一種添加還原型穀胱甘肽提升酮古龍酸菌產2-酮基-l-古龍酸生產強度的方法
2023-04-25 22:44:31
專利名稱：一種添加還原型穀胱甘肽提升酮古龍酸菌產2-酮基-l-古龍酸生產強度的方法
技術領域：
一種添加還原型穀胱甘肽提升酮古龍酸菌產2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法， 屬於發酵製備維生素C技術領域。
背景技術：
維生素C(即L-抗壞血酸)是人體必需的一種水溶性維生素，動物體內不能自身合成，一般通過食用水果蔬菜獲得。維生素C在食品、醫藥、化工、化妝品、飼料等行業應用廣泛。其應用範圍在不斷拓展，隨著人們對營養保健的關注，維生素C的需求將會不斷擴大。目前，我國生產維生素C的方法基本沿用了 60年代尹光琳等人發明的「二步發酵法」，第一步發酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉化為L-山梨糖，第二步發酵為大小菌混菌發酵，即使用俗稱大菌的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和俗稱小菌的酮古龍酸菌 (Ketogulonigenium vulgare)混合菌系發酵，將山梨糖轉化為維生素C的前體物2-酮基-L-古龍酸，第一步反應技術相對成熟，轉化率高，而第二步由於涉及混菌混合發酵，一直是維生素C生產領域的難題。隨著維生素C發酵行業競爭越來越激烈，發酵工藝的優化、資源的合理利用的要求不斷提高。減少發酵過程環境的汙染、提高原料的利用率，提高生產強度等等技術要求是今後生產發展的趨勢。維生素C發酵第二步中糖酸轉化率已經很高，一般都有90%以上，所以優化的重點就是縮短發酵周期，提高發酵生產強度。本專利就是基於這點，通過向發酵培養基中添加還原型穀胱甘肽提升酮古龍酸菌產2-酮基-L-古龍酸的生產強度。穀胱甘肽(glutathione)是一種自然界廣泛存在、同時具有Y -穀氨醯基和巰基的活性三肽，在生物體內有多種重要的生理功能，特別是具有抵抗滲透壓和維持體內正常的氧化還原環境的能力。目前，添加穀胱甘肽旨在促進混菌體系更好的適應發酵環境，提高菌體特別是酮古龍酸菌生物量，從而縮短發酵周期，提高發酵生產強度。
發明內容
本發明的目的是添加還原型穀胱甘肽促進菌體生長，縮短發酵周期和產量，從而提高產2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法。1.菌株酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM 4025 及巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC 21916，由江山製藥有限公司(靖江)提供。2.培養基和培養方法種子培養基(g/L) =L-山梨糖20，玉米漿1. 5，牛肉膏3，酵母浸出物3，大豆蛋白腖 10，磷酸二氫鉀1，無水硫酸鎂0. 2，尿素1，碳酸鈣1。發酵培養基(g/L) :L-山梨糖80，玉米漿5，尿素12，磷酸二氫鉀1，無水硫酸鎂
30. 1，碳酸鈣5，其中碳酸鈣、L-山梨糖和氮源分別單獨滅菌，接種時添加，還原型穀胱甘肽用超純水配製，0. 22 μ m過濾除菌，接種時添加。培養基都由自來水配製，用氫氧化鈉調節pH到6. 7-7. 0，滅菌121°C，15min。3.大菌和小菌混合培養方法用接種環挑取平板上的小菌兩環，再挑取大菌一環製成混菌懸液，取混菌懸液塗斜面，30°C培養48h ；取斜面混合菌活化後菌液0. 4mL接種種子培養基75mL/750mL搖瓶中。 30°C，200rpm下培養18h，即製成大小菌混菌混合菌系，接入甘油管中進行保藏。4.培養方法從冷凍甘油管中取混菌保藏培養物種液IOmL接入發酵培養基(75mL/750mL搖瓶)，30°C，200rpm培養，定期取樣測定參數。5.分析方法菌體濃度測定取適量的菌懸液置於IOmL容量瓶中，加入適量的4mol/L鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，再加入去離子水定容至10mL，搖勻，用UV7500型可見光分光光度計，於 660nm處比色測OD值。2-KLG與L-山梨糖含量測定採用高效液相色譜(HPLC)測定。色譜柱=Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流動相0. 005mol/L H2S04,流速0. 5mL/min,柱溫；35 °C，進樣量 5 μ L，檢測器示差折光檢測器。本發明的有益效果在發酵培養基中添加lg/L的還原型穀胱甘肽，與對照組相比較，發酵周期縮短了 11.8% (60h)，2-KLG產量提高了 5.07% (66. 3g)，生產強度提高了 27. 6% (1. llg(L · h)-1)。
圖1，為添加lg/L GSH對混合菌系生長的影響，圖例■未添加GSH ;〇添加Ig/ L 的 GSH。圖2，為添加lg/L GSH對混合菌系發酵產2_酮基-L-古龍酸的影響，圖例■未添加 GSH5O 添加 lg/L GSH。
具體實施例方式對照實施例本發明所用的菌種為酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus meegaterium)混合菌系。從冷凍甘油管中取混菌保藏培養物 0. 3mL接入種子培養基(75mL/750mL搖瓶)，30°C，200rpm培養。正常發酵2-KLG終產量為 63. lg/L，發酵周期為68h，生產強度為0. 87g(L · h)-1。實施例1 在發酵培養基中添加lg/L的還原型穀胱甘肽(GSH)，接種時添加，其餘條件同對照實施例。添加實驗組發酵周期60h，相比對照組縮短他；2-KLG產量為66. 3g/L， 提高了 5. 07% ；生產強度為1. IKgO^hr1),提高了 27.6%。
權利要求
1. 一種添加還原型穀胱甘肽提升酮古龍酸菌產2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法， 其特徵為利用酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的混合菌係為生產菌株，發酵生產維生素C前體物質2-酮基-L-古龍酸，通過向發酵培養基中添加lg/L的穀胱甘肽，促進混菌菌體生長，主要促進小菌生物量提高和 2-酮基-L-古龍酸生產，提升生產強度，實現2-酮基-L-古龍酸高效生產。
全文摘要
本發明闡述了一種添加還原型穀胱甘肽(GSH)提升酮古龍酸菌產2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法，屬於維生素C發酵生產領域。本發明利用酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)混合菌係為生產菌株，通過向發酵培養基中添加1g/L的還原型穀胱甘肽，促進混菌體的生產，提高生物量，縮短發酵周期，提高生產強度，實現2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的高效生產。添加1g/L GSH條件下，發酵周期為60h，2-KLG產量為66.3g/L，生產強度為1.11(g(L·h)-1)，與對照組相比發酵周期縮短了11.8％，2-KLG產量和生產強度分別提高了5.07％和27.6％。
文檔編號C12R1/11GK102424830SQ20111041927
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者劉立明, 陳堅, 黃政 申請人:江南大學