一種可產生o態和p態的細菌視紫紅質薄膜的製備方法
2023-04-26 01:40:41 1
專利名稱：一種可產生o態和p態的細菌視紫紅質薄膜的製備方法
技術領域：
本發明屬於有機材料領域，特別涉及具有o態和P態的細菌視紫紅質-明膠或聚乙烯醇(簡稱PVA)薄膜的製備。
技術背景細菌視紫紅質(bateriorhodopsin， BR)是嗜鹽菌紫膜中的唯一蛋白質成分。 它具有極好的穩定性和獨特的光致變色性能，是目前國內外普遍認為最有希望的生物分子仿生視覺功能材料，在分子電子學和生物電子技術領域具有廣泛的潛在 應用價值，可應用於全息記錄、投影顯示、三維光學存諸器等許多方面。細菌視 紫紅質應用的基礎是獲得穩定的中間態，如1. Birge, R. R.; Gillespie, N. B.; Izaguirre, E. W. et al. Biomolecular Electronics: Protein-Based Associative Processors and Volumetric Memories, /屍&j. c/zem. 5 1999， 10746—10766.2. Hampp， N. Bacteriorhodopsin as a Photochromic Retinal Protein for Optical Memories, CAew.及ev. 2000, 1755—1776.3. Lanyi, J. K. Progress toward an explicit mechanistic model for the lightdriven pump, bacteriorhodopsin, FEBS Lett. 1999, 4"， 103—107.BR在存儲方面的應用是以薄膜的形式加以實現的，且薄膜的質量直接影響 存儲器的性能，因此BR薄膜的製備方法是目前研究中的一個重要課題，關鍵技術 尚處於保密階段。 發明內容本發明的目的是提供一種能夠產生O態和P態的細菌視紫紅質-明膠或PVA 薄膜的製備方法，利用明膠或PVA作為聚合物載體製備可以產生O態和P態的 細菌視紫紅質薄膜。一種可產生O態和P態的細菌視紫紅質薄膜的製備方法，其特徵是選用 分子量在30,000 ~ 70,000的分析純明膠(或分子量在22,000 ~ 26,000的分析純 PVA)作為高分子成膜載體，將明膠或PVA溶解於Tris(trismethylaminomethane) 或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液中得到明膠或PVA溶液，再將野生型細菌視紫紅質 (BR)的懸浮液與明膠或PVA溶液充分混合，得到均勻的混合物。將此混合物鋪展於石英或K7光學玻璃表面，經成膜乾燥，得到表面光潔平整、BR分布均 勻、各處光密度均勻的細菌視紫紅質-明膠或PVA薄膜。所述的石英或K7光學玻璃必須經表面親水處理。方法是將清洗乾淨的石英 或K7光學玻璃浸泡於飽和的KOH甲醇或異丙醇溶液中，然後用二次蒸餾水衝 洗，再依次用丙酮、乙醇和二次蒸餾水超聲清洗，得到表面親水的石英或K7光 學玻璃。所述的均勻混合物是將經超聲破碎的野生型BR懸浮液與經Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝的明膠或PVA溶液以體積比為3:2 ~ 5:3的比例混合而得到的混合 液，破碎的野生型BR懸浮液碎片直徑在200nm以下，BR懸浮液的濃度為10 ~ 28 mg丄"；Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液的濃度為20 ~ 50 mmohl/1;明膠或PVA 與Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液的重量/體積百分比為4 ~ 20%。由BR、 Tris或磷酸鹽-擰檬酸、明膠或PVA組成的混合液體，pH值在4.0 ~ 8.5範圍內。所述的成膜是將BR、 Tris或磷酸鹽-檸檬酸、明膠或PVA的混合物經超聲 處理，用3 5nm的濾膜過濾，除去殘留的大顆粒和氣泡；過濾後的混合液在 室溫下靜置10 30min，使細小的氣泡浮於表面，將氣泡刮去。