合成的多不飽和脂肪酸類似物的製作方法
2023-04-25 15:15:01 1
專利名稱：合成的多不飽和脂肪酸類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗瘧活性和/或刺激嗜中性白細胞活性的新的多不飽和脂肪酸，另外，某些這類新的多不飽和脂肪酸抑制細胞因子活性。
世界上超過半數的人口處於瘧疾的危險之中，每年記載約有5億人患急性感染，約有一百萬人死亡(熱帶病進展國際研究，1987-1988，第九計劃報告，UNDP/世界銀行/WHO，日內瓦，43-49；Stevenson MM編輯的《瘧疾宿主對感染的反應》前言，CRC出版公司)。使用抗瘧藥物伴有許多嚴重問題，因為對抗瘧藥物的抗性不斷增加，並且抗瘧藥物有毒副作用。許多目前使用的抗瘧藥物不適用於兒童(大多數處於潛伏的致命腦瘧疾的危險之中)、孕婦和老年人。
嗜中性白細胞/巨噬細胞刺激劑可以用於治療其它感染，包括假絲酵母感染、錐蟲感染、病毒如肝炎病毒和新培斯病毒感染、軍團菌感染、李斯特氏菌病感染、肺囊蟲感染、假單胞菌感染。它們也可用於遭受免疫損害的個體包括癌症化療病人、移植受體和燒傷病人的輔助治療。另外，也可治療其它所謂正常的個體，例如老年人、2周歲以下兒童、飲酒過度的人，已知這些人的吞噬細胞活性較差。
炎症可能由細菌、病毒和/或其它感染原、機會性感染(其可能由免疫力降低狀態引起，例如由癌症或治療特別是胞毒性藥物治療或放療所致)、自身免疫性或其它原因引起。膿毒休克是是與系統性炎症相關的疾病的一個例子，通過將LPS給予動物可以在動物中重現革蘭氏陰性膿毒休克的許多臨床特徵，其可以促發嚴重的代謝和生理變化，從而導致死亡。與LPS感染相關的是促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNFα)的過度產生。將TNF長期給予小鼠、大鼠和/或人會導致厭食、體重下降並在7-10天內耗竭體內脂類和蛋白質(Cerami等人，1985，免疫學通信11，173；Fong等人，1989，實驗醫學雜誌170，1627；Moldawer等人，美國生理學雜誌254 G450-G456，1988；Fong等人，美國生理學雜誌256，R659-R665(1989)；McCarthy等人，美國臨床自然雜誌，42，1179-1182)。在伴有極度瘦弱的癌症病人和慢性病人中的TNF水平已經被測量。
TNFα已被牽涉在除毒性休克和癌症相關的極度瘦弱以外的其它伴有慢性炎症的疾病的病理中。已在患有類風溼病和反應性關節炎的病人的滑液以及患有類風溼性關節炎的病人的血清中檢測到TNF(Saxne等人，1988，關節炎和類風溼病，31，1041)。在腎移植病人的急性排斥期檢測到升高水平的TNF(Maury and Teppo，1987，實驗醫學雜誌，166，1132)。在動物中，已證明TNF牽涉在異源骨髓移植後在皮膚和腸道的移植物對宿主疾病的病理中。
給予兔抗小鼠TNF抗體已證明能防止與移植物對宿主疾病相關的組織學變化並降低死亡率(Piquet等人，1987，實驗醫學雜誌，166，1220)。也已證明TNF與瘧疾病理也顯著相關(Clark等人，1987，美國病理學雜誌，129，192-199)。另外，在瘧疾病人中報導了升高的TNF血清水平(Scuderi等人，1986，柳葉刀，2，1364-1365)。
