精漿鋅檢測試劑的製作方法

2023-05-10 22:44:36

專利名稱：精漿鋅檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種體外診斷試劑，具體適合於精漿鋅定量檢測。
背景技術：
精漿鋅在男性精液分析中一直佔有很重要的地位，鋅參與精子生成、受精的各個環節中都起作用，鋅也是前列腺功能的評價指標之一。
精漿鋅定量測定主要有原子吸收分光光度法、PAR顯色法、5-Br-PAPS顯色法。原子吸收分光光度法準確性高、方法靈敏，但需要用到特殊儀器。PAR顯色法操作簡單，適於常規開展，但嚴格來說其方法學評價指標不高，回收率和幹擾率不理想。5-Br-PAPS顯色法是世界衛生組織(WHO)推薦的精漿鋅檢測方法，操作簡單，試劑穩定，其方法學評價指標明顯優於PAR顯色法，此方法試劑配方為保密配方。
為了更好促進男性不育檢測的發展，建立一種方法特異、靈敏度高、能適合常規開展的精漿鋅檢測試劑及方法顯得特別重要。

發明內容本發明的目的就是解決現有技術的問題，提出一種高方法學評價指標、回收率和幹擾率好、並適於常規開展的精漿鋅定量檢測試劑。
為實現上述目的，本發明提出了一種精漿鋅檢測試劑，包括用於屏蔽無機物的顯色液A、用於屏蔽有機物的顯色液B和含有鋅離子的鋅標準品，所述顯色液A為含有硫脲或硫脲衍生物、氟化物和顯色劑5-Br-PAPS(2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol，disodium salt，dihydrate)的緩衝液。
進一步地，所述顯色液A還包括焦磷酸鹽。所述顯色液B為含酮肟類有機物的無水有機醇溶液。
優選地，所述顯色液A中的氟化物為氟化鈉，焦磷酸鹽為焦磷酸鈉，顯色液B中的酮肟類有機物為丁二酮肟，無水有機醇為無水乙醇。
按重量百分比計，所述顯色液A中的硫脲含量為2-6％、氟化鈉含量為0.1-0.2％、焦磷酸鈉含量為0.05-0.1％、5-Br-PAPS含量為0.15-0.45％；所述顯色液B中的丁二酮肟含量為0.5-2.0％；所述鋅標準品中的鋅離子含量不超過1.5mmol/L。
所述鋅標準品為一個或多個鋅離子含量不超過1.5mmol/L的不同濃度的標準品。
為實現上述目的，本發明還提出了一種利用上述的精漿鋅檢測試劑檢測精漿鋅含量的方法，包括以下步驟
1)配製反應液將顯色液A和顯色液B按一定體積比混合；2)製作樣本將適量精漿用去離子水以一定比例稀釋；3)將稀釋後的精漿與步驟1)所述的反應液混合後裝入測定管，將鋅標準品與步驟1)的反應液混合後裝入測定管；4)檢測用儀器檢測精漿和鋅標準品的吸光度，並計算精漿中的鋅含量。
步驟4)所述的儀器為酶標儀。
所述鋅標準品的用量在酶標儀上比色時吸光度不超過3.0的用量。
步驟4)所述的吸光度檢測是在波長為450nm或560nm處進行比色，步驟4)所述的裝精漿的測定管和裝鋅標準品的測定管特性相同。
5-Br-PAPS與鋅離子結合後，產物顏色深淺與鋅離子濃度成正比，通過酶標儀檢測測定管反應產物的顏色深淺並同時結合鋅標準管反應物的顏色深淺，從而計算出測定管鋅離子濃度。
上述檢測精漿鋅含量的方法所用的檢測試劑包括用於屏蔽無機物的顯色液A、用於屏蔽有機物的顯色液B和含有鋅離子的鋅標準品，所述顯色液A為至少含有硫脲或硫脲衍生物、氟化物、5-Br-PAPS的磷酸鹽緩衝液。所述顯色液A中還可以加入焦磷酸鹽。所述顯色液B還可以為含酮肟類有機物的無水有機醇溶液。所述顯色液A中的氟化物優選氟化鈉，焦磷酸鹽優選焦磷酸鈉，顯色液B中的酮肟類有機物優選丁二酮肟，無水有機醇優選無水乙醇。