將除去氣泡的混 合液倒在水平放置的石英或K7光學玻璃表面鋪展，在溫度為4 ~ 15 'C、溼度為 40~80%的條件下，靜置乾燥12 48h，得到表面光潔平整、BR分布均勻、各 處光密度均勻的細菌視紫紅質-明膠或PVA薄膜。本發明的最大特點是可以具有較大光密度(D = 1.0 ~ 2.5)，表面平整、BR 分散均勻的可以產生0態和P態的BR-明膠或PVA薄膜。薄膜的光密度和厚度 可以通過改變BR懸浮液和明膠或PVA-Tris (或磷酸鹽-檸檬酸)溶液的用量來 調節，產生0態和P態所需的pH值通過採用pH值不同的Tris或磷酸鹽-檸檬 酸緩衝液來實現。這種表面光潔平整、BR分散均勻、各處光密度均勻的BR-明膠或BR-PVA 薄膜，可以應用於空間光調製器、全息記錄、模式識別和信息存儲等領域，在 很大程度上拓寬了 BR材料的應用範圍。
圖1.本發明實施例1的薄膜照片；圖2.本發明實施例3、 4中BR-明膠薄膜0態和P態的產生。
具體實施方式
本發明主要包括石英片或K7玻璃片表面的親水化處理、明膠或PVA-Tris (或磷酸鹽-檸檬酸)溶液與BR懸浮液溶液的充分混合、混合懸浮液在適當溫 度和溼度條件下乾燥成膜等幾個步驟。 具體實施步驟為(1) 石英片或K7玻璃片表面的親水化處理本發明人選用厚度為1 ~ 2 mm，直徑20 mm,表面精度X/2的石英片或K7 玻璃片作為基底製備BR薄膜。首先將其表面處理成親水性，以利於薄膜更好地 附著在其表面。處理過程如下a.將清洗乾淨的石英片或K7玻璃片放入飽和 KOH的甲醇溶液中浸泡24h; b.用二次水衝洗後，依次在丙酮、乙醇和二次水 中超聲清洗15 20min;c.經過上述處理的石英片或K7玻璃片放入異丙醇中保 存備用，此時的石英片或K7玻璃片表面呈親水性。(2) 明膠或PVA溶解於Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液選用分子量為30,000 ~ 70,000的分析純明膠(gelatin)或分子量為22,000 ~ 26,000、醇解度為98%的分析純PVA作為載體。將4 ~ 10 g明膠浸泡於100 mL 濃度為20 mmol丄"的Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液中溶脹24 h，然後加熱到40 ~ 50 'C至明膠全部溶解，溶液變為透明，得到明膠與Tris緩衝液重量體積百分 比濃度(W/V)為4 ~ 10%的明膠-Tris或磷酸鹽-檸檬酸溶液，pH值為4.0 10.0。將10 20 gPVA浸泡於100 mL濃度為50 rnmol.I/1的Tris緩衝溶液中溶脹 24 h，然後加熱使其在回流下沸騰直至PVA全部溶解，溶液變為透明狀，得到 PVA與Tris緩衝液重量體積百分比濃度(W/V)為10 20%的PVA-Tris溶液，pH 值為8.0。(3) BR的超聲分散採用文獻Oesterhelt, D.; Stoeckenius, W. 五"g;mo/., 1974, 3/, 667所報導 的方法製備野生型BR，得到濃度為10 ~ 28 mgTiiL"的BR懸浮液。為降低BR 碎片的尺寸以獲得均勻的薄膜，同時減少測量時碎片對光的散射，懸浮液利用寧 波產JY92-II型超聲波細胞粉碎機進行破碎處理，採用①2探頭，超聲功率300 Hz，超聲時間1 s，間隔5 s，超聲20 ~ 30次，超聲過程中始終用冰水混合液冷卻以 防止熱量過於集中引起BR變性。經超聲處理後的BR碎片直徑小於200 nm。 (4 ) BR與明膠或PVA-Tris混合分別取步驟(3)中所得到的BR懸浮液0.1 0.15mL與步驟(2)中所得到 的明膠或PVA-Tris溶液0.15 ~ 0.25 mL，攪拌混合均勻。因最終獲得的薄膜的光 密度取決於BR懸浮液的用量，儘量提高BR懸浮液的濃度有利於減少樣品的體 積用量，明膠或PVA-Tris (或磷酸鹽-檸檬酸)與BR懸浮液的體積比為3:2 ~ 5:3， 明膠或PVA-Tris (或磷酸鹽-檸檬酸)的用量過多會導致薄膜的厚度增加，用量 過少則無法使BR均勻分散。