雞馬立克氏病毒抗體及其製備方法
2023-04-25 14:44:11 2
專利名稱：雞馬立克氏病毒抗體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物製劑及其製備方法，特別是涉及一種雞馬立克氏病 毒抗體及其製備方法。
背景技術：
馬立克氏病(MD)是由馬立克氏皰疹病毒(MDV)導致的免疫抑制性和 致瘤性傳染病，它的潛伏期長，隱蔽性強，是雞的主要傳染病之一。由於 該病嚴重損害雞免疫系統，除本身可導致累計高達70%以上的致死率外，還 常可導致其它雞病疫苗的免疫失敗或繼發感染而造成重大損失。MD疫苗免 疫僅能阻止或減少感染雞群MD發病，而不能阻斷致病性MDV對雞群的侵入 與傳播。因此，MDV感染的診斷與監測不僅是MD防治的重要手段，也是確 證禽用疫苗免疫效果的前提和評價養禽生物安全狀況的有效方法。
MDV抗原是MDV在增殖過程中所產生的代謝產物。利用免疫沉澱方法可 從MDV GA株的感染細胞抽提物中鑑定出多達46種病毒特異性多肽，其中， 通過瓊擴試驗能夠鑑定出3個主要MDV抗原，分別命名為A抗原、B抗原和-C抗原，這些病毒性抗原能激發感染免疫雞體產生相應的抗體。
MDV有三個血清型，從溫和型到毒力很強的致瘤株以及它們的致弱株， 均歸為血清I型MDV，天然不致瘤的病毒株為血清II型，火雞皰疹病毒(HVT) 屬於血清m型。三個血清型中只有血清I型中的強毒株對雞是致瘤或致病 性的，且三個血清型的非致瘤毒株都可用作MD的疫苗。其中，MDV血清II 型疫苗所產生的瓊擴抗原與MDV A抗原有明顯的不同，而HVT疫苗在免疫 雞體內產生A抗原及其所激發相應的抗體均十分有限，而低敏的經典瓊擴 試驗難以檢出。
目前，製備MDV陽性抗體，大多是從致病性MDV感染雞、免疫感染後的 免疫倖存雞或MDV抗原免疫雞的血清中分離製取，因此，該MDV陽性抗體 製備的方法始終存在著散毒的危險，試驗雞群的飼養、管理等須採取嚴格 的生物安全控制措施，從而又導致陽性血清的生產成本十分高昂；同時， 在製備的陽性血清中，含有大量的非目的抗體及可能存在的潛在病原，因 而難以被允許進入正規的生產渠道。
目前，國內外從雞蛋卵黃中提取抗體的方法有多種，其中與本專利申請 相關的有兩種。 一種方法包括以下工藝步驟(l)向卵黃液中直接加入大量 氯仿，以抽提其水溶液；(2)採用超濾方法進一步濃縮氯仿抽提的水溶液， 即可得到卵黃中的目的抗體。另一種方法包括以下工藝步驟(1)製備卵黃上清液；(2)採用氯仿對卵黃上清液進行脫脂純化處理；(3)進行超濾並得到濃縮液，即可得到卵黃中的目的抗體。上述兩種提取卵黃抗體的方法均存在以下問題由於先採用氯仿直接對卵黃液或卵黃上清液進行脫脂純 化處理，再進行超濾，因此，氯仿的消耗多，純化的工作量大，卵黃抗體 的製備成本高。 發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種雞馬立克氏病毒抗體及其製備 方法，這樣，在不影響抗體的特異性和敏感性的基礎上，可使抗體的製備 更加安全、簡便易行而便於產業化，且製得的抗體產量高、成本低，可用 於免疫監測以及疫病防控。為解決上述技術問題，本發明提供了一種雞馬立克氏病毒抗體，該抗體 通過以下步驟製得(1) 採用馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株、含有目的抗原的表達 載體、致病性馬立克氏病毒及MDV抗原佐劑疫苗中的至少一種，按一定的 接種程序接種雞，監測接種蛋雞所產生的目的抗體效價，並在其達到規定 的最低目的抗體效價時，開始收集該接種蛋雞所產的雞蛋；(2) 分離出收集的雞蛋中的卵黃，採用酸水法製備卵黃上清液，對卵 黃上清液進行超濾並得到濃縮液，再採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理， 得到目的抗體。本發明應用能夠產生或釋放出目的馬立克氏病毒抗原的生物製劑作為 免疫原，採用一定的程序接種雞，利用接種蛋雞作為生物反應器生產特異 性生物活性物質一抗體，該抗體能夠通過血液進入雞蛋中的卵黃，通過對 該抗體的檢測並達到規定的效價後，即可收集接種蛋雞所產雞蛋，並採取 一定的處理方法提取出卵黃抗體。本發明應用卵黃抗體的生產來替代血清抗體的生產，一個雞蛋的所獲抗 體量可超過常規感染雞一次放血所得的血清抗體量，大大降低了目的抗體 的生產成本，並最大限度地減少了生產過程中的病原汙染。在卵黃抗體的 提取中，對收集的接種蛋雞的雞蛋先採用酸水法粗提出卵黃上清液，對卵 黃上清液進行超濾並得到濃縮液，再採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理， 得到目的抗體。這樣，可顯著降低氯仿脫脂純化處理的工作量，並可節約 氯仿用量50%以上。因此，本發明通過接種蛋雞所產的雞蛋來製備目的抗體， 在不影響抗體的特異性和敏感性的基礎上，可使抗體的製備更加安全、簡 便易行而便於產業化，且製得的抗體產量高、成本低，可用於免疫監測以 及疫病防控。在本發明的製備方法中