一種精漿鋅檢測試劑盒，包括顯色液A 120-200ul、顯色液B 20-80ul和鋅標準品；所述顯色液A包含有硫脲或硫脲的衍生物含量為2-6％、氟化物含量為0.1-0.2％的磷酸鹽緩衝液；所述顯色液B是包含有酮肟類有機物含量為0.5-2.0％的無水有機醇溶液；所述鋅標準品中鋅離子含量不超過1.5mmol/L。
採用上述技術方案，結合下面將要詳述的實施例，本發明突出的技術效果在於1)方法學評價指標高，達到WHO推薦產品的性能水平。2)回收率和幹擾率好，通常所用的精漿鋅檢測試劑中的顯色液A都是只含有硫脲或硫脲的衍生物，或者只含有氟化物，這兩種檢測試劑的回收率不理想，其他無機離子對顯色的平均幹擾率絕對值大於5％，而本發明既含有硫脲或硫脲的衍生物，又含有氟化物，通過兩類物質的協同作用，回收率和幹擾率較理想，特別是將硫脲或硫脲的衍生物、氟化物、5-Br-PAPS和焦磷酸鹽四者合用時，回收率達到95～105％，幹擾率絕對值小於3％。3)操作簡單、快捷，適合臨床常規檢測。4)實際檢測證明，通過配備顯色液和稀釋樣本的比例，顯色後的產物可分別在450nm、560nm處比色，適合不同條件的實驗室操作。5)採用標準曲線檢測結果可自動從酶標儀輸出。
具體實施方式實施例一、一種精漿鋅檢測試劑，是由下列成份組成(1)顯色液A含硫脲或衍生物含量為2-6％、氟化物含量為0.1-0.2％、焦磷酸鹽含量為0.05-0.1％、5-Br-PAPS含量為0.15-0.45％的磷酸鹽緩衝液；(2)顯色液B含酮肟類有機物含量為0.5-2.0％的無水有機醇溶液；(3)鋅標準品鋅離子含量不超過1.5mmol/L的一個或一個以上的鋅標準品。
所述鋅標準品為按如下方法製得的標準品貯存液和一個或一個以上的其它標準品1)標準品貯存液鋅離子含量為5-15mmol/L的去離子溶液；2)標準1去離子水；3)標準2取1毫升標準貯存液，用去離子水定容至1000毫升，4℃保存；4)標準3取2毫升標準貯存液，用去離子水定容至1000毫升，4℃保存；5)標準4取4毫升標準貯存液，用去離子水定容至1000毫升，4℃保存；6)標準5取6毫升標準貯存液，用去離子水定容至1000毫升，4℃保存；7)標準6取8毫升標準貯存液，用去離子水定容至1000毫升，4℃保存；8)標準7取10毫升標準貯存液，用去離子水定容至1000毫升，4℃保存。
實施例二、與實施例一不同的是所述顯色液A中的含硫脲或衍生物優選硫脲，氟化物優選氟化鈉，焦磷酸鹽優選焦磷酸鈉，所述顯色液B中的酮肟類有機物優選丁二酮肟，無水有機醇優選無水乙醇。硫脲含量為6％、氟化鈉含量為0.1％、焦磷酸鈉含量為0.1％、5-Br-PAPS含量為0.45％的磷酸鹽緩衝液；丁二酮肟含量為2.0％的無水有機醇溶液；鋅標準品為鋅離子含量不超過1.5mmol/L的7個鋅標準品。此配方中硫脲和5-Br-PAPS濃度大，對無機物的屏蔽性好，加大了檢測的線性範圍，超過此值時對於臨床檢測沒有實際意義。
硫脲的衍生物可以是硫代氨基脲、丙烯基硫脲等。酮肟還可以是丙酮肟和二乙醯一肟。
實施例三、與實施例二不同的是硫脲含量為2％、氟化鈉含量為0.2％、焦磷酸鈉含量為0.05％、5-Br-PAPS含量為0.15％的磷酸鹽緩衝液；丁二酮肟含量為0.5％的無水有機醇溶液；鋅標準品為鋅離子含量不超過1.5mmol/L的7個鋅標準品。此配方中硫脲和5-Br-PAPS濃度小，可增強檢測的靈敏度，低於此濃度時，會因為檢測的線性範圍偏小而致臨床上含鋅濃度高的樣本檢測不出。
實施例四、一種根據實施例一、二、三精漿鋅檢測試劑製作的試劑盒，其中顯色液A為120-200ul、顯色液B為20-80ul、鋅標準品中的每個標準品用量是在酶標儀上比色時吸光度不超過3.0的用量。
上述試劑盒的優選方案是顯色液A 150ul、顯色液B 40ul、鋅標準品包括至少一個標準品，每個標準品50ul。
