作為心血管病的標誌和治療靶的il1rl－1的製作方法

2023-04-28 13:47:46 3

專利名稱：作為心血管病的標誌和治療靶的il1rl－1的製作方法
技術領域：
本發明涉及診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發明涉及可用於治療心血管疾病的分離的分子，所述心血管疾病包括心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
背景技術：
在發達國家中，儘管在心血管疾病的治療上已經取得了很大進展，但是心血管疾病仍然是疾病和死亡的最常見的原因。因此，心血管疾病如心肌梗塞和中風的預防和治療已經成為主要為公共健康服務的一個重要領域。目前已經認識到了幾個心血管疾病發病的危險因素，並且已經在臨床上廣泛用於發現高危患者。這種篩選檢查包括評估總的和HDL膽固醇水平。但是，許多明顯是低度到中度危險的患者也會發生心血管疾病，而辨別這類患者的能力還非常有限。而且，累積數據表明在不同的患者人群中，對具有患心血管疾病危險的患者和已患有心血管疾病的患者進行的預防性和治療性治療的有益效果的程度也有所不同。然而，目前還缺乏用於確定某種治療效果較好還是效果較差的診斷性檢測數據。
發明簡述本發明提供了用於診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發明識別了基因，當心臟細胞受到機械誘導而變形的時候該基因在細胞中受到正調控。基於這個發現，本發明的分子可用於治療心血管(包括血管)疾病，包括心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
除此之外，還提供了使用這些分子診斷任何上述心血管(血管)疾病的方法。
還進一步提供了用於製備治療上述疾病的治療劑的組合物。
因此本發明在幾個方面包括了多肽，編碼這些多肽的分離核酸，上述分子的功能性修飾物和變體，上述分子的有用片段，以及相關的治療方法和診斷方法。
根據本發明的一個方面，提供了一種診斷由核酸分子的異常表達及其表達產物的異常(或上述分子的獨特片段的異常)表徵的疾病的方法。該方法包括使來自患者的生物樣品與試劑接觸，所述試劑特異地與所述核酸分子，其表達產物，或者其表達產物的片段結合，檢測所結合試劑的量，由此確定所述核酸分子的表達或者其表達產物是否有異常，表達有異常即診斷為疾病，其中所述核酸分子為白介素1受體樣1(IL1RL-1，也稱為T1/ST2，ST2，和Fit-1，SEQ ID NO1和2是可溶形式，SEQ ID NO3和4是膜結合形式)。術語IL1RL-1，T1/ST2，ST2和Fit-1在本說明書中可以互換使用。在一些實施方案中，所述疾病是選自下組的心血管疾病心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。在一個實施方案中，所述疾病是心臟肥大。在另一個實施方案中，所述疾病是心力衰竭。在特定的實施方案中，生物樣品包括生物活組織切片樣品，以及生物流體例如血液/血清。
根據本發明的另一個方面，提供了確定患者的心血管疾病階段(例如退化，發展或者發作)的方法，其中所述階段由核酸分子的異常表達及其表達產物的異常(或上述分子的特定片段的異常)表徵。所述方法包括監控患者樣品的選自下組的參數(i)IL1RL-1核酸分子(或其獨特片段)，(ii)由IL1RL-1核酸編碼的多肽，(iii)由該多肽衍生的肽(或其獨特片段)，以及(iv)可選擇性結合所述多肽或肽(或其獨特片段)的抗體，這些參數可以確定患者的所述心血管疾病(例如退化，發展或者發作)所處的階段。在一些實施方案中，所述樣品是任何前述實施方案中所述的生物流體或是組織。在特定的實施方案中，監控的步驟包括使所述樣品與一種選自下組的可檢測到的試劑接觸(a)可在嚴謹條件下與(i)所述核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)可選擇性地與(ii)所述多肽，或者(iii)所述的肽結合的抗體，以及(c)可選擇性地與(iv)的抗體結合的多肽或肽。所述抗體，多肽，肽，或核酸都可以用可檢測到的標記例如放射性標記或酶進行標記。在另一個實施方案中，所述方法包括監控(檢測)樣品中的肽。在另一個實施方案中，對樣品的監控持續一段時間。
根據本發明的一個方面，提供了一種試劑盒。所述試劑盒包括容器，其中含有可以選擇性地與任何上述IL1RL-1分離核酸，或其表達產物結合的試劑，以及對照，用於與所述試劑與任意上述分離核酸或其表達產物的結合的測量值進行比較。在一些實施方案中，用於與測量值進行比較的對照具有預先確定的值。在特定的實施方案中，對照包括任意上述分離核酸的表達產物的表位。
根據本發明的一個方面，提供了一種治療心血管疾病的方法。所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療心血管疾病的IL1RL-1分子。在特定的實施方案中，所述心血管疾病選自心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。在一些實施方案中，所述方法進一步包括同時給予選自下組的製劑抗炎製劑，抗血栓形成製劑，抗血小板製劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合併能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的製劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統抑制劑。