所述接種雞的步驟為健康雛雞接種馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗 毒株作為基礎免疫，間隔0.5 1.5個月，用含有目的抗原的表達載體、致 病性馬立克氏病毒及MDV抗原佐劑疫苗中的一種進行加強免疫，以後，每 隔2 3個月用MDV抗原佐劑疫苗進行強化免疫。
所述接種雞的步驟為3月齡以上的蛋雞接種MDV抗原佐劑疫苗或含有 目的抗原的表達載體作為基礎免疫，間隔1 1.5個月，用MDV抗原佐劑疫 苗進行加強免疫，以後，每隔2 3個月用MDV抗原佐劑疫苗進行強化免疫。
所述採用酸水法製備卵黃上清液的過程為將卵黃、醋酸鈉一醋酸緩衝 液按1: (6 14)的比例混合均勻，紗布過濾以除去卵黃膜，並靜置於室溫 下6 24h，製得卵黃上清液，所述醋酸鈉一醋酸緩衝液的pH值為4. 5 5. 5、 濃度為0. 05 0. 12mol/L。
所述對卵黃上清液進行的超濾採用截留分子量為10 150KD的超濾膜， 操作壓差為0. 01 0. 2Mpa，且得到的濃縮液體積為卵黃體積的1/5 1/2。
所述採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理的過程為在對卵黃上清液進 行超濾得到的濃縮液內加入終濃度為1 5%的氯仿後，震蕩3 5min，在4°C 的溫度條件下靜置30min 72h，再用8000 10000Xg的離心力離心10 60min，收集上清液，並調節其pH值為6.0 7.4，即得到澄清透明的目的 抗體。
所述馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株包括血清I型的CVI988株、 血清III型的火雞皰疹病毒Fc-126株；所述致病性馬立克氏病毒為能夠有效 分泌馬立克氏病毒目的抗原的血清I型MDV溫和毒株。
所述MDV抗原佐劑疫苗的製備方法為將提取純化的MDV抗原按常規方 法配成水相後與油相進行乳化製備與檢驗，MDV抗原包括MDVA抗原、MDVB 抗原。
收集雞蛋時，雞蛋中所達到規定的目的抗體的瓊擴效價不低於1: 4， 或者是與所述瓊擴效價相當的其它方法所測的效價。
另，所述馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株不只限於血清I型活疫 苗、血清III型的火雞皰疹病毒活疫苗，也可以是能夠有效分泌馬立克氏病 毒目的抗原的其它馬立克氏病毒商品疫苗。
在所述MDV抗原佐劑疫苗中，還可加入免疫促進劑，或在向雞接種MDV
抗原佐劑疫苗的同時，另外使用免疫促進劑。
作為本發明的優選，所述致病性馬立克氏病毒為BJ-1株。
具體實施例方式
6實施例一一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟(1) 選新生SPF健康雛雞，接種馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒 株作為基礎免疫，所述的疫苗毒株為血清I型的CVI988株(市售)並按說 明書要求進行免疫；免疫後30天時以MDV抗原佐劑疫苗按0. 5ml/羽劑量皮下注射進行加強 免疫，所述的佐劑疫苗的製備方法為將提取純化的MDV A抗原按常規方法配成水相後與油相進行乳化製備，要求瓊擴效價l: 8以上；加強免疫後第60天時再以該MDV抗原佐劑疫苗按1.0ml/羽劑量肌肉注 射進行強化免疫，以後每隔3個月再用該MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同 的強化免疫；自接種蛋雞產蛋後，開始監測接種蛋雞所產雞蛋中的目的抗體效價水 平，當雞蛋中所達到規定的目的抗體的瓊擴效價不低於l: 4時，開始收集 該接種蛋雞所產的雞蛋；(2) 分離出收集的雞蛋中的卵黃，採用酸水法製備卵黃上清液將卵 黃、醋酸鈉-醋酸緩衝液按l: 6的比例混合均勻，紗布過濾以除去卵黃膜， 並靜置於室溫下24h，製得卵黃上清液，所述醋酸鈉-醋酸緩衝液的pH值為 5. 5、濃度為0. 12mol/L;對卵黃上清液進行超濾並得到濃縮液超濾來用截留分子量為150KD 的超濾膜，操作壓差為0.01Mpa，且得到的濃縮液體積為卵黃體積的1/5;採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理在對卵黃上清液進行超濾得到 的濃縮液內加入終濃度為1.5%的氯仿後，震蕩5min，在4。