已進一步發現升高的促炎細胞因子水平在類風溼性關節炎、多發性硬化症(MS)和Crohns氏症中引起病理和組織遭受破壞。實驗發現中和細胞因子產生細胞活性的抗體(例如抗CD4+T細胞的抗體或抗CD3的抗體)或者中和細胞因子本身活性的抗體(例如抗TNF抗體)是有益的。已知高水平的幹擾素γ與MS的病勢加重有關。
PUFA’s具有一系列的有用生物學活性(例見國際專利申請WO93/00084和WO95/00607及其引述的參考文獻)。不幸的是由於其在體內的穩定性有限，因此PUFA’s還不能廣泛用作治療劑。本發明人開發了一種將胺基酸偶聯到PUFAs的方法，使得PUFAs在保持生物學活性的同時具有增加的穩定性和溶解性。這些新的聚不飽和脂肪酸(PUFA)化合物具有直接的抗瘧疾活性，除了其直接的抗瘧疾活性外，某些新的PUFA能活化人嗜中性白細胞釋放顆粒成分，並在生產超氧化物中與TNF顯示有協同效應。PUFA對人嗜中性白細胞的活化導致這些細胞具有增強的殺死血紅細胞中的瘧疾寄生蟲(惡性瘧原蟲，P.falciparum)以及細菌金黃色葡萄球菌的活性。
另外，本發明人還發現某些胺基酸偶聯的PUFA是抗炎的，它們在不能活化嗜中性白細胞的同時降低了促炎細胞因子的產生。
因此，本發明涉及具有抗瘧疾和/或嗜中性白細胞刺激活性或者抗炎活性的不飽和脂肪酸化合物，所述的不飽和脂肪酸含有一16-26個碳原子鏈，3-6個雙鍵，其中該不飽和脂肪酸在羧基端與一胺基酸共價偶聯。
在本發明的一個優選實施方案中，脂肪酸含有18-22個碳原子。
在本發明的另一個優選實施方案中，胺基酸是甘氨酸或天冬氨酸。
在本發明的又一個優選實施方案中，脂肪酸是一種n-3至n-6化合物。
在本發明的再一個優選實施方案中，該化合物是γ-亞麻酸-甘氨酸，α-亞麻酸-甘氨酸，花生四烯酸-甘氨酸，廿二碳六烯酸-甘氨酸，二十碳五烯酸甘氨酸，γ-亞麻酸-天冬氨酸，α-亞麻酸-天冬氨酸，花生四烯酸-天冬氨酸，二十碳五烯酸-天冬氨酸，廿二碳六烯酸-天冬氨酸。
為更清楚地了解本發明的實質，參照下列實施例和附圖描述本發明的優選形式
圖1和2示出PUFAs對釋放嗜苯胺藍顆粒的作用；圖3示出用PUFAs處理後嗜中性白細胞特異性顆粒成分的釋放；以及圖4示出PUFA對嗜中性白細胞介導的金黃色葡萄球菌的殺滅的作用。
在這些附圖中使用了如下縮寫204花生四烯酸205二十碳五烯酸226廿二碳六烯酸gly 甘氨酸asp 天冬氨酸表1示出胺基酸偶聯的PUFAs的直接抗瘧疾活性。
表2示出胺基酸偶聯的PUFAs抑制PHA刺激的外周血單核細胞產生TNFα和幹擾素γ的活性。
表3示出胺基酸偶聯的PUFAs抑制外周血單核細胞的經PHA刺激增殖(主要是T細胞增殖)的活性。方法嗜中性白細胞的製備來自正常健康個體的肝素化血在Ficoll-Hypaque培養基上培養至密度為1.114，然後於室溫在600g離心30-40分鐘，細胞在Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中洗三次。所得製劑對於白血細胞為96-99％純，根據其排除臺盼藍的能力鑑定其＞99％存活。血紅細胞的汙染總是低於1％嗜中性白細胞，血小板的汙染通常不存在。脂肪酸微膠粒的製備及嗜中性白細胞的預處理為解決脂肪酸在水溶液中的不溶性，通過超聲波處理在HBSS中製備混合的二棕櫚醯磷酯醯膽鹼(DPC，400μg)脂肪酸(100μg)微膠粒。嗜中性白細胞在37℃預處理30分鐘。在一些實驗中，將PUFA溶於乙醇。嗜中性白細胞化學發光的測量向100μl在HBSS中的嗜中性白細胞(1×106)中加入100μl脂肪酸微膠粒或者DPC以及另外300μlHBSS，隨後立即加入500μl光澤精(0.25mg/ml於PBS中)，在發光計中測量一段時間的光輸出(mV)。