根據本發明的另一個方面，提供了一種治療心臟肥大的方法。所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療患者的心臟肥大的製劑以增加IL1RL-1核酸分子或者其表達產物的表達。
根據本發明的另一個方面，提供了一種治療患者以減少患者發生心血管疾病的危險性的方法。所述方法包括給IL1RL-1分子表達水平異常的患者施用有效量的能減少心血管疾病危險性，或者降低患者在未來發生心血管疾病的危險性的製劑，其中所述製劑是抗炎製劑，抗血栓形成製劑，抗血小板製劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合併能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的製劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統抑制劑。在特定的實施方案中，所述患者沒有需要用所述製劑治療的其它症狀。
根據本發明的一個方面，提供了一種鑑定可用於治療心血管疾病的候選試劑的方法。所述方法包括在不存在候選試劑的條件下測定心臟細胞或組織中IL1RL-1分子的表達，其中所述心臟細胞或組織中IL1RL-1分子的為第一種表達量，使所述心臟細胞或組織與候選試劑接觸，測定所述IL1RL-1分子表達的檢測量，其中在存在候選試劑的條件下表達的檢測量與第一種表達量相比有所降低，表明該候選試劑可用於治療心血管疾病。在重要的實施方案中，IL1RL-1分子是任一個SEQ ID NO1-4所述的分子。在特定的實施方案中，所述心血管疾病選自心臟肥大(例如非適應性肥大)，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
根據本發明的另一個方面，提供了一種藥物組合物。所述藥物組合物包括一種試劑，所述試劑包括製藥有效量的可治療心血管疾病的IL1RL-1分離核酸分子(SEQ ID NO1或3)，或其表達產物(例如SEQ ID NO2或4)，以及藥學可接受的載體。在特定的實施方案中，所述心血管疾病選自心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
根據本發明的再一方面，還提供了製備用於治療心血管疾病的藥物的方法。所述藥物優選包括有效量的至少一種上述分子或組合物。
根據本發明的另一個方面，提供了固相核酸分子陣列。所述陣列基本由一組核酸分子，其表達產物，或其片段(核酸片段或者多肽分子片段)組成，其中至少一種IL1RL-1分子(包括其表達產物，或其片段)固定於固相底物之上。在一些實施方案中，固相陣列進一步包括至少一種對照核酸分子。
在特定的實施方案中，所述固相底物包括選自下組的物質玻璃，矽，矽酸鋁，矽酸硼，金屬氧化物例如氧化鋁和氧化鎳，各種粘土，硝化纖維素，和尼龍。優選所述底物是玻璃。在一些實施方案中，所述核酸分子通過共價結合固定於固體底物之上。
根據本發明的另一個方面，提供了評價患者在用能減少心血管疾病危險性的試劑進行的治療中獲益的可能性的方法。在重要的實施方案中，所述試劑選自抗炎製劑，抗血栓形成製劑，抗血小板製劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合併能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的製劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統抑制劑。所述方法包括獲得患者的IL1RL-1分子水平，將所述IL1RL-1分子水平與心血管疾病診斷特異性的預定值相比較。所述IL1RL-1分子水平與預定值的比較可以表明患者是否通過用所述試劑進行的治療而獲益。在特定的實施方案中，心血管疾病診斷特異性的預定值是多個預定標記物水平範圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個預定標記物水平範圍中。所述心血管疾病可以是選自心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭中的疾病。
本發明的另一個方面提供了一種預測心血管疾病結果的方法。所述方法包括獲得患者的IL1RL-1分子水平，將所述IL1RL-1分子水平與心血管疾病的預測結果特異性的預定值相比較。所述IL1RL-1分子水平與預定值的比較可以表明患者是會具有好的/正的結果還是會具有壞的/負的結果。在一些實施方案中高水平的IL1RL-1分子可能表示負的結果，而低水平可能表示正的結果。在特定的實施方案中，心血管疾病的預測結果特異性的預定值是多個預定標記物水平範圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個預定標記物水平範圍中。所述心血管疾病可以是選自心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭中的疾病。
IL1RL-1分子的任何序列都可以用於本發明的任何方面和任何實施方案中。例如，除了如SEQ ID NO1和3所述的核苷酸序列之外，還包括如SEQ ID NO5和7所述的核苷酸序列。除了包括如SEQ ID NO2和4所述的預測胺基酸序列之外，還包括如SEQ ID NO6和8所述的預測胺基酸序列。
本發明的這些方面和其他方面將通過發明詳述來進一步詳細描述。
