枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法

2023-04-25 08:40:46 2

枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，首先進行幹擾試驗，確定使用何種靈敏度的鱟試劑對枸櫞酸原料進行細菌內毒素檢查；然後將待測的枸櫞酸原料稀釋配製成待測溶液，加入上述幹擾試驗中確定的鱟試劑，進行細菌內毒素檢測。本發明的枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，解決了新開發注射液產品中枸櫞酸原料的細菌內毒素檢查問題；從源頭上對無菌產品質量進行控制，對保證輸液產品的安全性有重要意義。該方法有生物化學的理論基礎，更科學；利用酶的分子生化反應，專屬性高，重現性強，準確度和靈敏度高；操作簡單快速，無需特殊儀器設備，實用性強。
【專利說明】枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物檢測【技術領域】，涉及一種枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方 法。

【背景技術】
[0002] 輸液產品是醫院日常的必備基礎藥品。目前國內輸液市場正處於價格戰，產品的 升級換代是關鍵，產品升級換代必然要對其使用的原料進行嚴格的控制，以保證產品質量。 細菌內毒素是控制項目之一。
[0003] 細菌內毒素是熱原的主要代表物質。熱原注入人體後產生熱原反應。熱原反應給 臨床治療帶來極大的危害，一般熱原進入人體後數分鐘至1小時內，即會出現高熱症狀，反 應嚴重者會造成死亡，故必須嚴格控制。
[0004] 傳統的熱原檢查通常是在動物體內進行實驗，實驗過程複雜繁瑣，且存在個異性， 不宜普遍推廣。現在，醫藥工業普遍接受控制細菌內毒素等於控制熱原。細菌內毒素檢查 法通常採用凝膠法，其原理是：細菌內毒素會激活凝固酶，形成凝膠反應。這種檢測方法更 科學，更準確。
[0005] 枸櫞酸作為一種新的藥品原料，採用傳統的檢測方法不能準確地檢查出樣品中的 細菌內毒素含量。


【發明內容】

[0006] 本發明為了解決上述技術問題，提供一種枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法。
[0007] 本發明為解決這一問題所採取的技術方案是： 本發明的枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，包括如下步驟：首先選取L < 0. 25EU/ mg作為枸櫞酸原料的細菌內毒素限值，進行幹擾試驗，確定使用何種靈敏度的鱟試劑對枸 櫞酸原料進行細菌內毒素檢查；然後將待測的枸櫞酸原料稀釋配製成待測溶液，最大有效 稀釋倍數MVD=20,加入上述幹擾試驗中確定的鱟試劑，在37土 1°C的溫度下反應60±2分 鍾，而後緩緩倒轉180°觀察管內凝膠情況，管內凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；管 內凝膠不能保持完整從管壁滑脫者為陰性； 當鱟試劑，供試品的配方，生產工藝改變或試驗環境發生變化時，須重新進行幹擾試 驗。
[0008] 幹擾試驗的具體步驟如下： 步驟一、供試品溶液的製備 取枸櫞酸原料50mg加入到試管中，加入10ml細菌內毒素檢查用水，震蕩，使原料充 分溶解，即為樣品溶液；用細菌內毒素檢查用水將樣品溶液稀釋10倍，生成S1(l溶液；再用 Na2HP04溶液將S1(l溶液稀釋2倍，生成S2(l溶液；稀釋後的S 2(l溶液作為供試品溶液，即溶液 A； 步驟二、三組對照溶液的製備 將供試品溶液與細菌內毒素標準品製成分別含細菌內毒素濃度2.0 λ、1. Ο λ、〇. 5 λ 和0. 25 λ的內毒素溶液，作為溶液Β ;每一濃度平行各做4支； 用細菌內毒素檢查用水與細菌內毒素標準品製成分別含細菌內毒素濃度2. 〇λ、 1. 0 λ、〇. 5 λ和〇. 25 λ的內毒素溶液，作為溶液c ;每一濃度平行各做4支； 取細菌內毒素檢查用水，作為溶液D ; 步驟三、細菌內毒素檢測 向盛裝有上述四組溶液的各個試管中加入一定靈敏度的鱟試劑，輕輕混勻後，垂直放 入37±1°C試管恆溫儀中，保溫60±2分鐘；將試管從恆溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉180°， 觀察並記錄各個試管的細菌內毒素檢測結果； 步驟四、統計分析 當溶液A和溶液D所有試管均為陰性；溶液B和溶液C中的最大濃度2.0 λ管均 為陽性，最低濃度的〇.25λ管均為陰性時，試驗結果有效；按統計學方法分別計算溶 液C的反應終點濃度的幾何平均值Es和溶液Β的反應終點濃度的幾何平均值Et ;當 0· 5 λ彡Es彡2. 0 λ、且〇· 5Es彡Et彡2. OEs時，則試驗有效，認為供試品在該濃度下不存 在幹擾作用，確定該靈敏度的鱟試劑；如Et不在此規定範圍內，則應重新更換靈敏度更高 的鱟試劑重複進行以上試驗內容。
[0009] 本發明具有的優點和積極效果是： 本發明的枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，解決了新開發注射液產品中枸櫞酸原 料的細菌內毒素檢查問題；從源頭上對無菌產品質量進行控制，對保證輸液產品的安全性 有重要意義。該方法有生物化學的理論基礎，更科學；利用酶的分子生化反應，專屬性高，重 現性強，準確度和靈敏度高；操作簡單快速，無需特殊儀器設備，實用性強。

