單管中多重靶核酸的pcr檢測方法及其試劑盒的製作方法

2023-05-11 00:51:51 1

專利名稱：：單管中多重靶核酸的pcr檢測方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明屬於核酸檢測
技術領域：
，具體而言，本發明涉及在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中靶核酸的PCR方法。另外，本發明還涉及上述PCR方法中所涉及的試劑，如內對照、引物、探針等，以及用於上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的製備應用等。
背景技術：
：聚合酶鏈反應(PCR)是當今核酸檢測中最常用的技術之一，其中實時(RealTime)PCR技術採用了諸如螢光標記等可實時檢測的標記，在核酸檢測、臨床診斷及分子生物學研究等方面的功用顯得越來重要。這類技術目前應用領域非常廣泛，已經在實驗室研究、食品安全、醫藥衛生等眾多行業中得以使用了。除了常規的實時PCR檢測，近年來人們對實時PCR檢測也做了大量改進工作。例如，中國專利申請CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A等均記載了對傳統的實時PCR的改進。但是，傳統和改進的實時PCR(尤其是實時螢光PCR)在進行實際樣品的檢測時，即使僅檢測單一靶核酸，也必須面對樣品中可能存在的多種核苷酸對檢測結果的幹擾；當在單個PCR反應容器中進行多重靶核酸檢測(即同時檢測多種靶核酸)時，由於要同時引入檢測不同種靶核酸的引物和探針，因此還進一步需要面對不同的引物和探針的相互幹擾的問題。而面對這些難題，現有技術中往往採用操作複雜、成本高的處理手段，甚至某些無法引入內對照監測系統來排除假陰性，或者引入的內對照(分子)本身(通常是核酸)進一步加劇了與多種靶核酸、引物及其探針之間的相互幹擾。為了克服現有技術的不足，經過長期艱苦努力，本發明人令人驚訝地通過優選結果判別方法、優化樣品處理方法、選擇內對照基因並任選包裝成病毒樣顆粒、和/或篩選出了引物和不同波長區域的螢光標記的探針，開發出了在單個PCR反應容器(如，單個PCR反應管)中多重檢測樣品中靶核酸的PCR方法，克服了實時螢光PCR開發中普遍遇到的多重引物/探針容易交叉汙染及靈敏度相對低的技術難點，而且對於單管檢測，操作方便並節省成本，同時採用全程內對照監控系統，保證試驗的準確性。經過大量樣本的驗證，結果可靠，而且使用目前常規的市售實時螢光PCR設備，無需改造，就能使其特異性、靈敏度、重複性等技術指標均達到國際先進水平。另外，本發明人還發明了用於上述方法的試劑，如內對照、引物、探針等，以及檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的製備應用等。
發明內容本發明的目的在於提供在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中耙核酸的實時PCR方法，該方法通過優化結果判別方法、優化樣品處理方法、優化內對照基因並優化其包裝形式、和/或優化出互不幹擾的引物、探針以及螢光標記，可以在單個PCR反應容器中同時分辨出樣品中是否存在的不同種靶核酸，尤其可以同時分辨出RNA和DNA靶核酸，而無需專門設備或試劑，也無需引入複雜實驗步驟，就能得到高特異性、靈敏度和重複性的結果。另外，本發明的目的還在於提供上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的製備應用等。具體而言，在第一方面，本發明提供了在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中一種或幾種靶核酸的實時PCR方法，其包括，(1)在所述單個PCR反應容器中混合樣品、DNA聚合酶、dNTP(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、內對照核酸、耙核酸引物對、內對照核酸引物對、一種或幾種靶核酸探針和內對照核酸探針，其中前述各種探針標記有螢光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的螢光基團的螢光檢測波長互不相同；(2)進行PCR反應，並實時檢測不同波長的螢光；和(3)根據螢光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有一種或幾種靶核酸存在於樣品中。在本發明的第一方面，所述實時PCR方法所檢測的樣品是潛在可能含有靶核酸的離體樣品，如食品、血液、血液製品、唾液、醫療用品或藥品等。所述實時PCR方法僅限於對離體樣品的檢測，檢測的直接結果是靶核酸的存在性與否。即使對於利用本發明的檢測方法檢測人或動物的血液樣品中病原體(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在與否，還需要有經驗的醫生或取樣人員判斷檢測出的靶核酸是來自於血液中的病原體還是取樣時不慎汙染的病原體，而不能直接得到疾病的診斷結果或健康狀況；即使靶核酸來自於血液中的病原體，也只能說明相應人或動物是相應病原體的攜帶者，還需要有經驗的醫生根據相應人或動物的體質、病史、臨床症狀等綜合情況才能判斷出是否會造成疾病或對健康狀況有影響。優選在本發明的第一方面的方法,中，樣品是經過預處理而富集了核酸(如靶核酸)的樣品，5如樣品是經過磁珠提取法處理過的樣品。