序列簡述SEQ ID NO1是人IL1RL1(可溶的)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是人IL1RL1(可溶的)cDNA(SEQ ID NO1)的翻譯產物的預測胺基酸序列。
SEQ ID NO3是人IL1RL1(膜結合的)cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO4是人IL1RL1(膜結合的)(SEQ ID NO3)的翻譯產物的預測胺基酸序列。
SEQ ID NO5是鼠Fit-1S cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是鼠Fit-1S cDNA(SEQ ID NO5)的翻譯產物的預測胺基酸序列。
SEQ ID NO7是鼠Fit-1M cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO8是鼠Fit-1M cDNA(SEQ ID NO7)的翻譯產物的預測胺基酸序列。
附圖簡述

圖1是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以後8％周期性機械應變對於培養的心肌細胞中Fit-1的表達的影響。
圖2是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以後，8％周期性機械應變，血管緊張素受體的阻斷，血管緊張素II，IL-1b，和佛波酯對於培養的心肌細胞中IL1RL-1的表達的影響。
圖3是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以後，8％周期性機械應變，過氧化氫，和TIRON對於培養的心肌細胞中IL1RL-1的表達的影響。
圖4是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以後，在心肌細胞發生8％周期性機械應變的過程中，放線菌素D和環己亞胺對於IL1RL-1表達的誘導的影響。
圖5是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以後，8％周期性機械力單獨，或與IL-1b一起，以及在沒有機械應變的條件下的佛波酯，對於IL1RL-1的表達的影響。
圖6是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以後，8％周期性機械應變對於培養的心肌細胞中空泡型ATP酶的表達的影響。
圖7顯示了本發明的試劑盒的外形特徵。
圖8顯示了心肌細胞中機械應變對T2/ST2的mRNA誘導的早期(左)和晚期(右)階段。3小時達到最大誘導量，維持9小時，然後經15小時下降。頂部組為T1/ST2 RNA；底部組為溴化乙錠。無應變為沒有機械應變。
圖9顯示了通過機械應變(8％)，白介素-1(10ng/ml)和佛波酯(PMA，200nM)在1小時和3小時對T1/ST2的mRNA的誘導。PMA＞機械應變＞IL-1。頂部組為T1/ST2 mRNA，底部組為溴化乙錠。
圖10顯示了T1/ST2可能是在心肌細胞中IL1/IL-受體信號傳導中由NF-kB的激活誘導的一種基因。IL-1和機械應變在用對照腺病毒感染的條件下誘導T1/ST2 mRNA(左)。在被IB腺病毒感染的條件下(右)會降低NF-B DNA的結合活性，IL-1對T1/ST2的誘導被阻斷。機械應變對T1/ST2的誘導被IB腺病毒感染部分阻斷，表明機械應變還通過另一種途徑誘導T1/ST2。頂部組為T1/ST2 mRNA，底部組為溴化乙錠。
圖11顯示了小鼠心肌梗塞後TI/ST2蛋白的表達，在梗塞後1天和3天進行免疫組化分析。40倍放大。
圖12以圖解方式顯示了人患者心肌梗塞後體循環中的ST2蛋白水平；a.在心肌梗塞後1天與14天和90天相比ST2蛋白顯著增加；b.線性回歸分析證明了在心肌梗塞後1天循環ST2蛋白和肌酸激酶之間有顯著的正相關關係(p＜0.001)。Log ST2＝0.454(log CK)-1.07；c.心肌梗塞後1天循環ST2蛋白水平和和射血分數的四分位值分析。較低的射血分數伴隨著較高的ST2蛋白。
圖13顯示了在隨訪的30天內，ST2基準水平的升高表示較高的死亡率。(對數秩，p＝0.0009)。
發明詳述本發明涉及多個基因的發現，當心臟細胞受到機械誘導發生應變變形的時候所述基因在細胞中受到正調控。由於這個發現，本發明的分子可以用於治療心血管疾病，包括心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和/或心力衰竭。
除此之外，還提供了使用這些分子診斷任何上述心血管疾病的方法。
進一步，還提供了用於製備治療上述疾病的治療劑的組合物。
這裡所述的「正調控」是指提高基因和/或它所編碼的多肽的表達。「提高表達」是指提高本發明的任何一種核酸(IL1RL-1，SEQ ID NO1，3)的複製、轉錄、和/或翻譯(即達到可檢測的水平)，這些過程的任何一種受到正調控都會導致該基因(核酸)編碼的多肽的濃度/量的增加。相反地，這裡所述的「負調控」或「降低表達」是指降低基因和/或它所編碼的蛋白的表達。基因表達的正調控或負調控可以直接根據分別檢測所述基因的mRNA水平，或所述基因編碼的多肽的蛋白表達水平的升高或降低確定，檢測可以用所屬領域已知的任何適當的方法，例如分別用核酸雜交或抗體檢測方法，並與對照相比較。
這裡所說的「心臟細胞」是指心肌細胞。