(5) 混合懸浮液超聲和過濾步驟(4)得到的BR與聚合物及緩衝溶液的混合物利用寧波產JY92-II型 超聲波細胞粉碎機進行破碎處理，採用①2探頭，超聲功率200Hz，超聲時間l s，間隔10s，超聲20次，超聲過程中始終用冰水混合液冷卻以防止熱量過於集 中引起BR變性。每超聲5次將離心管從冰水中取出，在室溫下(20~25 °C) 放置l 2min，防止明膠或PVA由於過冷而凝結，然後用3 ~ 5 pm的混合纖維 素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡等。過濾後的混合液在室 溫下靜置10 30min,使細小的氣泡浮於表面，將氣泡刮去。(6) 乾燥成膜在淨室中放置可調節水平的平板，調節至水平，將步驟(1)中的親水性石 英片或K7玻璃放置於平板表面，將步驟(5)得到的混合液轉移到石英片或K7 玻璃表面，令其自然鋪展後，在溫度為4~15 'C，相對溼度40~80%的條件下 乾燥24 h。最終獲得表面光潔平整、分散均勻的BR-明膠或PVA薄膜，其外觀 照片見附圖1。(7) 光密度及O態和P態的測量 所製備的薄膜經過測量得到如下結果薄膜具有較高的光密度，且各處的光密度均勻(見附圖2)，能夠產生O態和P態(見附圖3)。 以明膠或聚乙烯醇為聚合物載體，薄膜的光密度對其應用也有很大影響，較大的 光密度有利於產生更高的光對比度等。本發明人對成膜的條件及過程進行了詳細 研究，得到了較高光密度，表面平整、BR分散均勻、各處的光密度均勻的BR-聚合物薄膜。 實施例1選用厚度為2mm，直徑20mm,表面精度X/2的石英片作為基底製備BR薄 膜。a.將清洗乾淨的石英片或K7玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水衝洗後，依次在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗15 20min; c.經 過上述處理的石英片或K7玻璃片放入異丙醇中保存備用，此時的石英片表面呈 親水性。取經過超聲處理(碎片尺寸〈200nm)、濃度為28 mg.ml/1的BR懸浮液0.15 mL與0.25 mL明膠-Tris溶液混合攪拌均勻。Tris緩衝溶液的濃度為50 mmol丄—1， 明膠與Tris緩衝液重量體積百分比濃度(W/V)為6% ，明膠-Tris與BR懸浮液的 體積比為5:3。所得的混合懸浮液利用寧波產JY92-II型超聲波細胞粉碎機進行 破碎處理，(D2探頭，超聲功率200Hz，超聲時間ls，間隔10s，超聲20次， 超聲過程中始終用冰水混合液冷卻以防止熱量過於集中引起BR變性。每超聲5 次後將離心管從冰水中取出，在室溫下(20~25 °C)放置2min，防止明膠由於 過冷而凝結，然後用5 ^mi的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的 大顆粒和氣泡等。過濾後的混合液在室溫下靜置30min，使細小的氣泡浮於表面， 將氣泡刮去。在淨室中放置可調節水平的平板，調節至水平，將親水性石英片放置於平板 表面。另將經超聲破碎的BR-明膠混合液轉移到石英片表面，使其自然鋪展，在 溫度為4 'C，相對溼度60X的條件下乾燥24h，獲得表面平整、各處光密度均 勻、BR分散均勻的BR-明膠或PVA薄膜，其外觀照片見附圖l。 實施例2選用厚度為1 mm，直徑20 mm，表面精度X/2的K7玻璃片作為基底製備 BR薄膜。a.將清洗乾淨的K7玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水衝洗後，依次在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗15 20min; c.經 過上述處理的K7玻璃片放入異丙醇中保存備用，此時的K7玻璃片表面呈親水 性。取經過超聲處理(碎片尺寸< 200 nm)、濃度為28 mg.mL—1的BR懸浮液0.15 mL與0.25 mL的PVA-Tris溶液混合攪拌均勻。Tris緩沖溶液的濃度為507mmol.i;1， PVA與Tris緩衝液重量體積百分比濃度(W/V)為15%, PVA-Tris與 BR懸浮液的體積比為5:3。