繼續保溫18-24小時，然後將不同濃度的氨甲蝶呤(10毫微摩爾/升至1毫摩爾/升)加入培養基。摻入DHFR基因的細胞在此選擇培養基上成活。當保溫數天後，分離出抗氨甲蝶呤的集落，傳代及篩選上清液中紅血球生成素活力，被檢測的抗氨甲蝶呤的集落中，大約一半分泌有可測得的紅血球生成素活力。
為用表達載體pBD-EP建立穩定的細胞系，用磷酸鈣法轉染BHK細胞，18-24小時後，培養基中加入1微摩爾/升至1毫摩爾/升的氨甲蝶呤，培養數天後，分離出在較高氨甲蝶呤中存活的集落，傳代和篩選，在這一系列中，所有被檢測的抗氨甲蝶呤的集落都分泌有可測得的紅血球生成素的活力。
為了使含有紅血球生成素基因和DHFR基因的轉錄單位表達最適化，將含有pBD-Ep或pD11-EP的分泌高水平紅血球生成素的各BHK細胞系在濃度遞增的氨甲蝶呤中傳代數次(Nature，316271-273，1985)。然而，不是通過氨甲蝶呤濃度的小間隔逐步增加對細胞系施加選擇壓力，而是使這些細胞立即受到濃度非常高的氨甲蝶呤(即1毫摩爾/升)的挑戰。僅僅極少數細胞存活下來，但這些細胞中質粒組建物摻入到DNA中特別有利於表達的部位(所謂熱點)和/或擁有許多組建的轉錄單位的複本。因此，一步就可以選擇到最高產的細胞系，假若在缺少氨甲蝶呤選擇壓力下傳15代以上，仍保持紅血球生成素的高產，這些細胞系(包括在表2所列的F7.2和S5.2)可以看做是穩定的了。
不能在細胞顆粒中定量紅血球生成素的活力，因為細胞抽提物中有許多抑制檢測的因子。所以表2所列的結果只是細胞系產生和分泌到上清液中的紅血球生成素蛋白，沒有分析胞內的紅血球生成素的水平。
表2從穩定轉染的BHK細胞系中表達的重組紅血球生成素
表2(續)
觀察到的紅血球生成素分泌相當於高達每升七百萬單位的名義產率。這一名義產率是將觀察到的每毫升產量乘一千倍得到的，以給出預期的大規模生產時每升的產量。
使用Apa I片段所觀察到的紅血球生成素產量，比早先報導的使用不同的人紅血球生成素基因片段穩定轉化的CHO細胞系得到的產量(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，827580-7584，Nov.1985)高三百倍以上。
這些轉染物測定中的對照實驗，包括非轉染細胞的上清液，和用編碼其它蛋白質—包括細菌的氯黴素轉乙醯酶和人凝血因子IX-的DNA轉染的細胞平行培養物的上清液，這些對照培養物，模擬的轉染或用其它基因轉染的培養細胞，均無可測得的紅血球生成素活力。也須指出，上述各紅血球生成素基因的實驗中，從選擇出的細胞系獲得的表達水平，與伴隨紅血球生成素基因的選擇性標記是與之共同感染，還是在感染前先插入含Apa I片段的質粒，並無關係。
適於實用於此發明的其它有代表性的感染方法，包括DEAE-葡聚糖中介的轉染技術，溶菌酶融合法或紅細胞融合法，刮削法，直接攝入法，滲透休克或葡糖休克法，直接微注射或間接微注射法，諸如紅細胞中介的技術和/或把宿主細胞置於電流中等方法。轉染是指將遺傳信息，具體地說是將人紅血球生成素基因Apa I限制片段的編碼信息，利用提取的DNA、RNA或合成的核苷酸多聚物轉移入細胞內，上面所列的轉染技術並不能算已經完善，因為把遺傳信息導入細胞的其它手段無疑將會發展出來。在進行轉染之前，典型地說，Apa I限制片段通常可以接於(連接到)其它的核酸的序列，諸如啟動子，增強子和聚腺苷酸序列。雖然敘述了哺乳動物來源的各宿主細胞系，並特別提到了腎臟上皮細胞，但也考慮到了本發明可以使用其它的真核和原核(細菌或酵母)宿主細胞系。最近將哺乳動物基因引入植物細胞的成功，提供了利用植物和藻類細胞的潛在可能性。