這裡所說的「分子」包括「核酸」和「多肽」兩者。
這裡所說的「表達」指核酸和/或多肽表達。
這裡所說的「患者」指哺乳動物或非人的哺乳動物。在所有的實施方案中，人核酸，多肽，以及人患者都是優選的。用人分子和其它文獻所述的鼠分子得到的結果預示著用其它同源序列也可以得到這樣的結果。
通常，同源序列和等位基因與本發明的人序列具有至少80％的核苷酸相同性和/或至少85％的胺基酸相同性。進一步，同源序列和等位基因可以與人序列分別具有至少90％，95％，或甚至99％的核苷酸相同性和/或至少95％，98％，或者甚至99％的胺基酸相同性。同源性可以用NCBI(Bethesda，Maryland)提供的各種公開軟體計算。實例包括Altschul SF等的啟發式算法(JMol Biol，1990，215403-410)，也稱為BLAST。可以用公共軟體(EMBL，Heidelberg，Germany)和商業軟體(例如OxfordMolecular Group/Genetics Computer Group，Madison，WI，Accelrys，Inc.，San Diego，CA的Mac Vector序列分析軟體)進行Pairwiseand ClustalW對準排列(BLOSUM30矩陣設置)。本發明還包括上述核酸的Watson-Crick互補序列。
在篩選相關基因，例如本文所述的序列的同源序列和等位基因的時候，可以在嚴謹條件下進行Southern blot，並使用探針。這裡所說的術語「嚴謹條件」是指所屬領域所熟悉的參數。對於核酸來說，嚴謹雜交條件通常是指條件為低離子強度，溫度低於DNA雜交複合物的熔解溫度(Tm)(通常是比雜交的Tm低3℃)。較高的嚴謹條件有助於使探針序列和靶之間具有更高的特異性。核酸雜交的嚴謹條件是所屬領域熟知的，可以在描述此方法的文獻中找到，例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley Sons，Inc.，New York。「高度嚴謹條件」的一個實例是65℃，6×SSC。高度嚴謹條件的另一個實例是在65℃雜交，雜交緩衝液由3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，2.5mM NaH2PO4[pH7]，0.5％SDS，2mMEDTA組成。(SSC是0.015M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH7；SDS是十二烷基磺酸鈉；EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交後，將DNA轉移膜上，在室溫用2×SSC洗滌，然後用0.1×SSC/0.1×SDS洗滌直至溫度達到68℃。在另一個例子中，可用甲醯胺雜交溶液代替雜交水溶液。這時嚴謹雜交條件可以是，例如50％甲醯胺溶液，42℃。還可以使用其他條件，試劑等，也可以達到類似的嚴謹程度。所屬領域技術人員熟知這些條件，因此這裡不再描述。應當認識到，所屬領域技術人員能夠控制條件使得可以清楚地鑑定本發明的IL1RL-1核酸的同源序列和等位基因。所屬領域技術人員還熟知篩選細胞的方法，表達這些分子文庫，然後從文庫中分離出相關核酸分子並測序。
根據本發明給出的全長人和鼠cDNA的克隆，可以用標準菌落雜交技術從cDNA文庫中分離出其它哺乳動物序列例如與相關人和鼠核酸相應的(小鼠，牛等的)cDNA，還可以用同源性搜索進行識別，例如用這裡描述的任何算法或所屬領域已知的算法在GenBank中搜索。例如GenBank序列號Y07519.1和D13695.1是小鼠IL1RL-1的同源序列，在本發明的各個方面都可以和本發明的同源鼠序列互換使用，而不背離本發明的精神。
相應這裡所說的核酸，術語「分離的」意思是(i)在體外通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；(ii)通過克隆產生重組體；(iii)通過切割和凝膠分離進行純化；或者(iv)通過例如化學合成進行合成。分離的核酸可以容易地通過所屬領域熟知的重組DNA技術獲得。因此，在其5』和3』端的限制性位點已知的，或者已公開了其聚合酶鏈式反應(PCR)的引物序列的載體中所含有的核苷酸序列被認為是分離的，但是以天然狀態存在的或是存在於其天然宿主中的核酸序列則不是分離的。分離的核酸可以被純化，但是不需要純化。例如在克隆或表達載體內的分離的核酸是不純的，因為在細胞內它可能只包含微量的物質。但是這樣的核酸如本文所用的術語一樣是分離的，因為它可以很容易用所屬領域普通技術人員所公知的標準技術獲得。
根據本發明，本發明的任何上述IL1RL-1核酸的表達，包括上述序列的獨特片段，可以用不同的方法確定。這裡所說的相關核酸的「獨特片段」是指較大核酸的「特徵片段」。例如，獨特片段應足夠長，以確保它的精確序列在人基因組中除上述定義的每一個核酸之外都不存在。所屬領域普通技術人員僅用常規實驗就可以確定一個片段在人基因組中是否是獨特的。但是，獨特片段不包括完全由本申請的申請日之前公開的核苷酸序列組成的片段。
獨特片段可以用作Southern和Northern blot檢測的探針，以識別核酸，或者可以用於擴增檢測例如使用PCR進行的檢測。如所屬領域技術人員所知，優選使用大的探針如200，250，300個或更多個核苷酸用於特定用途如Southern和Northern blots，而優選使用較小的片段用作其它用途如PCR。獨特片段也可以用於產生融合蛋白以生成抗體，或者結合多肽片段，或者生成免疫檢測成分。同樣地，獨特片段可以用於產生非融合片段，例如IL1RL-1多肽，它可用於，例如抗體的製備，免疫檢測或治療。獨特片段進一步可用作反義分子，以分別抑制上述核酸和多肽的表達。