用來自不同個體的細胞進行三份重複實驗，所得值代表反應的峰值。脫粒的測量通過測量維生素B12結合蛋白(如Gottleib等人，1965，血液，25875-883所述)和β-葡糖醛酸酶釋放(如Kloldeney and Mumford，1976，臨床化學年鑑，70247-257)測定脫粒。殺菌檢測根據Ferrante and Abell，1986，感染免疫學，51607所述程序測定嗜中性白細胞對金黃色葡萄球菌的殺菌活性。單核細胞增殖檢測如Ferrante and Thong(1978...)所述從正常人供體的外周血分離單核細胞，將單核細胞重懸於含20％人AB血清的RPMI-1640中並置入96孔微板中(每孔50μl，細胞密度為4×106細胞/ml)。隨後加入50μl脂肪酸並與細胞在37℃、5％CO2下預溫育30分鐘，然後加入100μl促分裂原(PHA、ConA、PWM、金黃色葡萄球菌)並與細胞在37℃、5％CO2下溫育66小時，再加入含氚胸腺嘧啶(1μCi/孔)。總共培養72小時後，收集細胞並測量增殖(胸腺嘧啶摻入)和上清中是否存在細胞因子。細胞因子檢測用抗細胞因子抗體通過特異性ELISA測定培養物上清中的細胞因子水平，測定下述細胞因子水平TNFα、TNFβ、幹擾素γ、IL-1β、IL-2。化學合成花生四烯酸-甘氨酸-OH將花生四烯酸(0.50g)溶於DMF(2.0ml)，並加入HOSu(0.38g於0.5mlDMF中)和H-Gly-OtBu.HCl(0.55g於1.5mlDMF中)，將混合物在冰浴中冷卻。加入DCC(0.41g於0.5mlDMF中)，再加入N-MM並將混合物在冰浴中攪拌30分鐘，然後在室溫攪拌20小時。反應未進行完全，約有20-3％花生四烯酸未反應。加入更多的DCC(0.16g)、HOSu(0.19g)、H-Gly-OtBu.HCl(0.20g)和N-MM(0.24g)並將混合物攪拌24小時。濾掉DCU，用製備HPLC分離產物並凍幹得到一種淺綠色油(0.67g，98％)。在冰浴中將花生四烯酸-Gly-OtBu重溶於純三氟乙酸(40ml)並攪拌30分鐘，然後在室溫繼續攪拌30分鐘。蒸發除去TFA得到花生四烯酸-Gly-OH，其為泥漿狀綠色油(0.53g)。用HPLC將其純化並凍幹得到淺黃色膠狀固體(0.23g，39％)。純化製備HPLC條件緩衝液A0.1％TFA/H2O，緩衝液B0.1％TFA/10％H2O/90％CH3CN。
40ml/min，214nm，C18 semiPrePak逐步增量％B10--20--30--40--50--60--70--80--90--100％B。
花生四烯酸在60％B處洗脫，在75-80％B處洗脫，花生四烯酸-Gly-OtBu在80-85％B處洗脫。
1、HPLC緩衝液0.1％TFA/10％H2O/90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPakisocratic組分的保留時間花生四烯酸Rt 4.14分鐘花生四烯酸-Gly-OHRt 2.78分鐘花生四烯酸-Gly-OtBuRt 5.23分鐘2、13C n.m.r.
花生四烯酸-Gly-OH_(DMSO-d6)14.1，C20，22.1，25.4，26.4，26.8，28.9，31.0，34.7，10×CH240.7，Ga；127.7，127.85，127.93，128.2，128.3，129.6，130.1，8×CH；171.5，C＝O，G172.5，C1.