實例5.從轉染的細胞系表達紅血球生成素分泌到轉染的細胞系上清液中的紅血球生成素是有生物活力的，分泌出大量的激素高達每毫升七千單位。
紅血球生成素活力的體外測定是根據小鼠骨髓細胞在血漿凝塊培養基上紅色集落的形成(CFU-E，紅色集落形成細胞)(BloodCells，489-103，1978)這個測定的靈敏度約為5毫單位/毫升。作為測定標準的紅血球生成素是由貧血綿羊血漿部分純化得到的製劑(Connaught，第三步的EP，批號3026)，用於測定的是在不含氨甲蝶呤的新鮮培養基上生長24小時的傳代細胞系的上清液，每毫升含2×105個骨髓細胞、10％加檸檬酸鹽處理的牛血清、20％胎牛血清、1％牛血清白蛋白和1.6％胎牛提取物(Gibco)的測定培養基中，加入1至10微升用培養基按1∶200稀釋的上清液，培養36至48小時後，血漿凝塊在載玻片上固定，用聯苯胺做血紅蛋白染色，數紅細胞集落的數目。當不加紅血球生成素時，測不到由CFU-E產生的集落。通常，每毫升培養物用50毫單位的紅血球生成素(0.64毫微克)能夠觀察到最合適的集落生長(每2×104個骨髓細胞可測得100-150個CFU-E)。如表1和表2所示，大量的紅血球生成素激素分泌到轉染細胞系上清液中，高達每毫升7000單位，假設重組的紅血球生成素的比活力與天然紅血球生成素等價(每毫克蛋白質78000單位)，此生物測定結果即相當於每毫升大約80微克的紅血球生成素蛋白質。
此外，使用多價的抗人紅血球生成素兔抗血清(J.Cell.physiol.11887-96，1984)做競爭性放射免疫測定，以檢測選擇出的細胞系上清液中有免疫反應活力的紅血球生成素。用放射免疫測定檢測到的蛋白量，與生物檢測估計的蛋白水平相等。這些數據說明轉染細胞系表達和分泌的紅血球生成素蛋白約98％以上是有活力的。
對轉染的細胞產生的重組紅血球生成素做進一步的檢查，以證實這些細胞分泌的確是天然的激素，選擇出的細胞系被用在重度缺氧引起紅細胞增生的小鼠中做紅血球生成素的體內檢測(Nature，1911069-1087，1961)。細胞系分泌的上清液用重度缺氧引起紅細胞增生的小鼠檢測，有著強烈的體內生物活力。在應用部分純化的天然紅血球生成素做的實驗中，早就注意到，當在整體動物中檢測時，唾液酸酶的處理可以完全消除紅血球生成素的活力(J.Biol.Chem.2475159-5160，1958)。此活力的喪失推測是由於肝臟對去唾液酸激素的清除增強的結果，因為唾液酸酶處理的紅血球生成素在體外檢測可保有其全部活力。所觀察到的體內的強烈的生物活力，說明了轉染的哺乳動物細胞系在轉譯後修飾階段，在紅血球生成素蛋白上添加上了適當的糖和末端唾液酸。
在分開的實驗中，體外生物檢測到的紅血球生成素的活力，亦為加到培養基中的抗人紅血球生成素抗體所中和。