所屬領域技術人員應當認識到，獨特片段的大小取決於它們在遺傳密碼上的保守性。因此，SEQ ID NO1，和3及其互補序列的一些區域的獨特片段較長，而其它序列的獨特片段較短，一般是12到32個核苷酸長(例如12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31和32個鹼基)或者更多，直至每個公開的序列的全長。如上所述，本發明公開了每個序列的每一個片段，從第一個核苷酸，第二個核苷酸等等開始，直至離末端8個核苷酸，以每個序列的第8位，第9位，第10位核苷酸等等之後的任一個結束，直至最後一個核苷酸，(該序列如上所述是獨特的)。例如，事實上SEQ ID NO1從第1個核苷酸到第1357個核苷酸區域，或者SEQ ID NO3從第1個核苷酸到第2058個核苷酸區域的任何片段，或其具有20個或更多個核苷酸的互補序列都是獨特的。所屬領域技術人員熟知選擇這種序列的方法，典型地是基於獨特片段能將所感興趣的序列選擇性地與人基因組中的其它序列區分開。將片段序列與已知資料庫中的序列相比較就足夠了，雖然還可以在體外進行驗證性的雜交和測序分析。
本發明的特定方面包括選擇性地與編碼多肽的核酸分子結合以降低該多肽活性的反義寡核苷酸。
這裡所說的「反義分子」，「反義寡核苷酸」，和「反義」所描述的寡核苷酸是寡核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，修飾的寡核糖核苷酸，或者修飾的寡脫氧核糖核苷酸，它們可在生理條件下與含有特定基因的DNA或該基因的轉錄mRNA雜交，從而抑制該基因的轉錄和/或抑制該mRNA的翻譯。反義分子應能通過與靶基因或其轉錄產物雜交從而幹擾靶基因的轉錄或翻譯。所屬領域技術人員應當認識到反義寡核苷酸的確切長度以及它與靶互補的程度取決於所選擇的特定靶，包括靶的序列以及組成該序列的特定鹼基。優選反義寡核苷酸的組成和排布使其能夠在生理條件下選擇性地與靶結合，即在生理條件下相對於靶細胞中的其它序列更多地是與靶序列結合。基於SEQ ID NO1，和3，或等位基因或同源染色體和/或cDNA序列，所屬領域技術人員可以很容易選擇併合成可用於本發明的任何適當的反義分子。要達到足夠的選擇性和抑制能力，反義寡核苷酸應當包括至少10個，更優選地至少15個與靶互補的連續鹼基，雖然在特定的條件下，長度為7個鹼基的修飾寡核苷酸也可成功用於反義寡核苷酸(Wagner et al.，Nat.Med，1995，1(11)1116-1118；Nat.Biotech.，1996，14840-844)。最優選地，反義寡核苷酸含有20-30個鹼基的互補序列。
雖然寡核苷酸可以是基因或mRNA轉錄物的任何區域的反義物，在優選的實施方案中，反義寡核苷酸相應於N末端或者5』上遊位點，例如翻譯起始，轉錄起始或者啟動子位點。除此之外，反義寡核苷酸也可以靶定3』未翻譯區域。在所屬領域中，也可以靶定mRNA剪接位點，但是如果存在其它的mRNA剪接則不傾向於使用這種方式。除此之外，反義物優選靶定不影響mRNA二級結構的位點(參見，例如，Sainio et al.，Cell Mol.Neurobiol.14(5)439-457，1994)和不與蛋白質結合的位點。最後，雖然SEQ IDNO1和3，公開了cDNA序列，所屬領域普通技術人員可以很容易獲得上述序列的基因組DNA序列。因此，本發明還提供了與SEQ ID NO1和3相應的基因組DNA互補的反義寡核苷酸。類似地，無需過度的實驗就可以獲得其等位基因或者同源的人cDNA和基因組DNA的反義物。
本發明的寡核苷酸可以包括RNAi分子。RNA幹擾或者說「RNAi」包括使用雙鏈RNA(dsRNA)阻斷基因表達(參見，例如Sui，G，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.995515-5520，2002)。本發明的實施方案中使用的RNAi策略方法是所屬領域普通技術人員公知的。
在一些實施方案中，本發明的反義寡核苷酸可以由「天然的」脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或其任意組合組成。也就是說一個天然核苷酸的5』端和另一個天然核苷酸的3』端可以通過核苷間的磷酸二酯鍵共價結合，如天然狀態那樣。這些寡核苷酸可以通過所屬領域公知的方法，通過人工操作或者用自動合成儀製備。它們也可以通過載體重組產生。
但是，在優選的實施方案中，本發明的反義寡核苷酸還包括「修飾的」寡核苷酸。也就是說，所述寡核苷酸可以通過多種方式修飾，修飾的方式不妨礙它們與其靶雜交，但是可以增強它們的穩定性或者它們對目標的靶定，或者增強它們的治療效果。
這裡所說的術語「修飾的寡核苷酸」是指這樣的寡核苷酸(1)其中至少兩個核苷酸通過合成的核苷間連接(即除一個核苷酸的5』端和另一個核苷酸的3』端之間的磷酸二酯鍵以外的連接)相連和/或(2)其中通常不與核酸相連的化學基團與該寡核苷酸共價連接。優選的核苷間連接是硫逐磷酸酯，膦酸烷基酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，硫逐磷酸烷基酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸鹽，磷酸三酯，乙醯胺，羧甲基酯和肽。