3、FAB-MSm/z 362(M+1)4、胺基酸分析存在甘氨酸花生四烯酸-天冬氨酸-OH將花生四烯酸、HOSu和H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl一起溶於DMF(3ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入在DMF中的DCC(0.7ml)。加入N-MM並攪拌混合物20小時，約剩餘20％花生四烯酸。加入更多的HOSu(0.19g)、H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl(0.30g)、DCC(0.16g)和N-MM(0.24g)，繼續攪拌混合物20小時。濾掉DCU並用HPLC分離產物。純化的Ara-Asp(OtBu)-OtBu濃縮至油狀並加入TFA(25ml)。攪拌1小時後，蒸發除去TFA，得到暗綠色油。花生四烯酸-Asp-OH用HPLC純化，將純化的Ara-Asp-OH組分合併、濃縮並凍幹(於tBu-OH中)，得到棕色油(0.38g，55％)。純化HPLC純化緩衝液A0.1％TFA，緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18 SemiPrepPak％B的逐步增量10％--20--30--40--50--60--70--80--85--100％B。
花生四烯酸在70％B處洗脫。
花生四烯酸-Asp(OtBu)-OtBu在80％B處洗脫。
花生四烯酸-Asp-OH在60％B處洗脫。分析1、HPLC緩衝液0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPakisocratic保留時間花生四烯酸Rt 4.12分鐘花生四烯酸-Asp(OtBu)-OtBuRt 9.52分鐘花生四烯酸-Asp-OHRt 2.31分鐘2、13C n.m.r.
花生四烯酸-Asp-OH
_(DMSO-d6)14.1.CH3；22.1，25.4.26.4.26.8，28.9，31.0，31.5，34.8.10×CH2；34.4，？？；36.2，DB；48.7，Da67.1.？？；127.7，127.88，127.97，128.18，128.23.129.6，130.1，8×CH；171.6.D_；172.1，C＝O，Asp172.7，C＝O，花生四烯酸。
花生四烯酸_(DMSO-d6)14.1.CH3；22.2，24.6，25.4，26.3，26.8，26.9，28.9，31.1，33.3，10×CH2；127.7，127.9，128.0，128.2，128.3，128.4，129.3，130.1，8×CH；174.5，C＝O.
3、FAB-MS和CI-MSm/z 420(M+1)4、胺基酸分析存在天冬氨酸。二十碳五烯酸-甘氨酸-OH將二十碳五烯酸、H-Gly-(OtBu).HCl和HOSu一起溶於DMF(4ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入DCC(在1mlDMF中)。加入N-甲基嗎啉並在冰浴攪拌混合物20分鐘，然後室溫攪拌混合物20小時，約剩36％二十碳五烯酸未反應。加入更多的H-Gly-(OtBu).HCl(0.22g)、HOSu(0.15g)、DCC(0.16g)和N-MM(0.27g)，繼續攪拌混合物20小時。仍剩餘一些二十碳五烯酸(由HPLC測出約30％)，過濾混合物並用HPLC純化粗產物，得到Epe-Gly-OtBu，其為有色油(0.49g，71％)。將油重溶於冷三氟乙酸(30ml)並攪拌1小時，蒸發除去TFA，得到黑色油。粗Epe-Gly-OH用HPLC純化，得到0.13g(22％)棕色油。純化HPLC純化緩衝液A0.1％TFA/H2O
緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18 semiPrepPak％B的增量10--20--30--40--50--55-60--65--68--70％B。
二十碳五烯酸和Epe-Gly-OtBu在65-70％B處洗脫。能夠分離Epe-Gly-OH的一些純化組分。合併含該兩個化合物的組分並再純化。
在上述相同條件下，Epe-Gly-OH在60％B處洗脫。分析1、分析HPLC緩衝液0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPakisocratic反應組分的保留時間二十碳五烯酸Rt 3.1分鐘Epe-Gly-OtBuRt 3.9分鐘Epe-Gly-OHRt 2.1分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.3，CH3；20.2，25.4，26.4，34.8，CH2；40.7，Ga；127.2，127.9，128.1，128.2，128.3，129.7，131.8，CH；171.6，172.5，C＝O.