非特異性的磁珠提取法採用表面塗有非特異性核酸吸附類物質的順磁性顆粒，在低pH(如，pH值57)和高鹽濃度的情況下核酸可以吸附到順磁性顆粒表面，在進行磁分離和充分洗滌後，在高pH(如，pH值89)、低鹽濃度的條件下可將核酸洗脫下來，由此富集了核酸(如靶核酸)的樣品可用於PCR試驗；另外還可以採用特異性吸附(如雜交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。這些處理過程對於本領域技術人員來說是熟知的，也可參見鄭秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中國法醫學雜誌，18(3):107-108;中國專利申請200610030229.5等。在本文中，"單個PCR反應容器"指所述實時PCR方法在技術上是在同一個容器中進行的，沒有必要更換容器。最優選其中所述容器是PCR反應管，其它可以進行PCR反應並可進行實時螢光檢測的容器也在本發明的保護範圍內。在本發明第一方面的實時PCR方法中，在同一個容器中就可以完成PCR擴增和實時檢測的步驟，整個過程不必更換容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入樣品與各種試劑即可，就可以通過市售的普通實時螢光PCR儀來自動完成，整個過程操作者只需添加樣品和試劑即可，非常方便。尤其是，整個過程只需添加樣品和試劑的步驟幹預，便於實現全自動操作，如使用中國專利申請2007100030261公開的自動微量加液系統(即，吸取和分配實驗液體的移液裝置及帶有該裝置的PCR儀)，即可完成本發明檢測方法的全過程自動化，從而節約了人力成本並最大程度降低了人為失誤的可能性，因此本發明的檢測方法便於自動化所帶來的成本和可靠性優勢是可以預期的。在本文中，"多重檢測"指的是同時檢測的核酸有多種，即至少兩種。在本發明的第一方面的方法中，由於至少檢測了內對照核酸和一種靶核酸，因此檢測的核酸至少有兩種。當要檢測的靶核酸種類不止一種時，和/或作為內對照的內對照核酸種類不止一種時，則同時檢測的核酸相應增加。其中，每種核酸可以是RNA,也可以是DNA。在本發明的具體實施方式中，優選進行二重檢測、三重檢測、四重檢測、或五重檢測。多種靶核酸中優選既有RNA靶核酸，也有DNA靶核酸。同樣，多種內對照核酸中優選既有RNA內對照核酸，也有DNA內對照核酸。優選在本發明的第一方面的方法中，在步驟(1)中所述單個PCR反應容器中還進一步混合有PCR反應所需的其他試劑，如pH緩衝劑和鹽。另外，還優選了甘油濃度，用以延長PCR條件下酶活耐久力。在本發明的具體實施方式中，pH緩衝劑優選是Tris.HCl;鹽優選是KC1。本領域技術人員還可以容易地選擇出其他pH緩衝劑(如磷酸緩衝液等)來調節到合適的pH,也可以容易地選擇出其他可溶性鹽(如氯化鎂等)來調節離子強度。另外，還可以進一步混合有抗氧化劑(還原劑)、蛋白(酶)保護劑(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。這些成分的選擇對於本領域技術人員來說都是熟知的。優選在本發明的第一方面的方法中，在步驟(1)中所述單個PCR反應容器中還進一步混合有反轉錄酶，例如，常見的反轉錄酶有禽類成髓細胞病毒(AMV)反轉錄酶或Moloney鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。這樣，本發明的第一方面的方法除了可以進行常規PCR反應(擴增)，用以擴增DNA類靶核酸和內對照核酸，而且可以進行反轉錄PCR(RT-PCR)，用以擴增RNA類靶核酸和內對照核酸。此時，步驟(2)進行的PCR反應就是RT-PCR反應。更優選在步驟(1)中所述單個PCR反應容器中還混合有RNA酶抑制劑，如RNasin。這樣，在RT-PCR反應中能防止RNA模板降解。優選在本發明的第一方面的方法中，其中靶核酸優選有一種、兩種或三種，其中每種耙核酸分別是RNA或DNA，優選是病原體RNA或DNA，更優選是病毒RNA或DNA，如優選是HCV(C型肝炎病毒，其為RNA病毒)RNA、HIV(人免疫缺陷病毒，其為RNA病毒)RNA或HBV(B型肝炎病毒，其為DNA病毒)DNA，最優選是HCV的5'非編碼區RNA、HIV的gag基因RNA或HBV的編碼S抗原的基因DNA。例如，檢測的靶核酸可以是HCVRNA、HIVRNA和HBVDNA中的一種、兩種或三種。在本發明的具體實施例方式中，靶核酸的示例有HCV的5'非編碼區RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的編碼S抗原的基因DNA。在本發明的第一方面的方法中，內對照核酸是不結合靶核酸探針的核酸，優選是新黴素抗藥性基因或其片段，也優選內對照核酸被包裝在病毒樣顆粒內。內對照核酸的種類優選與靶核酸的種類相同。如，靶核酸是DNA，則相應的內對照核酸是RNA;而靶核酸是RNA，則相應的內對照核酸是DNA;多種靶核酸中既有DNA也有RNA，則內對照核酸有兩種，分別是DNA和RNA，分別用於作為DNA和RNA類靶核酸的內對照。本發明人經過核酸序列資料庫的比對以及長期檢測實踐，發現新黴素抗藥性基因與HCV的5'非編碼區RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的編碼S抗原的基因DNA的序列差別很大，難以互相結合對方的探針，從而難以互相干擾，因而可以用於作為有效排除假陰性結果的對照。優選DNA內對照核酸的核苷酸序列包括SeqIDNO:16所示的序列或如SeqIDNO:16所示；優選RNA內對照核酸的核苷酸序列包括SeqIDNO:17所示的序列或如SeqIDNO:17所示。為了使內對照核酸更加類似於病原體，優選內對照核酸被包裝在病毒樣顆粒(包括假病毒)內，優選被包裝在噬菌體病毒樣顆粒內，如RNA內對照核酸可以被包裝在MS2噬菌體或TMV等中，DNA內對照核酸可以被包裝在M13噬菌體等中。