術語「修飾的寡核苷酸」還包括具有共價修飾的鹼基和/或糖的寡核苷酸。例如，修飾的寡核苷酸包括具有與除3』位置的羥基以外的以及除5』位置的磷酸基團以外的低分子量的有機基團共價連接的骨架糖。因此修飾的寡核苷酸可以含有2』-O-烷基化核糖基團。除此之外，修飾的寡核苷酸可以含有糖例如用阿拉伯糖代替核糖。因此本發明包括含有在生理條件下與編碼SEQ ID NO2和/或4的多肽的核酸互補並與之雜交的修飾的反義分子的藥物製備物，以及藥學可接收的載體。
反義寡核苷酸可以作為藥物組合物的一部分給藥。這樣的藥物組合物可以含有反義寡核苷酸和所屬領域公知的標準生理學和/或藥學可接收的載體的組合。所述組合物應當是無菌的，並且在適於給患者施用的單位重量或單位體積中含有治療有效量的反義寡核苷酸。術語「藥學可接收的」是指不會干擾活性成分的生物學活性的效果的非毒性物質。術語「生理學可接收的」是指與生物系統例如細胞，細胞培養物，組織，或生物體相容的非毒性物質。載體的特徵取決於給藥的方式。生理學和藥學可接收的載體包括稀釋劑，填充物，鹽，緩衝液，穩定劑，增溶劑，以及所屬領域熟知的其它物質。
本發明還包括編碼由SEQ ID NO1和/或3的核酸，片段及其變異體編碼的蛋白質的表達載體，以及含有這些表達載體的宿主細胞。實際上，任何細胞，不論是原核的或真核的，只要能被異源DNA或RNA轉化並能在培養基中生長或維持，都可以用於本發明。實例包括細菌細胞例如大腸桿菌，和哺乳動物細胞例如小鼠，倉鼠，豬，羊，靈長類動物等。細胞可以是多種組織類型，包括肥大細胞，成纖維細胞，卵母細胞和淋巴細胞，它們可以是初始細胞或細胞系。特定的例子包括CHO細胞和COS細胞。也可以使用不含細胞的轉錄系統代替細胞。
這裡所說的「載體」可以是任何核酸，其中所需要的序列可以通過限制性切割和連接插入該核酸，以在不同的遺傳環境中傳遞或者在宿主細胞中表達。載體通常是由DNA組成，雖然RNA載體也可以使用。載體包括但不限於質粒，噬菌粒和病毒基因組。克隆載體是能夠在宿主細胞內複製，並且可由一種多種內切酶限制性位點表徵的載體，其中該載體可以以確定的方式切割，並且所需的DNA序列可以連接到其中並使新的重組載體保留了其在宿主細胞中複製的能力。如果載體是質粒，當質粒在宿主細菌增加拷貝數的時候所需序列可以複製多次，或者在宿主通過有絲分裂繁殖之前在每個宿主中只複製一次。如果載體是噬菌體，可以在溶胞階段主動複製，或者在溶源階段被動複製。表達載體是所需的DNA序列可以通過限制性切割和連接插入其中並且與調控序列可操作地連接並通過RNA轉錄表達的載體。載體可以進一步包括一個或多個適用於識別已經被或沒有被載體轉化或轉染的細胞的標記序列。標記包括，例如編碼可以增加或減少對抗體或其它化合物的抗性或敏感性的的蛋白的基因，編碼其活性可以用所屬領域公知的標準檢測方法檢測的酶的基因(例如-半乳糖苷酶或鹼性磷酸酶)，以及可見的能影響所轉化或轉染細胞，宿主，菌落或噬斑的表型的基因(例如綠色螢光蛋白)。優選的載體是能夠自發複製並表達存在於DNA區段中並與之可操作地連接的結構基因產物的載體。
這裡所說的編碼序列和調控序列，當它們共價連接以使編碼序列的表達或轉錄受到調控序列的影響或控制的時候稱為「可操作地連接」。如果需要，編碼序列可以翻譯為功能蛋白。如果5』調控序列的啟動子誘導導致了編碼序列的轉錄，並且如果兩個DNA序列之間的連接狀態不會(1)導致出現移碼突變，(2)幹擾啟動子區域指導編碼序列的轉錄，或者(3)幹擾相應RNA轉錄物翻譯成蛋白質的能力，則兩個DNA被稱為可操作地連接。因此，如果啟動子區域能夠影響DNA序列的轉錄並使轉錄產物能夠被翻譯成所需的蛋白質或多肽，則啟動子區域應當是可操作地與編碼序列連接。
基因表達所需的調控序列的確切特徵隨種屬或細胞類型的不同而不同，但是通常包括，轉錄和反義分別所必需的5』非轉錄和5』非翻譯序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT序列，等等。這種5』非轉錄調控序列通常包括啟動子區域，該啟動子區域含有對可操作連接的基因進行轉錄控制的啟動子序列。調控序列還可以含有所需的增強子序列或者上遊活化子序列。本發明的載體可以任選地含有5』前導序列或信號序列。選擇和設計合適的載體在所屬領域普通技術人員的能力和判斷力之內。
含有所有表達所必需元件的表達載體是商業可獲得的，也是所屬領域技術人員公知的。參見，例如，Sambrook et a1.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。可以通過向細胞中引入編碼多肽或其片段或變體的異源DNA(RNA)構建基因工程細胞。該異源DNA(RNA)可操作地受到轉錄元件的控制，使其可以在宿主細胞中表達異源DNA。
哺乳動物細胞中優選的mRNA表達系統包括例如pcDNA3.1(可從Invitrogen，Carlsbad，CA獲得)，其含有可選擇的標記例如賦予G418抗性的基因(有助於選擇穩定轉染的細胞系)，以及人巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子序列。除此之外，適於在靈長類或犬細胞系中表達的是pCEP4載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其含有Epstein Barr病毒(EBV)複製起點，有助於使質粒成為多拷貝染色體外元件。另一種優選的表達載體是腺病毒，在Stratford-Perricaudet的文獻中有描述，其是E1和E3蛋白缺陷型(J.Clin.Invest.90626-630，1992)。