所得的混合懸浮液利用寧波產JY92-II型超聲波細胞 粉碎機進行破碎處理，02探頭，超聲功率200Hz， 超聲時間1 s，間隔10s， 超聲20次，超聲過程中始終用冰水混合液冷卻以防止熱量過於集中引起BR變 性。每超聲5次後將離心管從冰水中取出，在室溫下(20~25 °C)放置2min， 防止PVA由於過冷而凝結，然後用5 pm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混 合液中殘留的大顆粒和氣泡等。過濾後的混合液在室溫下靜置30min，使細小的 氣泡浮於表面，將氣泡刮去。在淨室中放置可調節水平的平板，調節至水平，將親水性K7玻璃放置於平 板表面，另將經超聲破碎的BR-PVA混合液轉移到K7玻璃片表面，令其自然鋪 展，在溫度為4 。C,相對溼度60X的條件下乾燥24h，獲得表面平整、BR分散 均勻的BR- PVA薄膜。實施例3選用厚度為1 mm，直徑20 mm，表面精度X/2的K7玻璃片作為基底製備 BR薄膜。a.將清洗乾淨的K7玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水衝洗後，依次在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗15 20min; c.經 過上述處理的K7玻璃片放入異丙醇中保存備用，此時的K7玻璃片表面呈親水 性。取經過超聲處理(碎片尺寸〈200nm)、濃度為10mgTnl/1的BR懸浮液0.1 mL與0.25 mL明膠-Tris溶液混合攪拌均勻。Tris緩衝溶液的濃度為20 mmo1.1/1 ， 明膠與Tris緩衝液重量體積百分比濃度(W/V)為4% ，明膠-Tris與BR懸浮液的 體積比為3:2。所得的混合懸浮液(pH = 7.2)利用寧波產JY92-II型超聲波細胞 粉碎機進行破碎處理，①2探頭，超聲功率200Hz，超聲時間ls，間隔10s，超 聲20次，超聲過程中始終、用冰水混合液冷卻以防止熱量過於集中引起BR變性。 每超聲5次將離心管從冰水中取出，在室溫下(20~25 'C)放置1 min，防止明 膠由於過冷而凝結，然後用5 pm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中 殘留的大顆粒和氣泡等。過濾後的混合液在室溫下靜置30min，使細小的氣泡浮 於表面，將氣泡刮去。節水平的平板，調節至水平，將親水性K7玻璃放置於平 板表面，另將經超聲破碎的BR-明膠混合液轉移到K7玻璃片表面，令其自然鋪 展，在溫度為15 °C，相對溼度80X的條件下乾燥24h，獲得表面平整、分散均 勻的BR-明膠薄膜。實施例4選用厚度為l mm，直徑20 mm，表面精度V2的K7玻璃片作為基底製備 BR薄膜。a.將清洗乾淨的K7玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24 h; b.用二次水衝洗後，依次在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗15 20min; c.經 過上述處理的K7玻璃片放入異丙醇中保存備用，此時的K7玻璃片表面呈親水 性。取經過超聲處理(碎片尺寸< 200 nm)、濃度為10 mg.m!/1的BR懸浮液0.15 mL與0.25 mL明膠-磷酸鹽-檸檬酸溶液混合攪拌均勻。磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液 的濃度為20 mmol.L'1，明膠與磷酸鹽-擰檬酸緩衝液重量體積百分比濃度(W/V) 為4%，明膠-磷酸鹽-檸檬酸與BR懸浮液的體積比為3:2。所得的混合懸浮液(pH =4.2 ~ 6.4)利用寧波產JY92-II型超聲波細胞粉碎機進行破碎處理，①2探頭， 超聲功率200Hz，超聲時間ls，間隔10s,超聲20次，超聲過程中始終用冰水 混合液冷卻以防止熱量過於集中引起BR變性。每超聲5次將離心管從冰水中取 出，在室溫下(20~25 °C)放置1 min，防止明膠由於過冷而凝結，然後用5 pm 的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡等。過濾後的 混合液在室溫下靜置30min，使細小的氣泡浮於表面，將氣泡刮去。在淨室中放置可調節水平的平板，調節至水平，將親水性K7玻璃放置於平 板表面，另將經超聲破碎的BR-明膠混合液轉移到K7玻璃片表面，令其自然鋪 展，在溫度為15 °C，相對溼度80X的條件下乾燥24h，獲得表面平整、分散均 勻的BR-明膠薄膜。