【具體實施方式】
[0010] 以下參照具體實施例對本發明的枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法進行詳細 的說明。
[0011] 本發明的枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，包括如下步驟：首先進行幹擾試 驗，確定使用何種靈敏度的鱟試劑對枸櫞酸原料進行細菌內毒素檢查；然後將待測的枸櫞 酸原料稀釋配製成待測溶液，最大有效稀釋倍數MVD=20,加入上述幹擾試驗中確定的鱟試 齊IJ，在37± 1°C的溫度下反應60±2分鐘，而後緩緩倒轉180°觀察管內凝膠情況，管內凝膠 不變形、不從管壁滑脫者為陽性；管內凝膠不能保持完整從管壁滑脫者為陰性； 當鱟試劑，供試品的配方，生產工藝改變或試驗環境發生變化時，須重新進行幹擾試 驗。
[0012] 幹擾試驗的具體步驟如下： 步驟一、供試品溶液的製備 取枸櫞酸原料50mg加入到試管中，加入10ml細菌內毒素檢查用水，震蕩，使原料充 分溶解，即為樣品溶液；用細菌內毒素檢查用水將樣品溶液稀釋10倍，生成S1(l溶液；再用 Na2HP04溶液將S1(l溶液稀釋2倍，生成S2(l溶液；稀釋後的S 2(l溶液作為供試品溶液，即溶液 A； 步驟二、三組對照溶液的製備 將供試品溶液與細菌內毒素標準品製成分別含細菌內毒素濃度2.0 λ、1. Ο λ、〇. 5 λ 和0. 25 λ的內毒素溶液，作為溶液Β ;每一濃度平行各做4支； 用細菌內毒素檢查用水與細菌內毒素標準品製成分別含細菌內毒素濃度2. 〇λ、 1. 0 λ、〇. 5 λ和〇. 25 λ的內毒素溶液，作為溶液c ;每一濃度平行各做4支； 取細菌內毒素檢查用水，作為溶液D ; 步驟三、細菌內毒素檢測 向盛裝有上述四組溶液的各個試管中加入一定靈敏度的鱟試劑，輕輕混勻後，垂直放 入37±1°C試管恆溫儀中，保溫60±2分鐘；將試管從恆溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉180°， 觀察並記錄各個試管的細菌內毒素檢測結果； 步驟四、統計分析 當溶液A和溶液D所有試管均為陰性；溶液B和溶液C中的最大濃度2.0 λ管均 為陽性，最低濃度的〇.25λ管均為陰性時，試驗結果有效；按統計學方法分別計算溶 液C的反應終點濃度的幾何平均值Es和溶液Β的反應終點濃度的幾何平均值Et ;當 0· 5 λ彡Es彡2. 0 λ、且〇· 5Es彡Et彡2. OEs時，則試驗有效，認為供試品在該濃度下不存 在幹擾作用，確定該靈敏度的鱟試劑；如Et不在此規定範圍內，則應重新更換靈敏度更高 的鱟試劑重複進行以上試驗內容。
[0013] 實施例1 目前，原料的細菌內毒素檢查主要是參考《中國藥典》的標準進行，當《中國藥典》中未 收載該原料的細菌內毒素檢測標準時，可參考其它國家等法定藥典標準或相關文獻，《中國 藥典》中並未收載枸櫞酸原料。《英國藥典》中枸櫞酸原料的細菌內毒素限值：L < 0. 5EU/ mg。建立枸櫞酸原料的內控標準，將細菌內毒素限值分別設定為L < 0. 25EU/mg和L < 0. 125EU/mg，對比試驗結果。
[0014] 由於枸櫞酸偏酸性，需使用無熱原碳酸鈉減弱其酸性使其供試品溶液pH值在 6. 0-8. 0之間，以滿足細菌內毒素檢查法要求。考慮到無熱原碳酸鈉可能會影響試驗結果， 選取NA2HP04與無熱原碳酸鈉同時進行試驗，對比試驗結果。Na 2HP04溶液主要是調節供試 液的酸鹼度。
[0015] 依據以上兩點，進行細菌內毒素初篩試驗，對比無熱原碳酸鈉和NA2HP04的試驗 效果。
[0016] 分別使用Na2HP04溶液、無熱原碳酸鈉減弱供試液的酸性，細菌內毒素限值分別設 定為L < 0. 25EU/mg和L < 0. 125EU/mg進行初篩試驗。初篩試驗結果如表1所示。
[0017] 表1初篩試驗結果