3、CI-MSm/z 360(M+1).二十碳五烯酸-天冬氨酸-OH將二十碳五烯酸、H-Asp(OtBu)-(OtBu).HCl和HOSu一起溶於DMF(4ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入DCC(在1mlDMF中)。加入N-甲基嗎啉並在冰浴攪拌混合物20分鐘，然後室溫攪拌混合物20小時，由HPLC測出約剩23％二十碳五烯酸。加入更多的H-Asp(OtBu)-(OtBu).HCl(0.28g)、HOSu(0.11g)、DCC(0.12g)和N-MM(0.20g)，繼續攪拌混合物20小時。仍剩餘約17％二十碳五烯酸，過濾混合物並用HPLC純化粗Epe-Asp(OtBu)-(OtBu)，得到0.83g棕色油。向棕色油中加入冷三氟乙酸(30ml)並攪拌混合物1小時，蒸發除去TFA，得到暗棕色油，將該暗棕色油重溶於CH3CN(10ml)並用HPLC純化，純的Epe-Asp-OH重量為0.50g(72％)。純化緩衝液A0.1％TFA/H2O緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18 semiprepPak％B的增量10％--20--30--40--50--52--55-57--60--65--68--70％B。
二十碳五烯酸65％B處洗脫，Epe-Asp(OtBu)-OtBu在70％B處洗脫，Epe-Asp-OH在55％B處洗脫。分析1、分析HPLC緩衝液0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak，isocratic保留時間二十碳五烯酸Rt 3.1分鐘Epe-Asp(OtBu)-OtBuRt 6.7分鐘Epe-Asp-OHRt 1.8分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.3，CH320.2，25.3，25.4，26.4，31.5，34.8，8×CH2；36.3，DB；48.7，Da；127.2，127.92，127.97，128.1，128.2，128.3，129.7，131.8，10×CH；171.9，172.1，172.7，3×C＝O.
3、CI-MSm/z 418(M+1).廿二碳六烯酸-甘氨酸-OH將H-Gly-(OtBu).HCl和HOSu一起溶於DMF(2ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入廿二碳六烯酸、DCC(在0.4mlDMF中)和N-甲基嗎啉，在冰浴攪拌混合物30分鐘，然後室溫攪拌混合物5小時，約剩30％廿二碳六烯酸(Dhe酸)。加入更多的DCC(0.11g)並繼續攪拌混合物20小時。仍剩餘約28％廿二碳六烯酸。過濾混合物並用HPLC純化粗產物，凍幹的Dhe-Gly-OtBu(淺黃色油)重0.62g(92％)。向油中加入冷TFA(30ml)並攪拌混合物1小時，蒸發除去TFA，得到暗棕色油，將該暗棕色油重溶於CH3CN(10ml)並用HPLC純化，將純化的Dhe-Gly-OH凍幹得到暗棕色油(0.27g，46％)。純化HPLC條件緩衝液A0.1％TFA/H2O緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18 semiprepPak％B的手工增量10％--20--30--40--50--55--60--65--70--73--100％B。
廿二碳六烯酸和Dhe-Gly-OtBu均在71-73％B處洗脫，酸比Dhe-Gly-OtBu洗脫的略早。
Dhe-Gly-OH在60％B處洗脫。分析1、分析HPLC緩衝液0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak反應組分的保留時間廿二碳六烯酸Rt 3.6分鐘Dhe-Gly-OtBuRt 4.5分鐘Dhe-Gly-OHRt 2.5分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.3，CH3；20.2，23.2，25.3，25.36，25.42，35.1，8×CH20.8，Ga；127.1，127.90，127.98，128.06，128.1，128.27，128.3，129.1，131.8，6×CH；171.5，172.0，2×C＝O.
