蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法及其用途的製作方法

2023-05-11 02:42:11 4

專利名稱：蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物病原真菌技術領域，具體涉及蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法及其用途。
背景技術：
稗草是全球最難防除的雜草之一，目前主要依靠化學除草劑來防治。然而化學除草劑的長期使用使稗草的抗(耐)藥性問題及環境汙染問題越來越嚴重。開發安全高效的生物除草劑符合農業可持續發展要求，雖然目前生物除草劑還不能完全替代化學除草劑，但它能有效減少化學除草劑的使用劑量，從而減少對環境的汙染。
水稻紋枯病是由土壤真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的一類嚴重製約水稻生產的全球性水稻病害。發病嚴重的區域水稻減產可達50％。由於缺少抗紋枯病的供體，目前世界上尚未育出真正意義上的抗紋枯病的水稻品種，因此開發高效安全的殺菌劑，尤其是生物來源的殺菌劑尤為重要。國內防治水稻紋枯病主要利用井岡黴素，雖然井岡黴素是一種低毒的抗生素類生物農藥，但是井岡黴素已經使用了幾十年，品種單一老化，而且需要多次用藥才能達到預期的防治效果，成本較高。

發明內容
鑑於現有技術中存在的問題，本發明目的在於提供一種蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法的技術方案，其培養物具有防治雜草和水稻病害的用途。
蟋蟀草平臍蠕孢菌，拉丁名稱Bipolaris eleusines，其有性態為Cochliobolus eleusines。是從農田自然感病的稗草上分離到的植物病原真菌，可以從浙江中稻高科技種業有限公司購買得到，其商品名稱為克草黴；也可以從中國水稻研究所雜草控制和利用實驗室購買得到。
蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於包括以下工藝步驟1)蟋蟀草平臍蠕孢菌菌種的分離純化採集的感病稗草標樣，用無菌紙袋帶回，取感病稗草葉片，用自來水衝洗後，剪成小片狀，用70％酒精消毒，置於PDA培養基上，室溫(25-30℃)下保溼培養，3～4天後解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，塗在PDA培養基上培養，取只含一個孢子的瓊脂塊，轉接到PDA斜面上培養成單孢系，然後轉接到稗草種子上培養9-11天後分裝於無菌的Eppendorf離心管中，3-5℃保藏菌種；2)蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種於新鮮PDA平板上，27-29℃黑暗培養6-8天後，取直徑6-8mm菌塊接種於PDB液體培養基中，室溫25-30℃靜置培養13-15天獲得發酵液。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於所述的PDA培養基含有馬鈴薯180-220g/L、葡萄糖18-22g/L和瓊脂15-20g/L。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於所述的培養基為稗草基質培養基，即採集於孕穗期的稗草植株，切成1-2cm長小段，60℃烘乾備用，使用時加水高壓滅菌。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於所述的PDB液體培養為振蕩培養。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於步驟1)中用火焰滅菌的解剖針挑出，塗在PDA培養基上培養7天。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於步驟1)中轉接到稗草種子上的培養時間為10天，菌種保藏溫度為4℃。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於步驟2)中長有菌絲及孢子的稗草種子接種於新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養7天後，取直徑7mm菌塊接種於PDB液體培養基中，室溫28℃靜置培養14天。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於所述的PDA培養基含有馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌培養方法，其特徵在於所述培養基的pH值為6-7。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發酵液在生物除草劑和防治水稻紋枯病的抑菌劑中的應用。
蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發酵液的代謝產物ophiobolin A在培養皿生測法中對稗草種子胚根生長有較強抑制作用，其IC50值為7.5μM，試驗發現稗草對ophiobolin A敏感，對水稻安全。它可以單獨使用，也可以與化學除草劑同時使用從而減少化學除草劑使用劑量並且達到良好的除草效果。同時Ophiobolin A對水稻紋枯病菌有極好的抑菌作用，其抑菌效果明顯優於目前常用的井岡黴素，它在25μg/mL濃度下就有100％抑制作用，而5％井岡黴素在有效成分濃度為200μg/mL時只能達到45.2％的抑制率。
具體實施例方式
以下通過實施例及試驗例對本發明作進一步詳細說明。
取感病稗草葉片，用自來水衝洗後，將葉片剪成適當大小，用70％酒精消毒，置於PDA培養基上，室溫28℃下保溼培養，4天後解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，塗在PDA培養基上培養7天，取只含一個孢子的瓊脂塊，轉接到PDA斜面上培養成單孢系，然後轉接到稗草種子上培養10天後分裝於無菌的1.5mL Eppendorf離心管中，4℃保藏菌種。
取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種於新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養7天後，取直徑7mm菌塊接種於PDB液體培養基中，室溫28℃靜置培養14天。
主要培養基PDA培養基，稗草基質培養基。
PDA培養基馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L；稗草基質培養基稗草植株，採集於孕穗期，切成1-2cm長小段，60℃烘乾備用，使用時稱取2g上述製備好的稗草，加20ml水高壓滅菌。
(1)培養特性蟋蟀草平臍蠕孢菌培養要求不高，在普通的PDA培養基上室溫(28-30℃)、pH6-7下生長良好，生長狀態用顯微鏡連續觀察如下1-1.5h成熟孢子從兩端或一端開始萌發；3h未成熟的孢子(分隔4個以下的孢子)開始萌發，早期萌發的孢子處於菌絲生長的旺盛階段，菌絲分枝成直角或近似直角，菌絲無隔，細胞核清晰；4.5h有的菌絲開始變粗；6h膨大的菌絲出現環痕狀的隔；9h膨大的菌絲頂端開始有乳突狀的小孢子出現；12h有小的分生孢子出現；24h新生的分生孢子不成熟，沒有明顯的分隔；
54h培養基底部變黑。
66h新生的分生孢子已成熟並萌發；(2)生理特性不同溫度下蟋蟀草平臍蠕孢菌生長速度和孢子產量明顯不同，28℃生長最快，產孢最多。溫度高於30℃菌生長和產孢受嚴重抑制，溫度低於25℃，菌生長速度明顯減慢。
蟋蟀草平臍蠕孢菌可在一個較寬的pH範圍內生長，pH6-10之間菌落直徑生長速率沒有顯著差異，pH6-7時產孢量最多，在pH低於5和高於11之外生長緩慢。
光照可影響蟋蟀草平臍蠕孢菌的生長和產孢。在12h光照/12h黑暗交替條件下菌落生長稍快，連續光照條件下次之，而連續黑暗條件下較慢。在連續黑暗條件下產孢量最多，連續光照條件下產孢量最少。
氧氣對孢子產量有明顯的促進作用。
(3)代謝特性蟋蟀草平臍蠕孢菌在PDB培養基內黑暗靜置培養14d後，培養物中可產生倍半萜類毒素，該毒素具有殺草和抑菌活性。
(4)菌種安全性評價供試作物為水稻(秀水11、嘉育293、協優46)、玉米、高粱、大麥、小麥、大豆、蠶豆、豇豆和油菜，供試雜草為無芒稗，分別在小塑料盒(15×10×10釐米)中育苗。利用稗草基質培養基培養孢子，無菌水製備孢子懸液(含0.05％吐溫20)，在禾本科植物1葉1心和雙子葉植物1片真葉時噴施孢子懸液；28℃保溼24h，14d後調查發病情況。
試驗結果顯示蟋蟀草平臍蠕孢菌對水稻安全，對高粱和大麥輕度致病，對稗草高度致病。
表1蟋蟀草平臍蠕孢菌安全性評價