C的溫度條件下 靜置30min，再用10000Xg的離心力離心10min，收集上清液，並調節其 pH值為7.0，即得到澄清透明的目的抗體。實施例二一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟 (1)選新生SPF健康雛雞，接種馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株 作為基礎免疫，所述的疫苗毒株為血清I型的CVI988株(市售)並按說明 書要求進行免疫；免疫後45天時，將致病性馬立克氏病毒的BJ-1株復壯後的血毒用MD 疫苗專用稀釋液進行100倍稀釋後，按0. 2ml/羽劑量皮下注射進行加強免 疫；加強免疫後60天時再以MDV抗原佐劑疫苗按1. 5ml/羽劑量肌肉注射進 行強化免疫，以後每隔2個月用該MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同的強化免疫，所述的佐劑疫苗的製備方法為將提取純化的MDV A抗原按常規方法配成水相後與油相進行乳化製備，要求瓊擴效價l: 8以上；自接種蛋雞產蛋後，開始監測接種蛋雞所產雞蛋中的目的抗體效價水平，當雞蛋中所達到規定的目的抗體的瓊擴效價不低於l: 4時，開始收集該接種蛋雞所產的雞蛋；(2)分離出收集的雞蛋中的卵黃，採用酸水法製備卵黃上清液將卵黃、醋酸鈉-醋酸緩衝液按i : 12的比例混合均勻，紗布過濾以除去卵黃膜，並靜置於室溫下12h，製得卵黃上清液，所述醋酸鈉-醋酸緩衝液的pH值為 4. 5、濃度為0. 05mol/L;對卵黃上清液進行超濾並得到濃縮液超濾採用截留分子量為10KD的 超濾膜，操作壓差為0.2Mpa，且得到的濃縮液體積為卵黃體積的1/2;採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理:在對卵黃上清液進行超濾得到的濃縮液內加入終濃度為1.0%的氯仿後，震蕩3min，在4。C的溫度條件下靜 置12h，再用8000Xg的離心力離心10min，收集上清液，並調節其pH值 為6.0，即得到澄清透明的目的抗體。 實施例三一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟(1) 以馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株的血清III型的火雞皰疹病 毒Fc-126株(市售)按說明書要求免疫新生SPF健康雛雞，免疫後15天 時再以馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株的血清I型的CVI988株(市售)按說明書要求進行二次免疫作為基礎免疫；基礎免疫後15天時，以MDV抗原佐劑疫苗按0. 5ml/羽劑量肌肉注射進 行加強免疫，所述的佐劑疫苗的製備方法為將提取純化的MDV A抗原按 常規方法配成水相後與油相進行乳化製備，要求瓊擴效價l: 16以上；加強免疫後60天時再以該MDV抗原佐劑疫苗按1.0ml/羽劑量肌肉注射 進行強化免疫，此後每隔2個月用MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同的強化 免疫；當該接種雞所產雞蛋中目的抗體的瓊擴效價達1 : 4以上時收集該接種 蛋雞所產的雞蛋；(2) 分離出收集的雞蛋中的卵黃，採用酸水法製備卵黃上清液將卵 黃、醋酸鈉-醋酸緩衝液按1 : 14的比例混合均勻，紗布過濾以除去卵黃膜， 並靜置於室溫下6h，製得卵黃上清液，所述醋酸鈉-醋酸緩衝液的PH值為 5.0、濃度為0. 10mol/L;對卵黃上清液進行超濾並得到濃縮液超濾採用截留分子量為100KD的超濾膜，操作壓差為O. 1Mpa，且得到的濃縮液體積為卵黃體積的3/10;採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化:在對卵黃上清液進行超濾得到的濃縮 液內加入終濃度為5%的氯仿後，震蕩5min，在4°C的溫度條件下靜置72h， 再用9000Xg的離心力離心60min，收集上清液，並調節其pH值為7.4， 即得到澄清透明的目的抗體。實施例四一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟(1) 選新生SPF健康雛雞，接種馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株 作為基礎免疫，所述的疫苗毒株為血清III型的火雞皰疹病毒Fc-126株(市 售)並按說明書要求進行免疫；基礎免疫後40天時，將致病性馬立克氏病毒的BJ-1株復壯後的血毒用 MD疫苗專用稀釋液進行100倍稀釋後，按0. 