一種集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統的製作方法

2023-05-11 08:36:06

一種集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統，該系統包括微流控晶片、高頻鎖相放大器和處理器，其中微流控晶片由流道層、電極層、基底層和PCB板依次對準封裝而成，流道層上設有細胞分選螺旋流道、檢測主流道和縮進流道，縮進流道和電極層的平面金屬電極對準，在主流道兩側形成液體電極結構；電極層的電極通過PCB板的功率放大電路、I/V轉換電路與高頻鎖相放大器構成差分高頻阻抗測量電路實現細胞交流阻抗的差分檢測。本發明的系統能夠實現對稀有細胞分選與表徵功能的整合，提高了細胞檢測技術的集成度和準確性，可廣泛用於稀有細胞生物學研究、疾病早期診斷與治療等領域。
【專利說明】一種集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及微流控晶片和生物粒子操控、檢測領域，具體涉及一種集成螺旋流道慣性分選技術和差分電阻抗測量技術的微流控晶片稀有細胞檢測系統。
【背景技術】
[0002]捕捉檢測血液、胸水等體液中微乎其微的稀有細胞，有助於疾病的早期診斷與患者的病情監測以及開展個性化治療。目前，臨床上常用的稀有細胞檢測方法有免疫細胞化學、流式細胞術、螢光原位雜交及逆轉錄聚合酶鏈反應等，這些方法具有各自的優勢，但都以稀有細胞表達的生物分子標記物為分析對象，存在操作複雜、樣品消耗大、檢測效率低以及實驗儀器昂貴等共同缺點。結合微流控技術、阻抗分析技術和流式細胞術的微流控阻抗細胞儀，是一種能夠實現單細胞連續分析的非標記方法，與上述方法相比，具有樣品消耗低、操作簡單和處理快速等優勢，在細胞的計數、形貌分析和介電性能表徵等方面得到了廣泛的應用。
[0003]目前已有研究者嘗試利用微流控阻抗細胞儀分析檢測稀有細胞，並取得初步進展。然而已有的微流控阻抗細胞儀集成度低，通常只包括阻抗測量與表徵單項功能模塊，沒有涉及細胞分選、聚焦等前處理過程，不能實現在體液中直接檢測稀有細胞，從而極大限制了稀有細胞檢測方法在臨床診斷中的應用。且現有微流控阻抗細胞儀的測量頻率通常只達到IO7Hz級，能夠分析細胞膜電容和細胞質電導率，但無法獲取細胞核等內部結構信息。另外，目前研究人員通常採用商業化的阻抗分析儀，限制了細胞檢測系統的應用範圍，且不易實現微型化與可攜式。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統，該系統集成了螺旋流道慣性分選技術與差分電阻抗測量技術，實現了稀有細胞檢測的高通量分選與精確表徵功能的有機整合。
[0005]為實現上述目的，本發明採用的技術方案是:
本發明集成細胞分選功能的微流控晶片稀有細胞檢測系統包括微流控晶片、高頻鎖相放大器以及處理器；所述微流控晶片由流道層、電極層、基底層和PCB板依次對準封裝而成；其特徵在於:所述流道層包括螺旋流道、突擴結構流道、上分支流道、下分支流道、檢測主流道以及兩對縮進流道；所述的螺旋流道一端為樣品入口、所述的螺旋流道另一端為突擴結構，所述突擴結構具有兩個出口，所述的兩個出口分別與所述的上分支流道和下分支流道連接；所述的下分支流道出口為檢測主流道，所述的檢測主流道出口為稀有細胞出口 ；所述的上分支流道出口為廢液出口，所述上分支流道設置有使廢液出口與稀有細胞出口之間流體壓力平衡的彎曲結構；所述兩對縮進流道對稱分布於檢測主流道的兩側；