本領域技術人員己知這些包裝技術，如可參見張玉松等，假病毒的最新應用研究進展。醫學研究雜誌，37(6):116-118;張括等，RNA噬菌體病毒樣顆粒包裝機制及其應用研究進展.微生物與感染，3(2):111-114;陳信忠等，實時螢光定量RT-PCR檢測石斑魚病毒性神經壞死病.高技術通訊，16(4):431-434;18(3):107-108等。在本發明的第一方面的方法中，不同種探針(包括不同種靶核酸探針、不同種內對照核酸探針)之間所標記的螢光基團的螢光檢測波長互不相同，這樣能夠同時或快速地順序掃描不同的檢測波長，分別記錄下各種螢光基團的螢光變化，從而能夠進行同時檢測。在本文中，探針具有本領域技術人員所熟知的含義，其由為能與擴增出的靶核酸單鏈結合的單鏈DNA。通常，在每種探針的核苷酸序列的5'端標記螢光基團，3'端標記淬滅基團。優選其中各種探針標記有不同的螢光基團。優選螢光基團及其淬滅基團是市售的，如可以採用FANT/SYBR②GreenI、VIC/JOE/HEX、NED/TAMRA/Cy3、ROX/TexasRed衝和Cy5⑧等常規產品，它們的檢測波長互不相同，也可以委託公司合成標記有螢光標記的探針。在本發明的具體實施方式中，其中採用的標記有不同檢測波長的螢光標記的探針都是委託上海生工生物工程技術服務有限公司合成的，純度達到HPLC純，不含雜帶。對於在本發明的第一方面的方法中優選針對的靶核酸，也優選針對這些優選的靶核酸設計靶核酸探針的核苷酸序列，更優選靶核酸探針的核苷酸序列選自HBV的編碼S抗原的基因中的連續序列或其互補序列、HCV的5'非編碼區中的連續序列或其互補序列、和HIV的gag基因中的連續序列或其互補序列，最優選選自SeqIDNo:U或其互補序列、SeqIDNo:12或其互補序列、和SeqIDNos13或其互補序列。這些最優選的探針的核苷酸序列在同時檢測時不會結合其他靶核酸和內對照核酸。相應地，對於在本發明的第一方面的方法中優選針對的耙核酸，也優選針對這些優選的靶核酸設計引物對。在本文中，引物對具有本領域技術人員所熟知的含義，其由分別為單鏈DNA的上遊引物和下遊引物組成，能用於擴增相應基因或其片段。優選靶核酸引物所擴增的基因或片段選自HBV的編碼S抗原的基因或之中、HCV的5'非編碼區或之中、和HIV的gag基因或之中，最優選的靶核酸引物對選自SeqIDNo:l禾卩2、SeqIDNo-3禾卩4、以及SeqIDNo:5和6。另外，對於在本發明的第一方面的方法中優選使用的內對照核酸，也優選針對這些優選的內對照核酸設計內對照核酸探針的核苷酸序列，更優選內對照核酸探針的核苷酸序列選自新黴素抗藥性基因中的連續序列或其互補序列，最優選內對照核酸探針的核苷酸序列是SeqIDNo:14或15，SeqIDNo:14針對DNA內對照核酸，SeqIDNo:15針對RNA內對照核酸。這些最優選的探針的核苷酸序列在同時檢測時不會結合其他內對照核酸和靶核酸。相應地，對於在本發明的第一方面的方法中優選使用的內對照核酸，也優選針對這些優選的內對照核酸設計引物對。優選內對照核酸引物所擴增的基因或片段選自新黴素抗藥性基因或之中，最優選的內對照核酸引物對選自SeqIDNo:7和8、以及SeqIDNo:9和10。本領域技術人員能夠根據引物及相應需要PCR擴增的核酸來設計PCR反應條件。對於多重檢測，為了平衡不同種核酸的擴增條件，本發明人經過長期摸索，優化出的條件為PCR反應的每個循環的條件為94'C10秒、50°C10秒以及65°C45秒。在本發明的具體實施方式中，PCR反應優選先5(TC保溫2分鐘並94'C變性3分鐘，然後進行上述條件的45個循環；對於需要進行RT-PCR的反應來說，在前述PCR反應前還進行42"C保溫30分鐘，以進行反轉錄。在實時螢光PCR反應中，Ct值表示每個PCR反應管內螢光信號到達實時螢光PCR儀所默認設定的閾值時所經歷的循環數，其具有良好的再現性，因此可以用於作為判讀結果的優良指標。默認設定的閾值優選為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。優選在本發明的第一方面的方法中，對於步驟(3)，其中一種靶核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值^45，則這種靶核酸存在於樣品中；一種靶核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值〉45，而且相應內對照核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值〈30，則這種靶核酸不存在於樣品中。這是我們經過長期大量試驗摸索出來的經驗。其他情況，即一種靶核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值〉45，而且相應內對照核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值^30，則需要重新測量。這樣簡單的判讀用人工即可完成，避免了很複雜的試劑或儀器的使用。在第二方面，本發明提供了用於本發明第一方面所述方法的檢測試劑盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、內對照核酸、耙核酸引物對、內對照核酸引物對、一種或幾種靶核酸探針和內對照核酸探針，其中前述各種探針標記有螢光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的螢光基團的螢光檢測波長互不相同。