2ml/羽劑量皮下注射進行加強 免疫；加強免疫後60天時以MDV抗原佐劑疫苗按1. Oml/羽劑量肌肉注射進行 強化免疫，此後每隔3個月用該MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同的強化免 疫，所述MDV抗原佐劑疫苗的製備同實施例三；自接種蛋雞產蛋後，開始監測接種蛋雞所產雞蛋中的目的抗體效價水 平，當雞蛋中所達到規定的目的抗體的瓊擴效價不低於1: 4時，開始收集 該接種蛋雞所產的雞蛋；(2) 其後的雞馬立克氏病毒抗體的製備同實施例一。 實施例五一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟(1) 選3月齡的SPF蛋雞，以MDV抗原佐劑疫苗作為免疫原，按0. 5ml/ 羽劑量肌肉注射作為基礎免疫，所述MDV抗原佐劑疫苗的製備方法為將 提取純化的MDV A抗原按常規方法配成水相後與油相進行乳化製備，要求瓊擴效價l: 16以上；在基礎免疫後30天時用該MDV抗原佐劑疫苗按1. Oml/羽劑量肌肉注射 進行加強免疫；加強免疫後70天時再以該MDV抗原佐劑疫苗按1. 5ml/羽劑量肌肉注射 進行強化免疫，此後，每隔2個月用該MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同的 強化免疫；監測接種蛋雞所產雞蛋中的目的抗體效價水平，當雞蛋中所達到規定的 目的抗體的瓊擴效價不低於l: 4時，開始收集該接種蛋雞所產的雞蛋。(2) 其後的雞馬立克氏病毒抗體的製備同實施例二。9實施例六一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟-(1) 選新生SPF健康雛雞，接種馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株 作為基礎免疫，所述的疫苗毒株為血清I型的CVI988株(市售)並按說明 書要求進行免疫；免疫後30天時，用含有目的抗原的表達載體按150ug/羽劑量肌肉注 射進行加強免疫；加強免疫後2個月時再以MDV抗原佐劑疫苗按1. Oml/羽劑量肌肉注射 進行強化免疫，所述MDV抗原佐劑疫苗的製備方法同實施例一，以後每隔 2. 5個月用同樣的MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同的強化免疫；自接種蛋雞產蛋後，開始監測接種蛋雞所產雞蛋中的目的抗體效價水 平，當雞蛋中所達到規定的目的抗體的瓊擴效價不低於l: 4時，開始收集 該接種蛋雞所產的雞蛋；(2) 其後的雞馬立克氏病毒抗體的製備同實施例一。 實施例七一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟(1) 選3月齡的SPF蛋雞，用含有目的抗原的表達載體按200ug/羽 劑量肌肉注射作為基礎免疫；在基礎免疫後45天，以MDV抗原佐劑疫苗按1. Oml/羽劑量進行皮下注 射作為加強免疫，所述MDV抗原佐劑疫苗的製備方法同實施例三；在加強免疫後60天再以該MDV抗原佐劑疫苗按1.5ml/羽劑量肌肉注射 進行強化免疫，此後，每隔3個月用該MDV抗原佐劑疫苗進行一次相同的 強化免疫；監測接種蛋雞所產雞蛋中的目的抗體效價水平，當雞蛋中所達到規定的 目的抗體的瓊擴效價不低於l: 4時，開始收集該接種蛋雞所產的雞蛋。(2) 其後的雞馬立克氏病毒抗體的製備同實施例三。 以上所述的僅是本發明的七種實施方式。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以作出若干變型和改 進，這些均應視為屬於本發明的保護範圍。比如MDV抗原還可為MDVB抗 原；用製得的液相的目的抗體製成凍幹抗體以利於保存和應用；當抗體效 價保持較高水平或下降至較低水平時，可延期或提前實施強化免疫；因生 產廠家的不同，所選擇的超濾膜應以有效截留住抗體為準，而不能僅依據 所標註的截留分子量為準。
權利要求
1、一種雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，包括以下步驟(1)採用馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株、含有目的抗原的表達載體、致病性馬立克氏病毒及MDV抗原佐劑疫苗中的至少一種，按一定的接種程序接種雞，監測接種蛋雞所產生的目的抗體效價，並在其達到規定的最低目的抗體效價時，開始收集該接種蛋雞所產的雞蛋；(2)分離出收集的雞蛋中的卵黃，採用酸水法製備卵黃上清液，對卵黃上清液進行超濾並得到濃縮液，再採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理，得到目的抗體。