實施例五、一種精漿鋅檢測試劑的製備方法，包括如下步驟A、顯色液A的製作步驟1)、稱取硫脲20-60g，氟化鈉1-2g，焦磷酸鈉0.5-1.0g，攪拌溶於800ml pH7.40.2M磷酸鹽緩衝液，加入0.5-1.5mg/ml 5-Br-PAPS 30ml，攪拌溶解；2)、用磷酸鹽緩衝液定容至1000ml，調節pH至7.2-7.6，過濾，4℃貯存；B、顯色液B的製作步驟3)、稱取丁二酮肟0.5-2.0g，溶於100ml無水乙醇，4℃貯存；C、鋅標準液貯存液(5-15mmol/L)的製作步驟4)、將氧化鋅粉末110℃烘烤，精確稱取0.0407-0.1221g氧化鋅加入去離子水約10ml、濃鹽酸0.3ml，溶解完全後加入50ml去離子水混勻，再加入疊氮鈉0.5g，待其溶解後用去離子水在容量瓶中稀釋至100ml，4℃貯存。
實施例六、一種精漿鋅檢測試劑的製備方法，包括如下步驟A、顯色液A的製作步驟1)稱取硫脲40g，氟化鈉1.5g，焦磷酸鈉0.75g，攪拌溶於800ml pH7.4 0.2M磷酸鹽緩衝液，加入1mg/ml 5-Br-PAPS 30ml，攪拌溶解；2)用磷酸鹽緩衝液定容至1000ml，調節pH至7.4，過濾，4℃貯存；B、顯色液B的製作步驟3)稱取丁二酮肟4.7601g，溶於500ml無水乙醇，4℃貯存；C、鋅標準液貯存液(10mmol/L)的製作步驟4)將氧化鋅粉末110℃烘烤，精確稱取0.0814g氧化鋅加入去離子水約10ml、濃鹽酸0.3ml，溶解完全後加入50ml去離子水混勻，再加入疊氮鈉0.5g，待其溶解後用去離子水在容量瓶中稀釋至100ml，4℃貯存。
實施例七、用精漿鋅檢測試劑檢測精漿鋅含量的方法為1)配製反應液選擇上述試劑中的任意一種，將顯色液A和顯色液B按一定體積比混合；2)製作樣本將適量精漿用去離子水以一定比例稀釋；3)將稀釋後的精漿與步驟1)所述的反應液混合後裝入測定管，將鋅標準品與步驟1)的反應液混合後裝入測定管；4)檢測根據配備顯色液和稀釋樣本的比例，用酶標儀在450nm或560nm處比色，檢測精漿和鋅標準品的吸光度，並計算精漿中的鋅含量。
實施例八、用精漿鋅檢測試劑檢測精漿鋅含量，具體步驟為
一、試劑準備臨用前配製反應液。將顯色液A與顯色液B按相應的體積比4∶1混合。
二、樣本準備將2000g精液標本離心10分鐘，留取精漿，在無離子Eppendrof管內以去離子水1∶61稀釋精漿，充分混勻。
三、標準曲線製備取無離子Eppendrof管5支，將100umol/L鋅標準液以去離子水稀釋配製為80、60、40、20和10umol/L濃度的鋅標準液。以去離子水作為0umol/L標準液。將共7個濃度的標準液分別加入對應的7個標準管中。取7個濃度只是為了取平均值，使結果更精確。當然也可以是2、3、4、5或6個濃度。
四、檢測步驟根據配備顯色液和稀釋樣本的比例，用酶標儀在450nm或560nm處比色。在去離子微孔內完成操作，加樣方法如下表1(用酶標儀在450nm處比色)和表2(用酶標儀在560nm處比色)，每個測試均設復孔表1
表2
五、比色與計算根據本技術領域的基礎知識，標準管的吸光度/標準管的濃度＝測定管的吸光度/測定管的濃度，標準管的濃度是已知的，根據檢測步驟檢測出的標準管和測定管的吸光度，則可以計算出標準管的濃度＝標準管的吸光度/測定管的吸光度*測定管的濃度，即得出被檢測精漿的濃度。標準管和測定管的吸光度可以採用450nm處比色得出的吸光度，也可以採用560nm處比色得出的吸光度。
用酶標儀為簡化操作，標準液濃度乘以標本稀釋係數(61)後，將所得參數輸入酶標儀建立標準曲線，以適當的曲線擬合。若以560nm比色，則標準曲線以平滑曲線(二次方)方式擬合；若以450nm比色，則標準曲線以立方曲線(首選)或平滑曲線(二次方)方式擬合。儀器所判讀結果即為已計算標本稀釋係數的精漿實際鋅濃度(mmol/L)。