3、CI-MSm/z 386(M+1).廿二碳六烯酸-天冬氨酸-OH將H-Asp(OtBu)-(OtBu).HCl和HOSu一起溶於DMF(2ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入廿二碳六烯酸、DCC(在0.4mlDMF中)和N-甲基嗎啉，在冰浴攪拌混合物30分鐘，然後室溫攪拌混合物4小時，約剩30％廿二碳六烯酸(Dhe酸)。加入更多的DCC(0.11g)並繼續攪拌混合物20小時。仍剩餘約18％廿二碳六烯酸。過濾混合物並用HPLC純化粗產物，凍幹的Dhe-Asp(OtBu)-OtBu(淺黃色油)重0.73g(86％)。向油中加入冷TFA(30ml)並攪拌混合物1小時，蒸發除去TFA，得到暗棕色油，將該暗棕色油重溶於CH3CN(5ml)並用HPLC純化，將純化的Dhe-Gly-OH凍幹得到暗棕色油(0.33g，49％)。純化HPLC條件緩衝液A0.1％TFA/H2O緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18 semiprepPak％B的手工增量10％--20--30--40--50--55--60--65--68--70--73--75％B。
廿二碳六烯酸在73％B處洗脫，Dhe-Asp(OtBu)-OtBu在73-75％B處洗脫，Dhe-Asp-OH在58％B處洗脫。分析1、分析HPLC緩衝液0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak反應組分的保留時間廿二碳六烯酸Rt 3.6分鐘Dhe-Asp(OtBu)-OtBuRt 8.2分鐘Dhe-Asp-OHRt2.0分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.3.CH320.2，23.2，25.3，25.4，25.4，35.0，8×CH236.4，DB48.7，Da；127.1，127.9，127.98，128.0，128.1，128.22，128.28，128.3，129.0，131.8，CH171.6，171.8，172.7，3×C＝O3、CI-MSm/z 444(M+1).亞麻酸-甘氨酸-OH將亞麻酸、HOSu和H-Gly-(OtBu).HCl一起溶於DMF(3ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入DCC(在0.3mlDMF中)。加入N-甲基嗎啉並攪拌混合物20小時，此時還剩一些未反應的亞麻酸。加入更多的DCC(0.10g)並繼續攪拌混合物20小時。濾掉DCU並用逆相HPLC分離產物，純化的產物濃縮成油並加入TFA(30ml)，攪拌1小時後，蒸發除去TFA，得到的產物為棕色油。將該棕色油重溶於CH3CN(6ml)並用HPLC純化，將得到的純化組分合併、濃縮並凍幹(在叔丁醇中)，得到棕色油(0.24g，40％)。純化HPLC純化緩衝液A0.1％TFA/H2O
緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18小製備柱Lino-Gly-OH在65％B處洗脫，亞麻酸在67％B處洗脫，亞麻酸-Gly-OtBu也在67％B處洗脫，但稍晚。分析和定性1、分析HPLC緩衝液A0.1％TFA，緩衝液B0.1％TFA/10％H2O/90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak100％B isocratic各成分的保留時間亞麻酸Rt 3.96分鐘亞麻酸-Gly-OtBuRt 4.63分鐘亞麻酸-Gly-OHRt 2.59分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.2，CH320.2，25.26，25.32，26.8，28.7，28.8，29.2，35.2.CH240.7，Ga127.1，127.7，128.1，130.1，131.7，CH171.6，172.7，C＝O.
