一種檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器及其製備方法和檢測方法
2023-04-25 16:38:36
一種檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器及其製備方法和檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器，其特徵在於：免疫傳感器是在玻碳電極的表面覆蓋有氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜，在所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面通過1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺處理後固定有人白介素6抗體。本發明通過電致化學發光免疫傳感器實現了對人白介素6的檢測，方法簡單、靈敏度高，易於操作。
【專利說明】一種檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器及其製備方法和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器及其製備方法和檢測方法，更具體地說是涉及一種基於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點(GO/PANI/CdSe)複合物的電致化學發光免疫傳感器。
【背景技術】
[0002]自英國科學家在2004年發現石墨烯以來，石墨烯作為一種密集堆積的單層碳原子二維材料已經迅速成為了碳材料研究中的熱點。氧化石墨烯表面存在大量含氧基團，表現出優異的電、熱以及機械性能，在微電子器件、液晶器件以及太陽能電池等領域中有潛在的應用價值[參見:(a) X.S.Li, Y.ff.Zhu, ff.ff.Cai, M.Borysiak, B.Y.Han, D.Chen, R.D.Piner, L.Colombo, R.S.Ruoff, Nano Letters, 2009, 9, 4359.]。利用聚合物對氧化石墨烯進行功能化修飾，可以大大提高了石墨烯的水溶性和導電性能。在眾多功能化石墨烯中，聚苯胺功能化的氧化石墨烯除具備大的比表面積外，還具有良好的生物相容性和導電性[參見:(b)Y.X.Liu, X.C.Dong, P.Chen, Chem.Soc.Rev.，2012，41，2283.]。
[0003]電致化學發光是電極反應產物之間或者電極產物與體系中某組分進行化學反應所產生的一種光輻射，具有成本低，分析範圍廣和高靈敏度等很多優點。自2002年，Bard等在2002年發現了量子點的電致化學發光(ECL)現象以來，ECL免疫傳感器已經引起了人們極大的興趣[參見:(c) Z.F.Ding, B.M.Quinn, S.K.Haram, L.E.Pell, B.A.KorgeI, A.J.Bard, Science, 2002, 296，1293.]。然而與傳統的ECL發光試劑相比，發光效率低和生物相容性差等問題限制了它們在生命分析中的應用。因此，尋找新型高效、價廉、生物相容性好的發光材料仍是構建ECL免疫傳感器的重要研究目標。
[0004]人白介素6是一種多效性細胞因子，其在炎症反應中具有關鍵作用，與一些炎症性疾病，如牛皮癬、炎症性關節炎、心血管疾病、發炎性腸道疾病等疾病的發病機制具有密切聯繫。傳統的檢測人白介素6的方法是酶聯免疫法。該方法雖然準確，但是它的檢測步驟繁瑣，分析時間長，樣品消耗量大，需要專業的實驗室，且需要昂貴的儀器和專門的底物顯色劑，不利於進行現場檢測。因此，急需發展一種簡單、快速和高靈敏度的分析方法實現人白介素6的快速檢測。
[0005]將氧化石墨烯納米片、聚苯胺納米線陣列和硒化鎘量子點的優點結合起來製備氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物，可以充分發揮三者的優點，能提高電致化學發光性能，良好的生物相容性，較大的比表面積和極好的穩定性，是用於研究ECL免疫傳感器的良好的納米材料，在免疫生物學和臨床診斷等領域將會有廣闊的應用前景。目前，基於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物的電致化學發光免疫傳感器還尚無報導。
【發明內容】
[0006]本發明為解決上述現有技術所存在的不足之處，提供一種基於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物的檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器及其製備方法和檢測方法，以期可以以高電致化學發光、高生物相容性的電致化學發光免疫傳感器實現對人白介素6的簡單、快速的檢測。
[0007]本發明解決技術問題採用如下技術方案:
[0008]本發明檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器，其結構特點在於:所述免疫傳感器是在玻碳電極的表面覆蓋有氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜，在所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面通過1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺處理後固定有人白介素6抗體。
[0009]本發明檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器，其結構特點也在於:所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜是以苯胺和氧化石墨烯為原材料，通過原位反應得到氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物，再和硒化鎘量子點混合後獲得。
[0010]本發明檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器的製備方法，其特點在於按如下步驟進行:
[0011]步驟一、將50ul的苯胺溶於20ml濃度為lmol/L的濃硫酸溶液中，超聲處理0.5h後獲得苯胺的硫酸溶液；向20ml濃度為0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液中滴加所述苯胺的硫酸溶液，室溫下攪拌30min後，再加入0.1512g過硫酸銨，持續攪拌12h，然後用去離子水離心洗滌至pH為6?7，65°C下真空乾燥，獲得墨綠色產物，即為氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物，以去離子水為溶劑，將氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物配製成濃度為0.5mg/ml的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物溶液；
[0012]步驟二、將步驟一所製得的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物溶液與以去離子水為溶劑、濃度為8.2 X 10_5mol/L硒化鎘量子點溶液按體積比1:3混合，獲得氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物溶液；
[0013]步驟三、將玻碳電極依次用中位粒徑為1.0 ii m、0.3 ii m和0.05 ii m的三氧化二鋁
拋光粉拋光至鏡面，然後超聲清洗，並用氮氣吹乾，得備用玻碳電極；
[0014]步驟四、在步驟三製得的備用玻碳電極上滴加IOiU步驟二所製得的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物溶液，室溫晾乾後在備用玻碳電極上形成氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜，再滴加IOiil由20-30mg/mll-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10_20mg/ml N-羥基琥珀醯亞胺組成的混合溶液於所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面，靜置20-30min，得中間樣；
[0015]步驟五、將步驟四所製得的中間樣浸入以濃度為lOmmol/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液為溶劑、濃度為0.lmg/ml的人白介素6抗體的溶液中反應12-20小時,取出後用濃度為10mmol/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液清洗，再浸入質量濃度為2_3%的牛血清蛋白中封閉1_2小時，取出清洗即得檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器。
[0016]利用本發明檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器的檢測方法，其特點是按如下步驟獲得待測人白介素6樣品濃度:[0017]步驟a、將所述檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器浸入IOul待測人白介素6樣品中，並在37°C下溫育50分鐘後取出清洗，得待測免疫傳感器；
[0018]步驟b、將步驟a所得的待測免疫傳感器在含有0.lmol/L K2S2O8和0.lmol/L KCl的0.lmol/L的pH7.4磷酸鹽緩衝液中進行電致化學發光的測試，獲得發光強度，利用發光強度與待測人白介素6樣品濃度的標準關係曲線，判斷待測人白介素6樣品的濃度。
[0019]本發明的檢測方法，其特點也在於:所述標準關係曲線是通過對以濃度分別為0.0005ng/ml、0.0lng/ml、0.lng/ml、lng/ml 和 lOng/ml 的人白介素 6 樣品所製備的待測免疫傳感器進行電致化學發光的測試，獲得各濃度人白介素6樣品所對應的發光強度，如圖1所示，各線條所對應濃度分別為:a為0ng/ml、b為0.0005ng/ml、c為0.0lng/ml、d為
0.lng/ml、e為lng/ml和f為10ng/ml ;然後以人白介素6樣品的濃度的對數值為橫坐標、以發光強度為縱坐標進行擬合，如圖1的插圖所示。檢測表明當人白介素6樣品濃度在
0.0005到10ng/ml範圍內，發光強度隨著濃度的增大而降低，與濃度成線性關係，檢測限達到 0.17pg/ml。
[0020]所述電致化學發光測試是以所述免疫傳感器為工作電極、以Pt電極為對電極、以飽和氯化銀電極為參比電極的三電極體系，用MP1-A型電致化學發光儀，在0到-1.5V進行循環伏安掃描，光電倍增管高壓設為700V。
[0021 ] 與已有技術相比，本發明的有益效果體現在:
[0022]1、本發明通過電致化學發光免疫傳感器實現了對人白介素6的檢測，方法簡單、靈敏度高，易於操作；
[0023]2、本發明對人白介素6的檢測方法所需樣品量少，檢測成本低；
[0024]3、本發明通過氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜製備電致化學發光免疫傳感器，電致化學發光性能高，生物相容性好，且具有極好的穩定性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1 為本發明對濃度分別為 0.0005ng/ml、0.01ng/ml、0.lng/ml、lng/ml 和 IOng/ml的人白介素6樣品進行電致化學發光的測試結果，插圖為標準關係曲線；
[0026]圖2為本發明中氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物的掃描電子顯微鏡(SEM)表徵結果；
[0027]圖3為本發明中氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物的掃描電子顯微鏡(SEM)表徵結果；
【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029]本實施例檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器按如下步驟進行製備:
[0030]步驟一、將50 U I的苯胺溶於20ml濃度為lmol/L的濃硫酸溶液中，超聲處理0.5h後獲得苯胺的硫酸溶液；向20ml濃度為0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液中滴加所述苯胺的硫酸溶液，室溫下攪拌30min後，再加入0.1512g過硫酸銨，持續攪拌12h，然後用去離子水離心洗滌至pH為6?7，65°C下真空乾燥，獲得墨綠色產物，即為氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物，以去離子水為溶劑，將氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物配製成濃度為0.5mg/ml氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物溶液；氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物的掃描電子顯微鏡(SEM)表徵結果如圖2所示；
[0031]步驟二、將步驟一所製得的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物溶液與硒化鎘量子點溶液(濃度為8.2mol/L，溶劑為水)按體積比1:3均勻混合，獲得氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物溶液；氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物的掃描電子顯微鏡(SEM)表徵結果如圖3所示；
[0032]步驟三、將直徑4mm玻碳電極依次用中位粒徑為1.0 y m、0.3 u m 0.05 u m的三氧化二鋁拋光粉拋光至鏡面，然後超聲清洗，並用氮氣吹乾，得備用玻碳電極；
[0033]步驟四、在步驟三製得的備用玻碳電極上滴加IOiU步驟二所製得的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物溶液，室溫晾乾後在備用玻碳電極上形成氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜，再滴加10 Ul由20mg/mil-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和10mg/ml (NHS)N-羥基琥珀醯亞胺組成的混合溶液於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面，靜置20min,得中間樣；
[0034]步驟五、將步驟四所製得的中間樣浸入以濃度為10mmol/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液為溶劑、濃度為0.lmg/ml的人白介素6抗體的溶液中在4°C下反應12小時,取出後用濃度為lOmmol/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液清洗，再浸入質量濃度為2%的牛血清蛋白中封閉I小時，取出清洗即得檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器。
[0035]利用本實施例電致化學發光免疫傳感器的檢測人白介素6的檢測方法是按如下步驟進行:
[0036]步驟a、將檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器浸入IOul待測人白介素6樣品中，並在37°C下溫育50分鐘後取出清洗，得待測免疫傳感器；
[0037]步驟b、將待測免疫傳感器在含有0.lmol/L K2S2OjP0.lmol/L KCl的0.lmol/L的PH7.4磷酸鹽緩衝液中進行電致化學發光的測試，獲得待測免疫傳感器的發光強度，利用發光強度與待測人白介素6樣品濃度的標準關係曲線，判斷待測人白介素6樣品的濃度。
[0038]實施例2
[0039]本實施例是以濃度為30mg/ml的EDC按與實施例1相同的方法製備免疫傳感器，所得免疫傳感器與實施例1所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。
[0040]實施例3
[0041]本實施例是以濃度為20mg/ml NHS按與實施例1相同的方法製備免疫傳感器，所得免疫傳感器與實施例1所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。
[0042]實施例4
[0043]本實施例將實施例1中的步驟四「滴加10 ill由20mg/mll-乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和10mg/ml (NHS) N-羥基琥珀醯亞胺組成的混合溶液於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面，靜置20min」改為靜置30min，其餘條件步驟與實施例1相同，所得免疫傳感器與實施例1所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。[0044]實施例5
[0045]本實施例將實施例1中的步驟四「滴加10 ill由20mg/mll-乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和10mg/ml (NHS) N-羥基琥珀醯亞胺組成的混合溶液於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面，靜置20min」改為「滴加IOiU由30mg/mll-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和20mg/ml (NHS) N-羥基琥珀醯亞胺組成的混合溶液於氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面，靜置30min」，其餘條件步驟與實施例1相同，所得免疫傳感器與實施例1所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。
[0046]實施例6
[0047]本實施例將將實施例1中的步驟五「將步驟四所製得的中間樣浸入以濃度為I Ommo I/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液為溶劑、濃度為0.lmg/ml的人白介素6抗體的溶液中在4°C下反應12小時」改為反應20小時，其餘條件步驟與實施例1相同，所得免疫傳感器與實施例I所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。