權利要求
1.一種可產生O態和P態的細菌視紫紅質薄膜的製備方法，其特徵是選用分子量在30,000～70,000的分析純明膠或分子量在22,000～26,000的分析純PVA作為高分子成膜載體，將明膠或PVA溶解於Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液中得到明膠或PVA溶液，再將野生型細菌視紫紅質-BR的懸浮液與明膠或PVA溶液充分混合，得到均勻的混合物；將此混合物鋪展於石英或K7光學玻璃表面，經成膜乾燥，得到表面光潔平整、BR分布均勻、各處光密度均勻的細菌視紫紅質-明膠或PVA薄膜。
2. 如權利要求1所述的一種可產生0態和P態的細菌視紫紅質薄膜的 製備方法，其特徵是所述的石英或K7光學玻璃必須經表面親水處理，方法 是將清洗乾淨的石英或K7光學玻璃浸泡於飽和的KOH甲醇或異丙醇溶液 中，然後用二次蒸餾水衝洗，再依次用丙酮、乙醇和二次蒸餾水超聲清洗， 得到表面親水的石英或K7光學玻璃。
3. 如權利要求1所述的一種可產生O態和P態的細菌視紫紅質薄膜的 製備方法，其特徵是所述的均勻混合物是將經超聲破碎的野生型BR懸浮液 與經Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝的明膠或PVA溶液以體積比為3:2 ~ 5:3的 比例混合而得到的混合液，野生型BR懸浮液碎片直徑在200 nm以下，BR 懸浮液的濃度為10 28mg七"；Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液的濃度為20 ~ 50 mmol丄"；明膠或PVA與Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液的重量/體積百 分比為4~20%。
4. 如權利要求1所述的一種可產生0態和P態的細菌視紫紅質薄膜的 製備方法，其特徵是所述的混合物由BR、 Tris或磷酸鹽-檸檬酸、明膠或 PVA組成的混合液體，pH值在4.0 8.5範圍內。
5. 如權利要求1所述的一種可產生O態和P態的細菌視紫紅質薄膜的 製備方法，其特徵是所述的成膜是將BR、 Tris或磷酸鹽-檸檬酸、明膠或 PVA的混合物經超聲處理，用3 5pm的濾膜過濾，除去殘留的大顆粒和 氣泡；過濾後的混合液在室溫下靜置10 30min，使細小的氣泡浮於表面， 將氣泡刮去；將除去氣泡的混合液倒在水平放置的石英或K7光學玻璃表面 鋪展，在溫度為4 15、C、溼度為40~80%的條件下，靜置乾燥12 48h; 得到表面光潔平整、BR分布均勻、各處光密度均勻的細菌視紫紅質-明膠 或PVA薄膜。
全文摘要
本發明屬於有機材料領域，特別涉及具有O態和P態的細菌視紫紅質-明膠或PVA薄膜的製備。其特徵是選用分子量在30,000～70,000的分析純明膠或分子量在22,000～26,000的分析純PVA作為高分子成膜載體，將明膠或PVA溶解於Tris或磷酸鹽-檸檬酸緩衝溶液中得到明膠或PVA溶液，再將野生型細菌視紫紅質—BR的懸浮液與明膠或PVA溶液充分混合，得到均勻的混合物；將此混合物鋪展於石英或K7光學玻璃表面，經成膜乾燥，得到表面光潔平整、BR分布均勻、各處光密度均勻的細菌視紫紅質-明膠或PVA薄膜。這種表面光潔平整、BR分散均勻、各處光密度均勻的BR-明膠或BR-PVA薄膜，可以應用於空間光調製器、全息記錄、模式識別和信息存儲等領域。
文檔編號C08L29/00GK101260241SQ20081010471
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月23日 優先權日2008年4月23日
發明者王麗萍, 許旭東, 趙成明 申請人:北京科技大學