其中，不同的試劑可以分裝在不同容器中，也可以選擇幾種長期保存而不發生化學反應的試劑合併保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容納上述試劑的容器，例如常規用於裝PCR、酶或核酸試劑的容器。檢測試劑盒中還可以有標籤或說明書，用以指示按照本發明第一方面所述方法進行操作。標籤可以貼在上述容器上，或者直接列印到上述容器上，也可以提供獨立的說明書。根據需要，如方便運輸、存放的需要，試劑盒還可以進一步包裝進更大的包裝中，這樣的產品也在本發明的範圍內。對於本發明第二方面的檢測試劑盒，其中優選的各成分如本發明第一方面所述的那樣優選。優選諸如，其中還進一步包括反轉錄酶；其中還進一步包括磁珠提取法所需試劑，如磁珠、裂解液、洗滌液等；其中內對照核酸是新黴素抗藥性基因或其片段，優選所述基因或其片段被包裝在病毒樣顆粒內；各種探針標記有不同的螢光基團；其中靶核酸探針的核苷酸序列選自HCV的5'非編碼區中的連續序列或其互補序列、HIV的gag基因中的連續序列或其互補序列、HBV的編碼S抗原的基因中的連續序列或其互補序列；和/或，其中內對照核酸探針的核苷酸序列選自新黴素抗藥性基因中的連續序列或其互補序列。最優選其中內對照核酸、各種探針、各種引物的核苷酸序列選自本說明書所附的序列表中的序列。在第三方面，本發明提供了本發明第二方面所述的檢測試劑盒在製備用於本發明第一方面所述方法的檢測試劑產品中的應用。檢測試劑產品可以是檢測試劑盒本身，也可以是合併裝有多個檢測試劑盒的更大包裝產品。根據前文所述，本領域技術人員很容易理解其中檢測試劑盒的成分以及其中方法的流程。為了便於理解，以下將通過具體的附圖、實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。圖1顯示了示例性的本發明實施例中的二重實時PCR的檢測圖譜。圖2顯示了示例性的本發明實施例中的三重實時PCR的檢測圖譜。10圖3顯示了示例性的本發明實施例中的四重實時PCR的檢測圖譜。圖4顯示了示例性的本發明實施例中的五重實時PCR的檢測圖譜。具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社,北京,中國,2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社,北京,中國,1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施。其中所用的探針、引物可以委託上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實施例1雙重實時PCR反應1.DNA類耙核酸雙重RealTime(實時)PCR反應用於檢測HBVDNA和DNA內對照核酸(SeqIDNo:16)引物擴增HBVDNA的引物為HBV-FQ-L1(SeqIDNo:1)和HBV-FQ隱R1(SeqIDNo:2);擴增DNA內對照核酸的引物為IC309L1(SeqIDNo:7)和IC309R1(SeqIDNo:8)螢光探針HBV的螢光探針的核苷酸序列為HBV-FQ-P1(SeqIDNo:11)，其5，端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；DNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-FQ-P1(SeqIDNo:14)，其5'端採用ROX標記，3'端標記相應的淬滅基團。PCR反應條件PCR反應體系總體積為60ul，其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.3lOmM;KC150mM;dNTP各0.2rnM;TaqDNA聚合酶2U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(V/V);內對照核酸各100個拷貝數；各種靶核酸樣品均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下tableseeoriginaldocumentpage11使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM和ROX檢測波長。結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，螢光閾值設定為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如FAM層Ct值〉45且ROX層Ct值〈30，則判定為HBVDNA陰性；如FAM層Ct值M5且ROX層Ct值^30,則需要重檢；如FAM層Ct值￡45，則判定為HBVDNA陽性。具體檢測圖譜如圖1A所示。2.RNA類靶核酸雙重實時PCR反應用於檢測HCVRNA和RNA內對照核酸(其轉錄的DNA序列同SeqIDNo:17)引物擴增HCVRNA的引物為HCV國F-L1(SeqIDNo:3)和HCV-F-R1(SeqIDNo:4);擴增RNA內對照核酸的引物為IC-F-L2(SeqIDNo:9)和IC-F-R2(SeqIDNo:10)。螢光探針HCV的螢光探針的核苷酸序列為HCV-FQ-P1(SeqIDNo:12)，其5'端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；RNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-F-P2(SeqIDNo:15)，其5'端採用HEX標記，3'端標記相應的淬滅基團。