3、C.I.-M.S.
m/z 336(M+1).亞麻酸-天冬氨酸-OH將亞麻酸、HOSu和H-Asp(OtBu)-(OtBu).HCl一起溶於DMF(3ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入DCC(在0.3mlDMF中)。加入N-MM並攪拌混合物20小時，此時還剩一些未反應的亞麻酸。加入更多的DCC(0.10g)並繼續攪拌混合物20小時。濾掉DCU並用逆相HPLC分離產物，純化的產物濃縮成油(0.66g)並加入TFA(30ml)，攪拌1小時後，蒸發除去TFA，得到的產物為棕色油。將該棕色油重溶於CH3CN(6ml)並用HPLC純化，將得到的純化組分合併、濃縮並凍幹(在叔丁醇中)，得到棕色油(0.38g，54％)。純化HPLC純化緩衝液A0.1％TFA/H2O緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18小製備柱Lino-Asp-OH在55％B處洗脫，亞麻酸在65％B處洗脫，亞麻酸-Asp(OtBu)-OtBu在70％B處洗脫。分析和定性1、分析HPLC緩衝液A0.1％TFA，緩衝液B0.1％TFA/10％H2O/90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak100％B isocratic各成分的保留時間亞麻酸Rt 4.14分鐘亞麻酸-Asp(OtBu)-OtBuRt 8.46分鐘亞麻酸-Asp-OHRt 2.04分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.2，CH3；20.2，25.26，25.34，26.8，28.69，28.72，28.83，29.2，35.2，CH2；36.3，DB；48.7，Da；127.1，127.7，128.1，130.1，131.7，CH；171.8，172.2，172.7，C＝O.
3、C.I.-M.S.
m/z 394(M+1).γ-亞麻酸-甘氨酸-OH
將γ-亞麻酸、HOSu和H-Gly-(OtBu).HCl一起溶於DMF(3ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入DCC(在0.3mlDMF中)。加入N-MM並攪拌混合物20小時，此時還剩一些未反應的亞麻酸。加入更多的DCC(0.10g)並繼續攪拌混合物20小時。濾掉DCU並用逆相HPLC分離產物，純化的產物濃縮成油(0.46g)並加入TFA(30ml)，攪拌1小時後，蒸發除去TFA，得到的產物為棕色油。將該棕色油重溶於CH3CN(6ml)並用HPLC純化，將得到的純化組分合併、濃縮並凍幹(在叔丁醇中)，得到棕色油(0.35g，58％)。純化HPLC純化緩衝液A0.1％TFA/H2O緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18小製備柱γ-Lino-Gly-OH在66％B處洗脫，γ-亞麻酸在66％B處洗脫，γ-亞麻酸-Gly-OtBu在67％B處洗脫，化合物以所列順序洗脫。分析和定性1、分析HPLC緩衝液A0.1％TFA，緩衝液B0.1％TFA/10％H2O/90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak100％B isocratic各成分的保留時間γ-亞麻酸Rt 4.07分鐘γ-亞麻酸-Gly-OtBuRt 4.85分鐘γ-亞麻酸-Gly-OHRt 2.82分鐘2、13C n.m.r
(DMSO-d6)14.1，CH3；22.2，25.0，25.4，26.7，26.8，28.8，28.9，31.1，35.1，CH2；40.7，Ga；127.7，127.9，128.1，128.2，129.9，130.1，CH；171.6，172.6.C＝O.
3、C.I.-M.S.
m/z 336(M+1).γ-亞麻酸-天冬氨酸-OH將γ-亞麻酸、HOSu和H-Asp(OtBu)-(OtBu).HCl一起溶於DMF(3ml)中，將混合物在冰浴中冷卻並加入DCC(在0.3mlDMF中)。加入N-MM並攪拌混合物20小時，此時還剩一些未反應的亞麻酸。加入更多的DCC(0.10g)並繼續攪拌混合物20小時。濾掉DCU並用逆相HPLC分離產物，純化的產物濃縮成油(0.65g)並加入TFA(30ml)，攪拌1小時後，蒸發除去TFA，得到的產物為棕色油。將該棕色油重溶於CH3CN(6ml)並用HPLC純化，將得到的純化組分合併、濃縮並凍幹(在叔丁醇中)，得到棕色油(0.30g，42％)。純化HPLC純化緩衝液A0.1％TFA/H2O緩衝液B0.1％TFA+10％H2O+90％CH3CN40ml/min，214nm，C18小製備柱γ-亞麻酸-Asp-OH在50％B處洗脫，亞麻酸在70％B處洗脫，亞麻酸-Asp(OtBu)-OtBu在75％B處洗脫。分析和定性1、分析HPLC緩衝液A0.1％TFA，緩衝液B0.1％TFA/10％H2O/90％CH3CN2ml/min，214nm，C18 NovaPak100％Bisocratic
各成分的保留時間γ-亞麻酸Rt 4.14分鐘γ-亞麻酸-Asp(OtBu)-OtBuRt 8.71分鐘γ-亞麻酸-Asp-OHRt 2.28分鐘2、13C n.m.r.