2、 根據權利要求l所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，其特徵在 於所述接種雞的步驟為健康雛雞接種馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗 毒株作為基礎免疫，間隔0.5 1.5個月，用含有目的抗原的表達載體、致 病性馬立克氏病毒及MDV抗原佐劑疫苗中的一種進行加強免疫，以後，每 隔2 3個月用MDV抗原佐劑疫苗進行強化免疫。
3、 根據權利要求l所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，其特徵在 於所述接種雞的步驟為3月齡以上的蛋雞接種MDV抗原佐劑疫苗或含有 目的抗原的表達載體作為基礎免疫，間隔1 1.5個月，用MDV抗原佐劑疫 苗進行加強免疫，以後，每隔2 3個月用MDV抗原佐劑疫苗進行強化免疫。
4、 根據權利要求l所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，其特徵在 於所述採用酸水法製備卵黃上清液的過程為將卵黃、醋酸鈉一醋酸緩 衝液按1: (6 14)的比例混合均勻，紗布過濾以除去卵黃膜，並靜置於室溫下6 24h，製得卵黃上清液，所述醋酸鈉一醋酸緩衝液的pH值為4. 5 5.5、濃度為0. 05 0. 12mol/L。
5、 根據權利要求l所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，其特徵在 於所述對卵黃上清液進行的超濾採用截留分子量為10 150KD的超濾膜， 操作壓差為0. 01 0. 2Mpa，且得到的濃縮液體積為卵黃體積的1/5 1/2。
6、 根據權利要求l所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備方法，其特徵在 於所述採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理的過程為在對卵黃上清液 進行超濾得到的濃縮液內加入終濃度為1 5%的氯仿後，震蕩3 5min，在 4'C的溫度條件下靜置30min 72h，再用8000 10000Xg的離心力離心 10 60min，收集上清液，並調節其pH值為6. 0 7. 4，即得到澄清透明的 目的抗體。
7、 根據權利要求l、 2、 4、 5、 6中任何一項所述的雞馬立克氏病毒抗 體的製備方法，其特徵在於所述馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株包 括血清I型的CVI988株、血清III型的火雞皰疹病毒Fc-126株；所述致病性馬立克氏病毒為能夠有效分泌馬立克氏病毒目的抗原的血清I型MDV溫和 毒株。
8、 根據權利要求1至6中任何一項所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備 方法，其特徵在於所述MDV抗原佐劑疫苗的製備方法為將提取純化的 MDV抗原按常規方法配成水相後與油相進行乳化製備與檢驗，MDV抗原包括 MDV A抗原、MDV B抗原。
9、 根據權利要求1至6中任何一項所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備 方法，其特徵在於收集雞蛋時，雞蛋中所達到規定的目的抗體的瓊擴效 價不低於l: 4，或者是與所述瓊擴效價相當的其它方法所測的效價。
10、 根據權利要求1所述的雞馬立克氏病毒抗體的製備方法製備的雞馬 立克氏病毒抗體。
全文摘要
本發明為一種雞馬立克氏病毒抗體及其製備方法。製備方法為採用馬立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株、含有目的抗原的表達載體、致病性馬立克氏病毒及MDV抗原佐劑疫苗中的至少一種，按一定的接種程序接種雞，監測接種蛋雞所產生的目的抗體效價，並在其達到規定的最低目的抗體效價時，開始收集該接種蛋雞所產的雞蛋；分離出收集的雞蛋中的卵黃，採用酸水法製備卵黃上清液，對卵黃上清液進行超濾並得到濃縮液，再採用氯仿對濃縮液進行脫脂純化處理，得到目的抗體。這樣，在不影響抗體的特異性和敏感性的基礎上，可使抗體的製備更加安全、簡便易行而便於產業化，且製得的抗體產量高、成本低，可用於免疫監測以及疫病防控。
文檔編號C07K16/08GK101575374SQ20091002785
公開日2009年11月11日 申請日期2009年5月18日 優先權日2009年5月18日
發明者丁維民, 孫格格, 翠 張, 張訓海, 旋 王, 磊 趙, 爭 龔 申請人:張訓海