PCR反應條件PCR反應體系總體積為60lU，其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.3lOmM;KC150mM;dNTP各0.2mM;TaqDNA聚合酶2U;M-MLV反轉錄酶25U;RNasin10U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(V/V);內對照核酸各100個拷貝數；各種靶核酸樣品均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下tableseeoriginaldocumentpage12使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM和HEX檢測波長。結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，螢光閾值設定為315個循環的螢光信號的標準偏差的10倍。。如FAM層Ct值〉45且HEX層Ct值〈30，則判定為HCVRNA陰性；如FAM層Ct值〉45且HEX層Ct值S0，則需要重檢；如FAM層Ct值^45，則判定為HCVRNA陽性。具體檢測圖譜如圖1B所示。用於檢測HIV-1RNA和RNA內對照核酸(其轉錄的DNA序列同SeqIDNo:17)引物擴增HCVRNA的引物為HIV-F-L1(SeqIDNo:5)和HIV-F-R1(SeqIDNo:6);擴增RNA內對照核酸的引物為IC-F-L2(SeqIDNo:9)和IC-F-R2(SeqIDNo:10)。螢光探針HIV的螢光探針的核苷酸序列為HIV-F-P1(SeqIDNo:13),其5'端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；RNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-F-P2(SeqIDNo:15)，其5'端採用HEX標記，3'端標記相應的淬滅基團。PCR反應條件PCR反應體系總體積為60Ul，其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.310mM;KC150mM;dNTP各0.2mM;TaqDNA聚合酶2U;M-MLV反轉錄酶25U;RNasin10U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(V/V);內對照核酸各100個拷貝數；各種靶核酸樣品均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下42°C30分鐘50°C2分鐘94'C3分鐘(94°CIO秒50°C1。秒65°C45秒)*45個循環使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM和HEX檢測波長。結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，值螢光閾值設定為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如FAM層Ct值〉45且HEX層Ct值〈30,則判定為HIV-1RNA陰性；如FAM層Ct值〉45且HEX層Ct值^30，則需要重檢；如FAM層Ct值^45，則判定為HIV-1RNA陽性。具體檢測圖譜如圖1C所示。實施例2三重實時PCR反應1.RNA類靶核酸三重實時PCR反應用於檢測HCVRNA、HIV-1RNA和RNA內對照核酸(其轉錄的DNA序列同SeqIDNo:17)引物擴增HCVRNA的引物為HCV-F-L1(SeqIDNo:3)和HCV-F-R1(SeqIDNo:4);擴增HCVRNA的引物為HIV-F-U(SeqIDNo:5)和HIV-F-R1(SeqIDNo:6);擴增RNA內對照核酸的引物為IC-F-L2(SeqIDNo:9)和IC-F-R2(SeqIDNo:10)。螢光探針HCV的螢光探針的核苷酸序列為HCV-FQ-P1(SeqIDNo:12)，其5'端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；HIV的螢光探針的核苷酸序列為HIV-F-P1(SeqIDNo:13)，其5，端採用ROX標記，3'端標記相應的淬滅基團；RNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-F-P2(SeqIDNo:15)，其5'端採用HEX標記，3'端標記相應的淬滅基團。PCR反應條件PCR反應體系總體積為60ul，其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.3lOmM;KC150mM;dNTP各0.2mM;TaqDNA聚合酶2U;M-MLV反轉錄酶25U;RNasin10U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(V/V);內對照核酸各100個拷貝數；各種靶核酸樣品均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下:42°C30分鐘50°C2分鐘94°C3分鐘(94°CIO秒50°CIO秒65°C45秒)*45個循環使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM、ROX和HEX檢測波長。