一株高產β-葡聚糖酶的重組大腸桿菌及其構建的製作方法

2023-05-10 17:07:56 1

專利名稱：一株高產β-葡聚糖酶的重組大腸桿菌及其構建的製作方法
技術領域：
一株高產P -葡聚糖酶的重組大腸桿菌及其構建，本發明涉及從澱粉液化芽
胞桿菌中克隆得到P-l,3-l，4-葡聚糖酶基因，構建重組表達質粒並轉化大腸桿菌，
屬於基因工程技術領域。
背景技術：
(3~葡聚糖是構成未本科植物細胞壁的一種非澱粉性多糖，在大麥、黑麥、 高梁、大米和小麥的胚乳細胞壁中含量尤其高。P-葡聚糖可以很大的分子量溶 解於水中，其濃度越大，溶液的粘度也就越大，這在以大麥為主要原料的啤酒 工業中會造成過濾速度和原料利用率降低，成品啤酒的非生物穩定性下降，在 畜牧業中用麥類飼料餵養禽畜的時候會造成消化液粘度增大，養分的吸收效率 降低，甚至會造成某些消化道疾病。通過添加可降解P-葡聚糖的P-l,3-l,4-葡聚 糖酶，便可以有效消除這個不良因子。獲得高產(3-葡聚糖酶的微生物菌株，對 於實現P-葡聚糖酶的產業化，具有重要現實意義。

發明內容
本發明的目的是提供一株高產P -葡聚糖酶的重組大腸桿菌及其構建。PCR 擴增得到澱粉液化芽孢桿菌5acz7/w amy/o//^e/acz'ms SYB-001的(3~1,3-1，4-葡聚 糖酶基因，並構建一株可高產卩-l,3-l,4-葡聚糖酶的重組大腸桿菌。
本發明的技術方案澱粉液化芽胞桿菌菌株5a"7/M am_y/o%we/adera SYB-001的|3-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序列SEQIDNO: 1。
澱粉液4t芽？包桿菌(5a"7/w am少/o/z々i/e/ac/e";y) SYB-001巳在ZL. 200510038488.8公開，
公開日2005年10月19日。
一株高產(3-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，其含有基因序列SEQIDNO:l， 分類命名為大腸埃希氏菌(￡. co//BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl)，已保藏於中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2470。
產P-葡聚糖酶的重組大腸桿菌CGMCC No.2470的構建方法，從澱粉液化芽 孢桿菌萬a"7/us am_y/o//^e/ac/ms SYB-001提取染色體DNA作模板，進行PCR擴 增，引物
PAG1-F: 5，國ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAAT TCTTG-3' PAG1畫R: 5，畫GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3' PCR擴增體系在0.5 mLPCR管中按順序加入以下試劑10xPCR緩衝液 5 ^L; 25 mol/LMgCl24 2.5 mmol/LdNTPs 1 ^L; 25 jxmol/L上下遊引物各1^L;模板DNA2pL; Taq酶0.6pL;加雙蒸水至總體系50
PCR擴增條件94'C預變性3min; 94'C變性50s、 56 。C退火45 s、 72'C延 伸lmin， 30個循環；4'C保溫，獲得(3-l,3-l，4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序歹U: SEQ ID NO: 1;
將其用B"mH I和J^zo I酶切後連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，得到重 組載體pET28a(+)-bgl，用CaCl2法轉化五.co//BL21(DE3)得到重組大腸埃希氏菌 (￡ co/z'BL21(DE3)-pET28a(+)國bgl) CGMCC No.2470。
卩-葡聚糖酶活力測定方法精確吸取待測稀釋酶液0.5 mL，及pH6.5磷酸 二氫鈉一磷酸氫二鈉緩衝液1.0mL，置於40'C水浴預熱5min，加入經預熱的 1.0。/。卩一葡聚糖溶液0.5mL，立即開始計時，於40 。C水浴精確反應10min，立 即加入3.0 mL 3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液終止反應，然後置於沸水浴中7 min， 取出迅速冷卻後加入10mL去離子水，搖勻後，測定550nm下的反應液的吸光 值。同時進行空白對照測定，其步驟為吸取待測稀釋酶液0.5 mL，加入1.0 mL pH 5.0磷酸氫二鈉一檸檬酸緩衝液，然後先加入3.0mLDNS液使酶失活，40'C水 浴預熱，再加入同樣經預熱的1.0%卩一葡聚糖溶液0.5 mL， 4(TC水浴10 min， 然後置於沸水浴中7min，以後步驟相同於樣品測定。
本發明的有益效果結果顯示，經異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)誘導， 該基因得到了高效表達，在LB培養基中總酶活可達322.0 U/mL，胞外酶活為 127.5 U/mL，高於國內外同類報導的平均水平。該菌的質粒穩定性好，傳100 代後，質粒保持率為88%。對重組酶的酶學性質研究表明，最適反應溫度為50 °C， 40-50 。C範圍內較穩定，最適pH為6.0，在pH4.5-6.0範圍內較為穩定。該 菌株適合在工業化e -葡聚糖酶生產中推廣和應用，可以適用於啤酒釀造工業。 生物材料樣品保藏
一株高產e-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，該菌株為大腸埃希氏菌，命名為K BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微
生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2470，保藏日期為2008年4月29日。


圖1 重組載體pET28a(+)-bgl結構圖。 圖2 CGMCC No.2470較為穩定的pH範圍。 圖3 CGMCC No.2470較為穩定的溫度範圍。
具體實施例方式
以下實施例更為詳細地解釋了本發明的技術關鍵點，為更好地理解本發明 提供了依據。 實施例l
1)從澱粉液化芽孢桿菌^3"7/^ am少/o/^we/adera提取染色體DNA作模板，進行PCR擴增，PCR擴增引物及條件
PAG1-F: 5，-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAAT TCTTG-3' PAG1-R: 5 ，-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3 ， PCR擴增體系在0.5mLPCR管中按順序加入以下試劑10xPCR緩衝液
5 ^L; 25 mol/LMgCl24 (iL; 2.5 mmol/LdNTPs 1 (iL; 25 |xmol/L上下遊引物各1
|iL;模板DNA2^L; Taq酶0.6pL;加雙蒸水至總體系50 pL。
PCR擴增條件94'C預變性3min; 94'C變性50s、 56'C退火45 s、 72 °。延
伸lmin， 30個循環；4 "C保溫。
2) 大腸桿菌感受態的製備及轉化均採用常規方法，參照文獻[薩姆布魯克J, 拉塞爾D W.分子克隆實驗指南(第三版)上冊.黃培堂等譯.北京科學出版 社，2002]。
3) 目的酶的表達
培養基LB培養基(g/L)，胰蛋白腖IO，酵母提取物5，氯化鈉IO，另添加 硫酸卡那黴素30mg/L;
種子培養斜面菌樣一環接入裝有10 mL液體LB培養基的100 mL的三角 瓶中，37°C， 200 r/min振蕩培養過夜，得種子菌液。
種子菌液以4%的接種量，接入新鮮LB培養基中。37°C， 200r/min振蕩培 養至OD6(xrl左右，加入0.2 mmol/L的IPTG， 30°C， 200 r/min振蕩誘導5 h。序 列 表
SEQ ID NO: 1
atgaaacgagtgttgctaattcttgtcaccggattgtttatgagtttgtgtgggatcact60
tctagtgtttcggctc犯acaggcggatcgttttttgaaccttttaacagctataactcc120
gggttatggctggttactcaaatggagatatgtttaactgcacttggcgt180
gcgaataacgtctctatgacgtcatcaggtgaaatgcgtttggcgctgacaagtccgixt240
ttgactgcgggg犯33CCgCtcggttcaa￡Lcatatggctatggactttat300
gaagtcagaatgaaaccggcgggattgtttcatcgttcttcacttataca360
ggtccggaggggactccttgggatgagattgatatcgaatttttggg420
acaaaggttxggcgcaggaa3cc3tgagaagttggcggat480
ctcggatttg3tgc3gccaatgcctatcatacgtatgcgttcgattggcagccaaactct540
attaaatggtatgtcgatgggc犯tt犯aacatactgcgacaacccaaataccggcagcg600
ccggggaa犯tcatgatgaatttgtggaatggtacgggtgtcgatgattggctcggttcc660
tacaatggcgtaaatccgcteitacgctcattacgsctgggtgcgctatac71權利要求
1. 澱粉液化芽胞桿菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序列SEQ ID NO1。
2. —株高產P-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，其含有基因序列SEQIDNO: 1， 分類命名為大腸埃希氏菌(￡. co// BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl)，已保藏於中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2470。
3. 權利要求2所述產(3-葡聚糖酶的重組大腸桿菌CGMCC No.2470的構建方 法，其特徵是從澱粉液化芽孢桿菌^^7/us a^y/o/Z^e/ac/era SYB-001提取染色體 DNA作模板，進行PCR擴增，弓l物PAG1-F: 5，-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAAT TCTTG-3， PAG1-R: 5，-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3' PCR擴增體系在0.5mLPCR管中按順序加入以下試劑10xPCR緩衝液^L; 25 mol/LMgCl24 ^L; 2.5 mmol/LdNTPs 1 ^L; 25 (xmol/L上下遊引物各1^L;模板DNA2pL; Taq酶0.6pL;加雙蒸水至總體系50 ^L;PCR擴增條件94-C預變性3min; 94'C變性50s、 56'C退火45 s、 72 。C延伸lmin， 30個循環；4'C保溫，獲得P-l,3-l，4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序列SEQIDNO: 1;將其用萬amH I和^7zo I酶切後連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，得到重 組載體pET28a(+)-bgl，用CaCl2法轉化五.co/z'BL21(DE3)得到重組大腸埃希氏菌 (五.co/,BL21(DE3)國pET28a(+)畫bgl) CGMCCNo.2470。
全文摘要
一株高產β-葡聚糖酶的重組大腸桿菌及其構建，屬於基因工程領域。從高產β-葡聚糖酶的澱粉液化芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens SYB-001專利菌株(ZL.200510038488.8)中擴增出β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序列SEQ ID NO1，將其插入到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，得到重組載體pET28a(+)-bgl，轉化Escherichia coli BL21(DE3)得到重組菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl，CGMCC No.2470。重組菌CGMCC No.2470經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導，該基因得到了高效表達，在LB培養基中總酶活可達322.0U/mL，胞外酶活為127.5U/mL，最適反應溫度為50℃，最適pH為6.0。該菌株適合在工業化β-葡聚糖酶生產中推廣和應用。
文檔編號C12N15/56GK101285071SQ200810108039
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月13日 優先權日2008年5月13日
發明者劉春鳳, 崎 李, 李永仙, 焱 謝, 鄭飛雲, 顧國賢 申請人:江南大學