那些有代表性的轉染細胞系分泌到上清液中的紅血球生成素，也檢測了它們對其它骨髓祖代細胞的增生效應。檢測重組的紅血球生成素對人和小鼠骨髓來源的各種祖代細胞的效應，包括紅色群落生成細胞(CFU-E)、紅色突發形成細胞(erythroid burst-forvming cells，EFU-E)、粒細胞—巨噬細胞前體(CFU-GM)以及混合細胞群落生成細胞(CFU-Mix)(J.Cell.Physiol.Suppl.179-85，I982；J.Cell.Phy-siol.11887-96，1984)。紅色幹細胞對重組紅血球生成素顯示的增生效應，與對天然紅血球生成素顯示的效應有平行的劑量關係。由對於CFU-GM和CFU-MiX，重組紅血球生成素的濃度增加到每毫升檢測細胞培養物10個單位，都不顯示任何增生效應。
在還原的或非還原條件下做SDS-PAGE分析時，純化的重組紅血球生成素與再生障礙貧血病人尿中純化的紅血球生成素電泳情形相同。這些蛋白顯示出同樣的微觀不均一性，其主要成分都在分子量34千道爾頓處。
儘管本發明與提出的實施例一起敘述，普通專門技術人員在閱讀了上述實例後將能夠做出各種修改，使用等價物取代，或對上面提到的組分和方法做其它的更改。因此，我們打算把這一專利證書的保護範圍僅僅由所附的權利要求及其等價部分所定義的內容加以限制。
權利要求
1.基本上由人基因組紅細胞生成素基因Apa I 2.4kb限制片段組成的重組DNA。
2.權利要求1的重組DNA，具有圖1A和1B所示的核苷酸序列。
3.含有基本上由人基因組紅細胞生成素基因Apa I 2.4kb限制片段組成的插入片段的重組DNA構建體。
4.由權利要求3的重組DNA構建體轉化的真核宿主細胞。
5.權利要求4的真核宿主細胞，其為哺乳動物細胞。
6.權利要求5的真核宿主細胞，其為幼倉鼠腎細胞。
7.基本上由相應於人紅細胞生成素基因Apa I限制片段的核苷酸序列組成的基本上純化的DNA或RNA。
8.權利要求7的DNA或RNA，其中Apa I限制片段基本上由圖1所示核苷酸序列的有義鏈或其互補RNA序列組成。
9.與能夠實現其表達的第二核酸序列有效連接的權利要求7的DNA或RNA序列。
10.權利要求9的DNA或RNA，其中第二核酸序列選自以下一個或多個啟動子序列、增強子序列、聚腺苷醯化序列、可選擇標記序列、質粒、病毒和逆轉錄病毒表達載體和逆轉錄病毒反式作用因子。
11.含有權利要求9的DNA或RNA的細胞。
12.權利要求11的細胞，其中細胞用所述DNA或RNA穩定轉染。
13.權利要求12的細胞，其中細胞選自真核細胞和細菌。
14.權利要求13的細胞，其中真核細胞是酵母細胞。
15.權利要求13的細胞，其中真核細胞是腎來源的。
16.權利要求15的細胞，其中腎細胞是上皮細胞。
17.由權利要求1的方法製備的、具有紅細胞生成調節活性的糖蛋白。
全文摘要
一種表達重組人紅血球生成素的方法，包括用主要含有人紅血球生成素基因的2.4kb Apa I限制片段的DNA、RNA或核苷酸序列轉染宿主細胞，使轉染細胞與培養基相接觸，表達並回收紅血球生成素。以及一種通過與保溫的培養基接觸的細胞系表達重組人紅血球生成素的方法，包括在所說的方法中加入能在保溫培養基中產生紅血球生成素的細胞系，所說的細胞系通過用主要含有人紅血球生成素基因的2.4kb Apa I限制片段的DNA、RNA或核苷酸序列轉染宿主細胞系產生。
文檔編號C12N15/27GK101041819SQ20061010068
公開日2007年9月26日 申請日期1987年6月26日 優先權日1986年6月27日
發明者傑裡·S·鮑威爾 申請人:華盛頓大學評議會