結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，螢光閾值設定為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如FAM層Ct值〉45且HEX層Ct值《0,則判定為HCVRNA陰性；如FAM層Ct值〉45且HEX層Ct值^30，則需要重檢；如FAM層Ct值^45，則判定為HCVRNA陽性。如ROX層Ct值〉45且HEX層Ct值〈30，則判定為HIV-1RNA陰性；如ROX層Ct值〉45且HEX層Ct值^30,則需要重檢；如ROX層Ct值545，則判定為HIV-1RNA陽性。具體檢測圖譜如圖2所示。實施例3四重實時PCR反應1.DNA/RNA類靶核酸四重實時PCR反應1.1用於檢測HBVDNA、HCVRNA、DNA內對照核酸(SeqIDNo:16)和RNA內對照核酸14(其轉錄的DNA序列同SeqIDNo:17)1.1.1弓l物擴增HBVDNA的引物為HBV-FQ-L1(SeqIDNo:1)和HBV-FQ-R1(SeqIDNo:2);擴增HCVRNA的引物為HCV-F-L1(SeqIDNo:3)和HCV-F-R1(SeqIDNo:4);擴增DNA內對照核酸的引物為IC309L1(SeqIDNo:7)和IC309R1(SeqIDNo:8);擴增RNA內對照核酸的引物為IC-F-L2(SeqIDNo:9)和IC-F-R2(SeqIDNo:10)。l丄2螢光探針HBV的螢光探針的核苷酸序列為HBV-FQ-P1(SeqIDNo:11),其5'端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；HCV的螢光探針的核苷酸序列為HCV-FQ-P1(SeqIDNo:12)，其5'端採用TAMRA標記，3'端標記相應的淬滅基團；DNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-FQ-Pl(SeqIDNo:14)，其5'端採用ROX標記，3'端標記相應的淬滅基團；RNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-F-P2(SeqIDNo:15)，其5'端採用HEX標記，3'端標記相應的淬滅基團。1.1.3PCR反應條件PCR反應體系總體積為60lM，其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.3lOmM;KC150mM;dNTP各0.2mM;TaqDNA聚合酶2U;M-MLV反轉錄酶25U;RNasin10U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(v/v);內對照核酸各100個拷貝數；各種靶核酸均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下:42'C30分鐘50'C2分鐘94'C3分鐘(94'CIO秒50°CIO秒65。C45秒)*45個循環使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM、ROX、TAMRA和HEX檢測波長。l丄4結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，螢光閾值設定為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如FAM層Ct值〉45且ROX層Ct值〈0,則判定為HBVDNA陰性；如FAM層a值M5且ROX層Ct值230，則需要重檢；如FAM層Ct值45，則判定為HBVDNA陽性。如TAMRA層Ct值〉45且HEX層Ct值"0，則判定為HCVRNA陰性；如TAMRA層Ct值〉45且HEX層Ct值^30,則需要重檢；如TAMRA層Ct值545，則判定為HCVRNA陽性。具體檢測圖譜如圖3A所示。1.2用於檢測HBVDNA、HIV-1RNA、DNA內對照核酸(SeqIDNo:16)和RNA內對照核酸(其轉錄的DNA序列同SeqIDNo:17)1.2.1引物擴增HBVDNA的引物為HBV-FQ-L1(SeqIDNo:1)禾PHBV-FQ-R1(SeqIDNo:2);擴增HIVRNA的引物為HIV-F-L1(SeqIDNo:5)和HIV-F-R1(SeqIDNo:6);擴增DNA內對照核酸的引物為IC309L1(SeqIDNo:7)和IC309R1(SeqIDNo:8);擴增RNA內對照核酸的引物為IC-F-L2(SeqIDNo:9)和IC-F-R2(SeqIDNo:10)。1.2.2螢光探針HBV的螢光探針的核苷酸序列為HBV-FQ-P1(SeqIDNo:11)，其5'端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；HIV的螢光探針的核苷酸序列為HIV-F-P1(SeqIDNo:13)，其5'端採用Cy5標記，3'端標記相應的淬滅基團；DNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-FQ-P1(SeqIDNo:14)，其5'端採用ROX標記，3'端標記相應的淬滅基團；RNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-F-P2(SeqIDNo:15)，其5'端採用HEX標記，3'端標記相應的淬滅基團。