所述電極層包括一對信號施加電極和一對信號傳感電極，分別與兩對縮進流道相互對準，在檢測主流道的兩側形成液體電極結構；所述PCB板的集成電路包括電信號輸入接口、功率放大電路、I/V轉換電路以及電信號輸出接口 ；所述的ΙΛ轉換電路包括電流電壓轉換模塊和差分放大模塊；所述電信號輸入接口與功率放大電路連接，所述的功率放大電路分成兩路與所述的一對信號施加電極連接，所述Ι/v轉換電路與電信號輸出接口連接；所述的I/V轉換電路分成兩路與所述的一對信號傳感電極連接；
所述的高頻鎖相放大器通過第一輸出端與電信號輸入接口連接，高頻鎖相放大器通過第一輸入端與電信號輸出接口連接；所述高頻鎖相放大器、電信號輸入接口、功率放大電路、信號施加電極依次連接構成激勵信號施加電路；所述信號傳感電極、Ι/v轉換電路、電信號輸出接口以及高頻鎖相放大器依次連接構成差分阻抗信號傳感電路。
[0006]所述的高頻鎖相放大器通過第二輸出端與處理器連接。
[0007]進一步地，還包括進樣裝置、廢液收集裝置和稀有細胞收集裝置；所述進樣裝置和樣品入口連接；所述廢液收集裝置和廢液出口連接；所述稀有細胞收集裝置和稀有細胞出口連接。
[0008]與現有技術相比，本發明具有的有益效果是:
利用流體在螺旋流道中的慣性效應和Dean流作用，將稀有細胞和其它細胞聚焦在不同的平衡位置，並通過突擴結構流道分別導入下分支流道和上分支流道，同時，當下分支流道中的稀有細胞運輸到檢測主流道的液體電極結構時，藉助差分阻抗測量電路獲取稀有細胞的差分電阻抗信號，得到稀有細胞的體積與內部介電性能等參數信息，採用上述螺旋流道慣性分選技術結構與差 分電阻抗測量技術集成，克服了已有細胞檢測方法的集成度低、測量頻率低等缺陷，實現對稀有細胞分選與表徵功能的有效整合；另外，本系統的晶片結構簡單、加工方便，檢測過程中無需鞘液、無需複雜的免疫標記預處理，具有操作簡單、自動化程度高等優點，可廣泛用於稀有細胞生物學研究、疾病早期診斷與治療等領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發明集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統整體結構示意圖；
圖2為本發明微流控晶片的結構示意圖；
圖3為本發明螺旋流道中細胞慣性分選的原理示意圖；
圖4為本發明突擴結構流道處細胞分選的原理示意圖；
圖5為本發明液體電極結構的局部放大圖；
圖6為本發明差分交流阻抗測量電路原理示意圖。
[0010]圖中:11、微流控晶片，12、高頻鎖相放大器，13、處理器，14、進樣裝置，15、廢液收集裝置，16、稀有細胞收集裝置，17、微管，111、流道層，112、電極層，113、基底層，114、PCB板，121、電纜線，122、數據線，21、螺旋流道，22、突擴結構流道，23、上分支流道，24、下分支流道，25、檢測主流道，28、緊固件，211、樣品入口，231、廢液出口，251、縮進流道，252、稀有細胞出口，261、信號施加電極，262、信號傳感電極，263、導電銀膠，264、導電銀膠，271、電信號輸入接口，272、功率放大電路，273、I/V轉換電路，274、電信號輸出接口，31、Dean流，32、螺旋流道內壁面，33、螺旋流道內壁面，41、稀有癌細胞，42、血細胞。
【具體實施方式】[0011]下面結合附圖對本發明作進一步說明。