本發明還包括所謂的表達試劑盒，使得技術人員可以製備所需的表達載體。這種表達試劑盒包括至少上述討論的每一個編碼序列的分離部分。也可以加入其它所需的組分，只要其中含有所需的上述序列。
還應當認識到本發明包括上述SEQ ID NO1和/或3，含有cDNA序列的表達載體轉染宿主細胞和細胞系，如原核細胞(例如大腸桿菌)，或真核細胞(例如CHO細胞，COS細胞，酵母表達系統和昆蟲細胞中的重組杆狀病毒表達)的用途。特別有用的是哺乳動物例如小鼠，倉鼠，豬，羊，靈長類動物等的細胞。它們可以是多種組織類型，包括靈長類細胞和細胞系。特定的例子包括樹突狀細胞，U293細胞，外周血白細胞，骨髓幹細胞和胚胎幹細胞。
本發明還提供了由上述核酸(SEQ ID NO1和3)編碼的分離的多肽(包括整個蛋白和部分蛋白)，還包括SEQ ID NO2和/或4的多肽，以及它們的獨特片段。這種多肽可單獨使用或作為融合蛋白的一部分生成抗體，或者作為免疫檢測的組分。可以從生物樣品包括組織或細胞勻漿中分離多肽，也可以在多種原核和真核表達系統中重組表達多肽，其是通過構建適合於表達系統的表達載體，將表達載體引入表達系統，分離重組表達蛋白。短的多肽，包括抗原性肽(例如由細胞表面的MHC分子呈遞以進行免疫識別的肽)也可以用已知的肽合成方法化學合成。
就這裡所說的多肽而言，術語「分離的」表示以足夠純的形式從其天然環境中分離出來，以使它能夠用於本發明的任何目的。因此分離的表示足夠純以用於(i)產生和/或分離抗體，(ii)作為檢測試劑，(iii)測序，(iv)作為治療劑等。
每一個上述多肽的獨特片段都具有如上所述的與核酸相關的獨特片段的特徵。所屬領域技術人員應當認識到，獨特片段的大小取決於各種因素如該片段是否由若干個保守蛋白域組成。因此，多肽的某些區域應當必須具有比較長的片段才是獨特的，而其它區域只需要短的片段，一般是在5到12個胺基酸之間(例如5，6，7，8，9，10，11和12個胺基酸或更多，包括每一個整數直至每個多肽的全長)就可以。
多肽的獨特片段優選是那些能保留該多肽的獨特功能的片段。獨特片段所保留的多肽的功能包括與抗體的相互作用，與其它多肽或其片段的相互作用，與其它分子的相互作用等。一種很重要的活性就是作為識別該多肽的特徵。所屬領域技術人員熟知選擇獨特胺基酸序列的方法，通常是基於獨特片段能夠將所感興趣的序列與非家族成員區分開。所需要做的就是將所述片段的序列與已知資料庫中的序列比較。
本發明包括上述多肽的變體。這裡所說的多肽的「變體」是其中含有一個或多個天然(例如「野生型」具有選自SEQ ID NO2和4的胺基酸序列的多肽)多肽的初級胺基酸序列的修飾。能夠產生多肽變體的修飾通常是對編碼該多肽的核酸進行的，可以包括缺失，點突變，截斷，胺基酸取代以及插入胺基酸或非胺基酸分子，其目的是(1)降低或消除多肽的活性；(2)增強多肽的一種性質，例如蛋白質在表達系統中的穩定性或者蛋白-配體連接的穩定性；(3)為蛋白提供一種新的活性或性質，例如插入抗原性表位或者插入可檢測到的分子，或者(4)為多肽受體或其它分子提供同等的或更好的連接。可選擇地，修飾可以是直接針對多肽的，例如切割，插入連接體分子，插入可檢測到的分子，例如生物素，插入脂肪酸等。修飾也可以包括含有該多肽全部或部分胺基酸序列的融合蛋白。所屬領域技術人員應當熟悉預測蛋白質序列發生改變對於蛋白質構象的影響，並可以根據已知方法「設計」一種變體多肽。這種方法的一個實例如Dahiyat and Mayoin Science 27882-87，1997所述，其中蛋白是完全新設計的。所述方法可以應用於已知蛋白，僅改變該多肽序列的一部分。使用Dahiyat and Mayo所述的的計算方法，可以得到任何上述多肽的特異變體，並進行檢測以確定所述變體是否具有所希望的構象。
變體可以包括進行特定修飾的改變了與其生理活性無關的多肽性質的多肽。例如半胱氨酸殘基可以被取代或者被刪除以防止產生不希望的二硫鍵。類似地，可以改變特定的胺基酸以通過在表達系統中消除蛋白酶的蛋白質水解作用增強多肽的表達(例如酵母表達系統中的二元胺基酸殘基，其中存在KEX2蛋白酶活性)。
編碼多肽的核苷酸的突變優選保留了編碼序列的胺基酸閱讀框，優選不在核酸中產生可能雜交形成二級結構，例如發卡或環的區域，這不利於表達變體多肽。
可以通過選擇胺基酸取代，或者通過在編碼多肽的核酸的選定位點進行任意突變產生突變。然後表達變體多肽並檢測其一種或多種活性以確定哪種突變得到的變體多肽具有所希望的性質。可以對其中所述多肽的胺基酸序列處於沉默狀態，但是卻具有在特定宿主中進行翻譯的優選密碼子的變體(或者非變體多肽)進行進一步突變。核酸在例如大腸桿菌中翻譯的優選密碼子是所屬領域普通技術人員所熟知的。還可以對基因的非編碼序列或cDNA克隆進行其它突變以增強多肽的表達。
所述領域技術人員應當認識到，可以對任意上述多肽進行保守性胺基酸取代，以提供上述多肽的功能相同的變體，即這些變體保留了每個多肽的功能。這裡所說的「保守性胺基酸取代」是指胺基酸取代不顯著改變多肽的三級結構和/或活性。可以使用所屬領域普通技術人員公知的改變多肽序列的方法製備變體，包括那些描述此方法的參考文獻中所述的方法，例如MolecularCloningA Laboratory Manual，J.Sambrook，et a1.，eds.，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley Sons，Inc.，New York。胺基酸的保守性取代包括在下列各組內的胺基酸取代(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。