標準實際濃度(umol/L) 輸入酶標儀的應用濃度(mmol/L)0010 0.6120 1.2240 2.4460 3.6680 4.88100 6.10酶標儀列印輸出結果，即為檢測標本真實濃度(mmol/L)。
六、結果報告鋅最終檢測結果以「μmol/一次射精」方式報告一次射精鋅量(μmol)＝精漿鋅濃度(mmol/L)×一次射精的精液總體積(ml)七、臨床適用性1、鋅是前列腺功能指標之一，精漿鋅、精漿酸性磷酸酶、精漿檸檬酸三個項目的聯合定量檢測，對前列腺炎具有診斷價值。
2、鋅可幫助判斷性腺分泌功能。
權利要求
1.精漿鋅檢測試劑，包括用於屏蔽無機物的顯色液A、用於屏蔽有機物的顯色液B和含有鋅離子的鋅標準品，其特徵在於所述顯色液A是含有硫脲或硫脲的衍生物、氟化物和顯色劑5-Br-PAPS的緩衝液。
2.如權利要求1所述的精漿鋅檢測試劑，其特徵在於所述顯色液A還包括焦磷酸鹽。
3.如權利要求1所述的精漿鋅檢測試劑，其特徵在於所述顯色液B為含酮肟類有機物的無水有機醇溶液。
4.如權利要求3所述的精漿鋅檢測試劑，其特徵在於所述顯色液A中的氟化物為氟化鈉，焦磷酸鹽為焦磷酸鈉，顯色液B中的酮肟類有機物為丁二酮肟，無水有機醇為無水乙醇。
5.如權利要求4所述的精漿鋅檢測試劑，其特徵在於按重量百分比計，所述顯色液A中的硫脲含量為2-6％、氟化鈉含量為0.1-0.2％、焦磷酸鈉含量為0.05-0.1％、5-Br-PAPS含量為0.15-0.45％；所述顯色液B中的丁二酮肟含量為0.5-2.0％；所述鋅標準品中的鋅離子含量不超過1.5mmol/L。
6.如權利要求5所述的精漿鋅檢測試劑，其特徵在於所述鋅標準品為一個或多個鋅離子含量不超過1.5mmol/L的不同濃度的標準品。
7.如權利要求1-6中任一項所述的精漿鋅檢測試劑檢測精漿鋅含量的方法，包括以下步驟1)配製反應液將顯色液A和顯色液B按一定體積比混合；2)製作樣本將適量精漿用去離子水以一定比例稀釋；3)將稀釋後的精漿與步驟1)所述的反應液混合後裝入測定管，將鋅標準品與步驟1)的反應液混合後裝入測定管；4)檢測用儀器檢測精漿和鋅標準品的吸光度，並計算精漿中的鋅含量。
8.如權利要求7所述的檢測精漿鋅含量的方法，其特徵在於步驟4)所述的儀器為酶標儀，鋅標準品的用量在酶標儀上比色時吸光度不超過3.0的用量。
9.如權利要求7所述的檢測精漿鋅含量的方法，其特徵在於步驟4)所述的吸光度檢測是在波長為450nm或560nm處進行比色。
10.一種精漿鋅檢測試劑盒，其特徵在於包括顯色液A120-200ul、顯色液B20-80ul和鋅標準品；所述顯色液A包含有硫脲或硫脲的衍生物含量為2-6％、氟化物含量為0.1-0.2％的磷酸鹽緩衝液；所述顯色液B是包含有酮肟類有機物含量為0.5-2.0％的無水有機醇溶液；所述鋅標準品中鋅離子含量不超過1.5mmol/L。
全文摘要
本發明公開了一種精漿鋅檢測試劑，包括用於屏蔽無機物的顯色液A、用於屏蔽有機物的顯色液B和含有鋅離子的鋅標準品，所述顯色液A為含有硫脲或硫脲衍生物、氟化物、顯色劑5－Br－PAPS的緩衝液。該精漿鋅定量檢測試劑方法學評價指標高，回收率和幹擾率較理想，回收率可控制在95～105％範圍內，幹擾率絕對值小於3％，操作簡單、快捷，適合臨床常規檢測，可分別有450nm、560nm比色，適合不同條件的實驗室操作，採用標準曲線檢測結果可自動從酶標儀輸出。
文檔編號G01N21/31GK1584552SQ20041004003
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月16日 優先權日2004年6月16日
發明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請人:深圳華康生物醫學工程有限公司