[0048]實施例1
[0049]本實施例將將實施例1中的步驟五所用的質量濃度為2%的牛血清蛋白改為質量濃度為3%的牛血清蛋白，其餘條件步驟與實施例1相同，所得免疫傳感器與實施例1所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。
[0050]實施例8
[0051]本實施例將將實施例1中的步驟五「再浸入質量濃度為2%的牛血清蛋白中封閉I小時」改為封閉2小時，其餘條件步驟與實施例1相同，所得免疫傳感器與實施例1所得免疫傳感器的形貌與性質類似，通過對相同待測人白介素6樣品的檢測，得到相同的免疫檢測結果。
【權利要求】
1.一種檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器，其特徵在於:所述免疫傳感器是在玻碳電極的表面覆蓋有氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜，在所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面通過1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺處理後固定有人白介素6抗體。
2.根據權利要求1所述的檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器，其特徵在於:所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜是以苯胺和氧化石墨烯為原材料，通過原位反應得到氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物，再和硒化鎘量子點混合後獲得。
3.根據權利要求1或2所述的檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器的製備方法，其特徵在於按如下步驟進行: 步驟一、將50ul的苯胺溶於20ml濃度為lmol/L的濃硫酸溶液中，超聲處理0.5h後獲得苯胺的硫酸溶液；向20ml濃度為0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液中滴加所述苯胺的硫酸溶液，室溫下攪拌30min後，再加入0.1512g過硫酸銨，持續攪拌12h，然後用去離子水離心洗滌至pH為6~7，65°C下真空乾燥，獲得墨綠色產物，即為氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物，以去離子水為溶劑，將氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物配製成濃度為0.5mg/ml的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物溶液； 步驟二、將步驟一所製得的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列複合物溶液與以去離子水為溶劑、濃度為8.2X 10_5mol/L硒化鎘量子點溶液按體積比1:3混合，獲得氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物溶液； 步驟三、將玻碳電極依次用中位粒徑為1.0 ii m、0.3 ii m和0.05 ii m的三氧化二鋁拋光粉拋光至鏡面，然後超聲清洗，並用氮氣吹乾，得備用玻碳電極； 步驟四、在步驟三製得的備用 玻碳電極上滴加IOiU步驟二所製得的氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子 點複合物溶液，室溫晾乾後在備用玻碳電極上形成氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜，再滴加10 Ul由20-30mg/mil-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10-20mg/ml N-羥基琥珀醯亞胺組成的混合溶液於所述氧化石墨烯納米片/聚苯胺納米線陣列/硒化鎘量子點複合物膜的表面，靜置20-30min，得中間樣； 步驟五、將步驟四所製得的中間樣浸入以濃度為lOmmol/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液為溶劑、濃度為0.lmg/ml的人白介素6抗體的溶液中反應12-20小時,取出後用濃度為lOmmol/ml的pH7.4磷酸鹽緩衝液清洗，再浸入質量濃度為2_3%的牛血清蛋白中封閉1_2小時，取出清洗即得檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器。
4.一種利用權利要求3所述檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器的檢測方法，其特徵是按如下步驟獲得待測人白介素6樣品濃度: 步驟a、將所述檢測人白介素6的電致化學發光免疫傳感器浸入IOul待測人白介素6樣品中，並在37°C下溫育50分鐘後取出清洗，得待測免疫傳感器； 步驟b、將步驟a所得的待測免疫傳感器在含有0.lmol/L K2S2O8和0.lmol/L KCl的0.lmol/L的pH7.4磷酸鹽緩衝液中進行電致化學發光的測試，獲得發光強度，利用發光強度與待測人白介素6樣品濃度的標準關係曲線，判斷待測人白介素6樣品的濃度。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵是:所述標準關係曲線是通過對以濃度分別為0.0005ng/ml、0.01ng/ml、0.lng/ml、lng/ml和lOng/ml的人白介素6樣品所製備的待測免疫傳感器進行電致化學發光的測試，獲得各濃度人白介素6樣品所對應的發光強度，然後以人白介素6樣品的濃度的對數值為`橫坐標、以發光強度為縱坐標進行擬合。
【文檔編號】G01N33/531GK103487573SQ201310450342
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】毛昌傑, 胡曉煒, 石陽陽, 王程, 殷暢, 劉蘋貞, 張勝義, 牛和林, 宋吉明 申請人:安徽大學