(DMSO-d6)14.1，CH3；22.2.25.1，25.4，26.7，26.8，28.7，28.9，31.08，35.1.CH236.3，DB48.7，Da127.8，127.9，128.1.128.2，130.0，130.1，CH；171.9，172.2，172.7，C＝O.
3、C.I.-M.S.
m/z 394(M+1).
應理解的是在不超出所述的本發明的實質或範圍的情況下，本領域熟練技術人員可以對具體實施方案中所述的本發明作出各種變動和/或改進，因此，本發明的實施方案應理解為示意性而非限制性。
表1胺基酸偶聯的PUFA對抗氯喹的惡性瘧原蟲K株的抑制作用
所有PUFA均為11μM表2胺基酸偶聯的PUFA對PHA刺激的TNFα和幹擾素γ的產生的作用
所有PUFA均為20μM
表3PUFA對PHA誘導的細胞增殖的作用
>所有PUFA均為20μM
權利要求
1.具有抗瘧和/或刺激嗜中性白細胞活性或者抗炎活性的多不飽和脂肪酸化合物，所述的多不飽和脂肪酸含有一16-26個碳原子鏈，3-6個雙鍵，其中所述的多不飽和脂肪酸在羧酸基團與一胺基酸共價偶聯。
2.權利要求1所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸含18-22個碳原子。
3.權利要求1或2所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中胺基酸是甘氨酸或天冬氨酸。
4.權利要求1-3任一項所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸是一種n-3至n-6化合物。
5.權利要求1-4任一項所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸是γ-亞麻酸。
6.權利要求1-4任一項所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸是α-亞麻酸。
7.權利要求1-4任一項所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸是花生四烯酸。
8.權利要求1-4任一項所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸是二十碳五烯酸。
9.權利要求1-4任一項所述的多不飽和脂肪酸化合物，其中脂肪酸是廿二碳六烯酸。
全文摘要
本發明提供了具有抗瘧和/或刺激嗜中性白細胞活性或者抗炎活性的多不飽和脂肪酸化合物。所述的多不飽和脂肪酸含有一16-26個碳原子鏈，3-6個雙鍵並在羧酸基團與一胺基酸共價偶聯。優選的是脂肪酸含有18-22個碳原子，胺基酸是甘氨酸或天冬氨酸。優選的化合物是γ-亞麻酸-甘氨酸，α-亞麻酸-甘氨酸，花生四烯酸-甘氨酸，廿二碳六烯酸-甘氨酸，二十碳五烯酸甘氨酸，γ-亞麻酸-天冬氨酸，α-亞麻酸-天冬氨酸，花生四烯酸-天冬氨酸，二十碳五烯酸-天冬氨酸和廿二碳六烯酸-天冬氨酸。
文檔編號C07C233/49GK1167481SQ95195864
公開日1997年12月10日 申請日期1995年10月25日 優先權日1994年10月26日
發明者弗雷德·威德默, 保羅·亞當·肖伯, 瑪麗琳·喬伊·斯萊, 安東尼奧·費蘭特, 阿爾弗雷德·普洛斯, 德博拉·安·拉特延 申請人:肽技術有限公司, 阿德萊德婦幼醫院, 瑪麗琳·喬伊·斯萊