[0012]如圖1所示，本發明集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統包括微流控晶片11、高頻鎖相放大器12、處理器13、樣品進樣裝置14、廢液收集裝置15和稀有細胞收集裝置16。樣品進樣裝置14、廢液收集裝置15和稀有細胞收集裝置16通過微管17與微流控晶片11連接，分別用於細胞樣品的進樣、廢液的收集和稀有細胞的收集。高頻鎖相放大器12通過電纜線121與PCB板114的集成電路的電信號輸入接口 271和電信號輸出接口 274分別連接，用於施加高頻交流信號(500MHz)和對響應信號進行處理，並通過數據線122將處理後的交流阻抗信號傳輸到處理器13中，處理器13可以採用計算機。 [0013]如圖2，6所示，所述檢測系統的微流控晶片11由流道層111、電極層112、基底層113和PCB板114依次對準封裝而成。流道層111包括螺旋流道21、突擴結構流道22、上分支流道23、下分支流道24、檢測主流道25和兩對縮進流道251，螺旋流道21 —端為樣品入口 211，樣品入口 211通過微管17和樣品進樣裝置連接，螺旋流道21另一端為突擴結構22，突擴結構22具有兩個出口，兩個出口分別與上分支流道23和下分支流道24連接；下分支流道24出口為檢測主流道25，檢測主流道25出口為稀有細胞出口 252，稀有細胞出口 252通過微管17和稀有細胞收集裝置16連接；上分支流道23出口為廢液出口 231，廢液出口231通過微管17和廢液收集裝置15連接，上分支流道23設置有使廢液出口 231與稀有細胞出口 252之間流體壓力平衡的彎曲結構；兩對縮進流道251對稱分布於檢測主流道25的兩側；電極層112包括一對信號施加電極261和一對信號傳感電極262,分別與兩對縮進流道251相互對準，在檢測主流道25的兩側形成液體電極結構；PCB板114的集成電路包括電信號輸入接口 271、功率放大電路272、I/V轉換電路273以及電信號輸出接口 274 ;所述的I/V轉換電路27包括電流電壓轉換模塊和差分放大模塊，所述電信號輸入接口 271通過銅箔線與功率放大電路272連接，所述的功率放大電路272分成兩路通過導電銀膠263與所述的一對信號施加電極261連接；所述高頻鎖相放大器12、電信號輸入接口 271、功率放大電路272、信號施加電極261依次連接構成激勵信號施加電路；所述I/V轉換電路273通過銅箔線與電信號輸出接口 274連接；所述的I/V轉換電路273分成兩路通過導電銀膠263與所述的一對信號傳感電極262連接；所述信號傳感電極262、I/V轉換電路273、電信號輸出接口 274以及高頻鎖相放大器12依次連接構成差分阻抗信號傳感電路。
[0014]微流控晶片11的基底層113所用材質為透明的聚二甲基矽氧烷、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的任意一種，流道層111所用材質為聚二甲基矽氧烷、玻璃、環氧樹月旨、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的任意一種，信號施加電極261和信號傳感電極262為完全相同的平面金屬微電極，其所用材質為金或鉬等。基底層113上電極層112的製作可通過結合光刻技術和磁控濺射技術實現，而流道層111則可利用光刻技術或其他刻蝕技術快速加工得到，為了避免流道內表面對細胞的吸附，採用化學修飾等特定方式對流道表面進行改性。通過設置微結構對準標記，藉助紫外/臭氧照射或氧等離子體處理等表面改性技術實現基底層113和流道層111的不可逆鍵合。PCB板114和基底層113通過緊固件28實現固定。
[0015]下面以血液中稀有癌細胞的分選與表徵來闡述本發明微流控晶片系統的工作流程和基本原理。
[0016]本發明微流控晶片系統的主要工作流程:樣品進樣裝置14將稍稀釋的全血樣品輸送至螺旋流道21，細胞在螺旋流道21內承受與細胞尺寸相關的慣性升力和Dean拽力作用，使得大小不同的血細胞42和稀有癌細胞41聚焦在各自的平衡位置上；利用突擴結構流道22在螺旋流道21的末端將血細胞42從樣品中分離到上分支流道23，經廢液出口 231收集到廢液收集裝置15，並將稀有癌細胞41導入下分支流道24 ;當稀有癌細胞41沿下分支流道24進入檢測主流道25的測量單元時，信號施加電極261、信號傳感電極262、功率放大電路272、I/V轉換電路273、高頻鎖相放大器12組成的測量電路對稀有細胞進行差分交流阻抗測量，最後在計算機上對阻抗信號進行降噪和設別，分析獲取稀有癌細胞的尺寸和內部介電特性信息。