因此本發明包括多肽的功能相同的變體，即保留著天然(「野生型」)多肽的功能的多肽變體。產生每個多肽的功能等同性變體的多肽胺基酸序列的保守性胺基酸取代是通過改變編碼所述多肽的核酸得到的。可以用所屬領域普通技術人員所公知的多種方法進行這種取代。例如，根據Kunkel(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82488-492，1985)所述的方法進行PCR定向突變，位點定向突變，或者化學合成編碼多肽的基因以進行胺基酸取代。多肽的功能等同性變體的活性可以通過下述方法檢測將編碼改變的多肽的基因克隆到細菌或哺乳動物表達載體中，將載體引入合適的宿主細胞中，表達改變的多肽，用本文所述的方法檢測多肽功能。
本發明如本文所述具有多種用途，其中一些在本文其它部分描述。首先，本發明使得可以分離多肽。可以用所屬領域技術人員熟知的多種方法得到分離的分子。所述多肽可以從天然能產生該多肽的細胞中通過層析方法或免疫識別純化。可選擇地，可將表達載體引入細胞以生產所述多肽。在另一種方法中，可以將mRNA轉錄物通過顯微注射或其它方法引入細胞中，以生產所述的編碼多肽。mRNA在不含細胞的提取物例如網織紅細胞溶解產物系統中的翻譯也可以用於生產多肽。所屬領域技術人員還可以很容易地用已知的方法分離多肽。這些方法包括但不限於免疫層析，HPLC，排阻層析，離子交換層析和免疫親和層析。
在特定的實施方案中，本發明還包括衍生自多肽的「顯性抑制」多肽。顯性抑制多肽是一種蛋白質的無活性的變體，通過與細胞體系的相互作用，取代活性蛋白與細胞體系的相互作用或者與活性蛋白競爭，由此減少了活性蛋白的作用。例如，與配體結合但在與配體結合的同時不傳遞信號的顯性抑制受體可以減少配體表達的生物學作用。同樣地，顯性抑制無催化活性的激酶可以正常地與靶蛋白相互作用，但是不能磷酸化靶蛋白，這可以減少靶蛋白響應細胞信號時發生的磷酸化。類似地，顯性抑制轉錄因子可以與基因控制區域的啟動子位點結合但是不增加基因轉錄，這可以通過佔據啟動子結合位點而又不增加轉錄來減少正常轉錄作用。
在細胞中表達顯性抑制多肽的最終結果是降低了活性蛋白的功能。所屬領域普通技術人員可以評估蛋白質顯性抑制變體潛在的功能，並且使用標準的突變技術產生一種或多種顯性抑制變體多肽。參見，例如，美國專利序列號5,580,723和Sambrook etal.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。所屬領域技術人員然後可以檢測減少了選定的活性和/或保留了此活性的突變多肽群體。其它類似的生成和檢測蛋白質的顯性抑制變體的方法對於所屬領域普通技術人員是顯而易見的。
本發明的cDNA的分離使技術人員有可能診斷由任何上述cDNA的異常表達表徵的疾病。這些方法包括確定每一個所識別的核酸，和/或由其生成的多肽的表達。在上述情況下，這種確定可以通過任何標準的核酸確定性檢測，包括聚合酶鏈式反應，或者用標記的雜交探針來進行，如下文例示。在後者的情況下，可以通過標準的免疫檢測，用例如與分泌蛋白結合的抗體進行確定。
本發明還包括分離的肽結合試劑，例如，該試劑可以是抗體或者抗體的片段(「結合多肽」)，具有能選擇性地與本發明的任何多肽(例如SEQ ID NO2或4)結合的能力。抗體包括多克隆和單克隆抗體，可以根據傳統方法製備。
重要的是，如本領域熟知的，只有抗體的一小部分，抗原決定簇，與抗體與其表位的結合有關(參見，一般的，Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern ImmunologyWiley Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)EssentialImmunology，7th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。pFc』和Fc區域，例如，是補體級聯繫統的效應物，但不涉及抗原結合。其pFc′區域被酶切了的，或者不含有pFc′區域的抗體稱為F(ab』)2片段，保留有完整抗體的抗原結合位點。類似地，其Fc區域被酶切了的，或者不含有Fc區域的抗體稱為Fab片段，保留有完整抗體分子的一個抗原結合位點。進一步，Fab片段由共價結合的抗體輕鏈和抗體重鏈的Fd部分組成。Fd片段是抗體特異性的主要決定因素(一個單獨的Fd片段可以和多達十個不同的輕鏈結合而不會改變其抗體特異性)，Fd片段在分離過程中保持了表位結合能力。
在抗體的抗原結合部分中，如所屬領域所熟知的，具有可以和抗原的表位直接相互作用的互補決定區(CDR)，以及維持抗原決定簇的三級結構的框架區(FR)(參見，一般的，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈中，具有四個框架區域(FR1到FR4)，分別被三個互補決定區(CDR1至CDR3)分隔開。CDR，特別是CDR3區域，更特別的是重鏈CDR3，主要負責抗體的特異性。
所屬領域已知哺乳動物抗體的非CDR區域可以被同種或異種抗體的類似區域取代，而還保持原始抗體的表位特異性。這清楚地由「人化的」抗體的研究和使用所證明，其中非人的CDR與人FR和/或Fc/pFc』區域共價結合，產生功能性抗體。參見，例如，美國專利序列號4,816,567；5,225,539；5,585,089；5,693,762和5,859,205。因此，例如，PCT國際
發明者理察·T·李 申請人:布賴漢姆婦女醫院