1.2.3PCR反應條件PCR反應體系總體積為60P1,其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.310mM;KC150mM;dNTP各0.2mM;TaqDNA聚合酶2U;M-MLV反轉錄酶25U;RNasin10U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(V/V);內對照核酸各100個拷貝數；各種靶核酸均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下:tableseeoriginaldocumentpage16使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM、ROX、Cy5和HEX檢測波長。1.2.4結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，螢光閾值設定為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如FAM層Ct值"5且ROX層Ct值〈30，則判定為HBVDNA陰性；如FAM層Ct值〉45且ROX層Ct值^30，則需要重檢；如FAM層Ct值^45,則判定為HBVDNA陽性。如Cy5層Ct值〉45且HEX層Ct值〈30,則判定為HIV-1RNA陰性；如Cy5層Ct值〉45且HEX層Ct彪30,則需要重檢；如Cy5層Ct值95，則判定為HIV-1RNA陽性。具體檢測圖譜如圖3B所示。實施例4五重實時PCR反應1.DNA/RNA類靶核酸五重實時PCR反應1.1用於檢測冊VDNA、HCVRNA、HIV-1RNA、DNA內對照核酸(SeqIDNo:16)和RNA內對照核酸(其轉錄的DNA序列同SeqIDNo:17)1.1.1引物擴增HBVDNA的引物為HBV-FQ誦L1(SeqIDNo:1)和HBV-FQ-R1(SeqIDNo:2);擴增HCVRNA的引物為HCV-F-L1(SeqIDNo:3)和HCV-F-R1(SeqIDNo:4);擴增HIVRNA的引物為HIV-F-L1(SeqIDNo:5)和HIV-F-R1(SeqIDNo:6);擴增DNA內對照核酸的引物為IC309L1(SeqIDNo:7)和IC309R1(SeqIDNo:8);擴增RNA內對照核酸的引物為IC-F-L2(SeqIDNo:9)和IC-F-R2(SeqIDNo:10)。1.1.2螢光探針HBV的螢光探針的核苷酸序列為HBV-FQ-P1(SeqIDNo:11)，其5'端採用FAM標記，3'端標記相應的淬滅基團；HCV的螢光探針的核苷酸序列為HCV-FQ-P1(SeqIDNo:12)，其5'端採用TAMRA標記，3'端標記相應的淬滅基團；HIV的螢光探針的核苷酸序列為HIV-F-P1(SeqIDNo:13)，其5'端採用Cy5標記，3'端標記相應的淬滅基團；DNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-FQ-P1(SeqIDNo:14)，其5'端採用ROX標記，3'端標記相應的淬滅基團；RNA內對照核酸探針的核苷酸序列為IC-F-P2(SeqIDNo:15)，其5'端採用HEX標記，3'端標記相應的淬滅基團。1.1.3PCR反應條件PCR反應體系總體積為60yl，其中各組分的濃度分別為Tris.HClpH8.3lOmM:KC150mM;dNTP各0.2mM;TaqDNA聚合酶2U;M-MLV反轉錄酶25U;RNasin10U;各種引物各15pM/種；各種螢光探針各5pM/種；甘油5%(V/V);內對照核酸各100個拷貝數；各種耙核酸均為國家衛生部臨檢中心標準樣品。反應熱循環條件如下:tableseeoriginaldocumentpage17使用ABI7500實時螢光PCR儀，螢光採集FAM、ROX、TAMRA、Cy5和HEX檢測波長。l丄4結果判斷結果分析條件設定ABI7500螢光儀的基線自動設定，螢光閾值設定為315循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如FAM層Ct值〉45且ROX層Ct值〈0，則判定為HBVDNA陰性；如FAM層Ct值〉45且ROX層Ct值^30，則需要重檢；如FAM層Ct值^45，則判定為HBVDNA陽性。如TAMRA層Ct值M5且HEX層Ct值〈30，則判定為HCVRNA陰性；如TAMRA層Ct值〉45且HEX層Ct值SO，則需要重檢；如TAMRA層Ct值S45,則判定為HCVRNA陽性。如Cy5層Ct值〉45且HEX層Ct值〈30，則判定為HIV-1RNA陰性；如Cy5層Ct值〉45且HEX層Ct值^30，則需要重檢；如Cy5層Ct值^45，貝,定為HIV-1RNA陽性。具體檢測圖譜如圖4所示。序列表上海浩源生物科技有限公司單管中多重耙核酸的PCR檢測方法及其試劑盒17117DNA人工序列1tgtcctggttatcgctg17220DNA<213〉人工序列2cagaagaaccaacaag肌ga203<211〉20DNA人工序列3ttcacgcagaaagcgtctag20422DNA人工序列4aattccggtgtactcaccggtt22530DNA<213〉人工序列5agtggggggacatcaagcagccatgcaaat<210〉628DNA人工序列196tactagtagttcctgctatgtcacttcc723DNA人工序列7tcactgaagcgggagggactggc823DNA人工序列8gcaggtagccggatcaagcgtat922DNA人工序列9cttcagcaatatcacgggtage1023DNA人工序列10gatgcctgcttgccgaatatcat1121DNA人工序列11tgtgtctgcggcgttttatca1223DNA人工序列12atggcgttagtatgagtgtc魄282323232321231328DNA人工序列13accatoaatgaggaagctgcagaatggg281420DNA人工序列14ccgccgcattgcatcagccatgatg251521DNA人工序列15cctgatagcggtccgccacaccc2316142DNA人工序列16gcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatacttt60ctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcag120ccagtcccttcccgcttcagtga14217124RNA人工序列17cuucagcaauaucacggguagccaacgcuauguccugauagcgguccgccacacccagc60cggccacagucgaugaauccagaaaagcggccauuuuccaccaugauauucggcaagcag120gcauc12權利要求1，在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中一種或幾種靶核酸的實時PCR方法，其包括，(1)在所述單個PCR反應容器中混合樣品、DNA聚合酶、dNTP、內對照核酸、靶核酸引物對、內對照核酸引物對、一種或幾種靶核酸探針和內對照核酸探針，其中前述各種探針標記有螢光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的螢光基團的螢光檢測波長互不相同；(2)進行PCR反應，並實時檢測不同波長的螢光；(3)根據螢光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有一種或幾種靶核酸存在於樣品中。2，前述任一權利要求所述的方法，其中在步驟(1)中所述單個PCR反應容器中還進一步混合有反轉錄酶。3，前述任一權利要求所述的方法，其中靶核酸優選有一種、兩種或三種，其中每種靶核酸分別是RNA或DNA，優選是病原體RNA或DNA，更優選是病毒RNA或DNA，最優選是HCVRNA、HIVRNA或HBVDNA。4，前述任一權利要求所述的方法，其中樣品是經過磁珠提取法處理過的樣品。5，前述任一權利要求所述的方法，其中內對照核酸是新黴素抗藥性基因或其片段，優選所述基因或其片段被包裝在病毒樣顆粒內。6，前述任一權利要求所述的方法，其中各種探針標記有不同的螢光基團。7，前述任一權利要求所述的方法，其中靶核酸探針的核苷酸序列選自HCV的5'非編碼區中的連續序列或其互補序列、HIV的gag基因中的連續序列或其互補序列、和HBV的編碼S抗原的基因中的連續序列或其互補序列。8，前述任一權利要求所述的方法，其中PCR反應的每個循環的條件為94°C10秒、50°C10秒以及65'C45秒。9，前述任一權利要求所述的方法，其中一種靶核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值545,則這種靶核酸存在於樣品中；一種靶核酸的螢光檢測結果計算出的Ct值〉45,而且相應內對照核酸的螢光檢測結果計算出的》值<30，則這種靶核酸不存在於樣品中。10，用於權利要求1所述方法的檢測試劑盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、內對照核酸、靶核酸引物對、內對照核酸引物對、一種或幾種耙核酸探針和內對照核酸探針，其中前述各種探針標記有螢光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的螢光基團的螢光檢測波長互不相同。11，前述任一權利要求所述的檢測試劑盒，其中還進一步包括反轉錄酶。12，前述任一權利要求所述的檢測試劑盒，其中還進一步包括磁珠提取法所需試劑。13，前述任一權利要求所述的檢測試劑盒，其中內對照核酸是新黴素抗藥性基因或其片段，優選所述基因或其片段被包裝在病毒樣顆粒內。14，前述任一權利要求所述的檢測試劑盒，其中各種探針標記有不同的螢光基團；其中耙核酸探針的核苷酸序列選自HCV的5'非編碼區中的連續序列或其互補序列、HIV的gag基因中的連續序列或其互補序列、和HBV的編碼S抗原的基因中的連續序列或其互補序列；和/或，其中內對照核酸探針的核苷酸序列選自新黴素抗藥性基因中的連續序列或其互補序列。15,前述任一權利要求所述的檢測試劑盒在製備用於前述任一權利要求所述的方法的檢測試劑產品中的應用。全文摘要本發明涉及在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中一種或幾種靶核酸的實時PCR方法，其包括，(1)在所述單個PCR反應容器中混合樣品、DNA聚合酶、dNTP、內對照核酸、靶核酸引物對、內對照核酸引物對、一種或幾種靶核酸探針和內對照核酸探針，其中前述各種探針標記有螢光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的螢光基團的螢光檢測波長互不相同；(2)進行PCR反應，並實時檢測不同波長的螢光；和(3)根據螢光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有一種或幾種靶核酸存在於樣品中。另外，本發明還涉及用於上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的製備應用等。該多重檢測方法無需專門設備，因此可廣泛用於實驗室研究、食品安全、醫藥衛生等眾多領域。文檔編號C12Q1/68GK101624629SQ200910157409公開日2010年1月13日申請日期2009年7月24日優先權日2009年7月24日發明者葉成果,張文豔,李振勇,楊國翠,黃道培,龔華斐申請人:上海浩源生物科技有限公司