[0017]如圖3所示，細胞在螺旋流道21內的慣性分選原理:在螺旋流道21的彎流道中，流體的運動可在流道剖面和截面方向上進行分解。在流道剖面上，拋物線形的泊肅葉流使得細胞受到指向壁面的剪切誘導慣性升力作用而向流道壁面運動，當細胞靠近壁面時，因細胞自旋而產生的對稱尾跡受壁面影響而產生一個指向流道中心的壁面誘導慣性升力，剪切誘導慣性升力和壁面誘導慣性升力統稱為慣性升力Fl。在流道截面上，由於流道中心附近流體較壁面附近流體具有更高的流速，離心力和徑向壓力梯度的不平衡致使流道中心處的流體向外流動，為滿足質量守恆，靠近外壁面33處的流體將沿著流道上下底面回流，於是在流道截面上產生兩個旋轉方向相反的潤31 (Dean流),使得流體中的細胞受到Dean拽力Fd作用。可以看出，在流道截面上只有在位置①處細胞所受到的慣性升力Fl和Dean拽力Fd相互抵消達到平衡，因此細胞將聚焦到靠近螺旋流道內壁面32附近。另外，由於慣性升力^和Dean拽力Fd的大小與細胞尺寸相關,最終造成體積較大的稀有癌細胞平衡在更靠近流道內壁面32 處。
[0018]如圖4所示，突擴結構流道22處細胞的分選原理:在螺旋流道21的末端，稀有癌細胞41和血細胞42因螺旋流道中的慣性升力Fl和Dean拽力Fd作用，穩定在各自的平衡位置上。當細胞運動至突擴流道22時，流道的拓寬使得細胞受到的壁面誘導慣性升力突然減小，細胞向靠近壁面的方向運動並穩定在新的平衡位置，造成稀有癌細胞41的平衡位置與血細胞42的平衡位置之間的間距變大。在突擴結構流道22的末端，分叉結構將血細胞42導入上分支流道23，將稀有細胞41導入下分支流道24，實現稀有癌細胞41的分選與聚焦。
[0019]如圖5所示，分離後的稀有癌細胞41沿下分支流道24進入檢測主流道25，並在檢測區域進行阻抗測量。在檢測區域內，平面金屬電極產生的電場沿著縮進流道251傳播，在檢測主流道25兩側的壁面上形成一個垂直的等勢面，如同在壁面上存在一對垂直電極，即形成液體電極結構。液體電極的設計，能夠在得到均勻電場分布的同時，極大簡化金屬微電極的加工。
[0020]如圖6所示，差分高頻阻抗測量電路由信號施加電極261、信號傳感電極262功率放大電路272、I/V轉換電路273、高頻鎖相放大器12組成，其中功率放大電路272和I/V轉換電路273集成在PCB板114上。功率放大器272由寬帶固定增益放大器THS4303和一系列電阻組成，用於對鎖相放大器產生的激勵信號進行功率放大。ΙΛ轉換電路273包括電流電壓轉換模塊和差分放大電路，所述的電流電壓轉換模塊由寬帶固定增益放大器THS4303和電阻組成，用於將信號傳感電極262得到的電流信號轉換成電壓信號，所述的差分放大電路由差分放大器ADA4927和電阻組成，用於對電壓信號進行差分運算。高頻鎖相放大器12產生的高頻交流信號(高達500MHz)，通過功率放大器271放大後分成兩路施加到信號施加電極261上，當細胞經過液體電極結構時，細胞引起的電流響應信號通過信號傳感電極262傳送至I/V轉換電路273依次進行電壓轉換和差分運算，並經鎖相放大器12處理後傳送至計算機，實現細胞交流阻抗的差分檢測。採用差分阻抗測量方法，能夠直接獲取細胞的阻抗信息。得到的細胞阻抗信息與施加交流信號的頻率相關，在低頻交流信號情況下，細胞膜的電容性阻礙電流通過，細胞可看作絕緣體，阻抗的幅值與細胞體積成比例；而在高頻時，細胞膜的阻礙作用下降，交流信號可以穿透細胞膜和細胞內夜，此時得到的阻抗值反映細胞的內部電學性能。