【權利要求】
1. 一種枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟：首 先選取L < 0. 25EU/mg作為枸櫞酸原料的細菌內毒素限值進行幹擾試驗，確定使用何種靈 敏度的鱟試劑對枸櫞酸原料進行細菌內毒素檢查；然後將待測的枸櫞酸原料稀釋配製成待 測溶液，最大有效稀釋倍數MVD=20,加入上述幹擾試驗中確定的鱟試劑，在37土 1°C的溫度 下反應60±2分鐘，而後緩緩倒轉180°觀察管內凝膠情況，管內凝膠不變形、不從管壁滑 脫者為陽性；管內凝膠不能保持完整從管壁滑脫者為陰性； 當鱟試劑，供試品的配方，生產工藝改變或試驗環境發生變化時，須重新進行幹擾試 驗。
2. 根據權利要求1所述的枸櫞酸原料中細菌內毒素的檢測方法，其特徵在於，幹擾試 驗的具體步驟如下： 步驟一、供試品溶液的製備 取枸櫞酸原料50mg加入到試管中，加入10ml細菌內毒素檢查用水，震蕩，使原料充 分溶解，即為樣品溶液；用細菌內毒素檢查用水將樣品溶液稀釋10倍，生成S1(l溶液；再用 Na2HP04溶液將S1(l溶液稀釋2倍，生成S2(l溶液；稀釋後的S 2(l溶液作為供試品溶液，即溶液 A； 步驟二、三組對照溶液的製備 將供試品溶液與細菌內毒素標準品製成分別含細菌內毒素濃度2.0 λ、1.〇 λ、〇. 5 λ 和0. 25 λ的內毒素溶液，作為溶液Β ;每一濃度平行各做4支； 用細菌內毒素檢查用水與細菌內毒素標準品製成分別含細菌內毒素濃度2. 〇λ、 1. 0 λ、〇. 5 λ和〇. 25 λ的內毒素溶液，作為溶液c ;每一濃度平行各做4支； 取細菌內毒素檢查用水，作為溶液D ; 步驟三、細菌內毒素檢測 向盛裝有上述四組溶液的各個試管中加入一定靈敏度的鱟試劑，輕輕混勻後，垂直放 入37土1°C試管恆溫儀中，保溫60±2分鐘；將試管從恆溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉180°， 觀察並記錄各個試管的細菌內毒素檢測結果； 步驟四、統計分析 當溶液A和溶液D所有試管均為陰性；溶液B和溶液C中的最大濃度2.0 λ管均 為陽性，最低濃度的〇.25λ管均為陰性時，試驗結果有效；按統計學方法分別計算溶 液C的反應終點濃度的幾何平均值Es和溶液Β的反應終點濃度的幾何平均值Et ;當 0· 5 λ彡Es彡2. 0 λ、且〇· 5Es彡Et彡2. OEs時，則試驗有效，認為供試品在該濃度下不存 在幹擾作用，確定該靈敏度的鱟試劑；如Et不在此規定範圍內，則應重新更換靈敏度更高 的鱟試劑重複進行以上試驗內容。
【文檔編號】C12Q1/56GK104232739SQ201410403423
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】陳瑩, 孫毅, 金麗, 武曉飛 申請人:中國大冢製藥有限公司