[0021]對於阻抗檢測電路獲取的細胞阻抗信號，在計算機中利用軟體進行降噪、設別和分析處理，得到電阻抗幅值和相位角等信息，結合電學模型完成對細胞體積和電學特性的提取，並繪製細胞性能參數的散點圖，完成具有實際意義的統計學分析。
[0022]以上所述，僅 是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制。對於任何熟悉本【技術領域】的相關人員來說，在不脫離本發明技術實質的前提下，還可以做出若干改進和修飾，這些改進和修飾也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統，該系統包括微流控晶片(11)、高頻鎖相放大器(12)以及處理器(13);所述微流控晶片(11)由流道層(111)、電極層(112)、基底層(113)和PCB板(114)依次對準封裝而成；其特徵在於:所述流道層(111)包括螺旋流道(21)、突擴結構流道(22)、上分支流道(23)、下分支流道(24)、檢測主流道(25)以及兩對縮進流道(251);所述的螺旋流道(21) —端為樣品入口(211)、所述的螺旋流道(21)另一端為突擴結構(22)，所述突擴結構(22)具有兩個出口，所述的兩個出口分別與所述的上分支流道(23)和所述的下分支流道(24)連接；所述的下分支流道(24)出口為檢測主流道(25)，所述的檢測主流道(25)出口為稀有細胞出口(252);所述的上分支流道(23)出口為廢液出口(231)，所述上分支流道(23)設置有使廢液出口(231)與稀有細胞出口(252)之間流體壓力平衡的彎曲結構；所述兩對縮進流道(251)對稱分布於檢測主流道(25)的兩側； 所述電極層(112)包括一對信號施加電極(261)和一對信號傳感電極(262),分別與兩對縮進流道(251)相互對準，在檢測主流道(25)的兩側形成液體電極結構； 所述PCB板(114)的集成電路包括電信號輸入接口(271)、功率放大電路(272)、I/V轉換電路(273)以及電信號輸出接口(274);所述電信號輸入接口(271)與功率放大電路(272)連接，所述的功率放大電路(272)分成兩路與所述的一對信號施加電極(261)連接；所述I/V轉換電路(273)與電信號輸出接口(274)連接，所述的I/V轉換電路(273)分成兩路與所述的一對信號傳感電極(262)連接； 所述的高頻鎖相放大器( 12)通過第一輸出端與電信號輸入接口(271)連接，高頻鎖相放大器(12)通過第一輸入端與電信號輸出接口(274)連接；所述高頻鎖相放大器(12)、電信號輸入接口(271)、功率放大電路(272)、信號施加電極(261)依次連接構成激勵信號施加電路；所述信號傳感電極(262)、I/V轉換電路(273)、電信號輸出接口(274)以及高頻鎖相放大器(12)依次連接構成差分阻抗信號傳感電路。 所述的高頻鎖相放大器(12)通過第二輸出端與處理器(13)連接。
2.根據權利要求1所述的集成細胞分選及檢測的微流控晶片系統，其特徵在於:還包括進樣裝置(14)、廢液收集裝置(15)和稀有細胞收集裝置(16);所述進樣裝置(14)和樣品入口(211)連接；所述廢液收集裝置(15)和廢液出口(231)連接；所述稀有細胞收集裝置(16)和稀有細胞出口(252)連接。
【文檔編號】C12M1/34GK103923825SQ201410154420
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】易紅, 倪中華, 唐文來, 項楠, 黃笛, 顧興中 申請人:東南大學