孢子懸液濃度為2.5×105個/mL，噴霧量為200mL/m2；NS表示不感病；LS表示輕度感病；HS表示高度感病。
(4)孢子殺草活性a.蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子對不同類型稗草的殺草活性將無芒稗、光頭稗、稗(稗子)、硬稃稗(臺灣稗)分別播種在小塑料盒中，在2.0葉期間苗，拔除長勢弱的，每盒保留15株健壯、生長一致的稗苗。2.5-3.0葉期用蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子懸液噴霧接種。蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子用0.05％吐溫20液洗下，調濃度至孢子5×106個孢子/mL，每平方米接種孢子數5×107個。以噴0.05％吐溫20液做對照，接種後置生長箱，28±0.5℃黑暗保溼(RH95％)培養24h，然後移入28±2℃的溫室，前2d噴術保溼。接種14d後調查發病情況。每個處理重複3次。試驗結果表明蟋蟀草平臍蠕孢菌對硬稃稗、光頭稗和無芒稗100％感病，但對稗子致病力稍差。接種後保持露珠期24h(在人工接種箱中一直細霧噴霧)，移入溫室後保持RH95％以上7天，溫度25-30℃的條件下，蟋蟀草平臍蠕孢菌可殺死大部分稗草。
表2蟋蟀草平臍蠕孢菌對不同稗草的致病性

注0-3表示病級，0＝無病斑，1＝不擴展小型病斑，2＝輕到中等擴展病斑，3＝大型病斑。
b.蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子不同劑量對稗草的殺草活性供試雜草為無芒稗，用無菌水配製孢子懸液(含0.05％吐溫20)，以不含孢子的0.05％吐溫20作為對照，對2-3葉期無芒稗進行葉面噴施，28℃保溼24h，14d後進行稗草株高、鮮重、乾重、死亡率調查。按下式計算抑制率抑制率＝(對照調查值-處理調查值)/對照調查值×100％，試驗結果顯示，當噴霧較高劑量孢子懸液時，蟋蟀草平臍蠕孢菌殺草活性較高，稗草鮮重抑制率38.3％，株高抑制率27.6％，死亡率達53.9％。
表3蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子不同劑量下殺草活性比較

(5)蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵液對紋枯病菌的抑菌活性取已活化直徑為7mm菌塊接種於PDB液體培養基中，25～28℃黑暗靜置培養14d，4層滅菌紗布過濾得到發酵液，再用0.22μm微孔濾膜過濾得到無菌發酵液。用熔化並冷卻到45～50℃的PDA培養基將無菌發酵液稀釋5×，10×，20×，40×，80×，160×，在直徑9cm培養皿內加入20mL含發酵液的PDA培養基製成平板，對照為空白PDA平板。從培養2d的紋枯病菌落邊緣取直徑7mm菌塊接種於上述平板中央，28℃培養24h，用十字交叉法測菌落直徑，並按下式計算發酵液對紋枯病菌的抑制率。
實驗結果顯示發酵液對紋枯病菌有較強的抑制作用，5X稀釋的發酵液的抑菌率可達84.1％，隨著稀釋倍數增加，抑制作用下降，10×，20×，40×，80×稀釋的發酵液的抑菌率分別為79.5％、69.3％、63.0％、46.0％，160X稀釋後仍有32.9％的抑菌率。
權利要求
1.蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於包括以下工藝步驟1)蟋蟀草平臍蠕孢菌菌種的分離純化採集的感病稗草標樣，用無菌紙袋帶回，取感病稗草葉片，用自來水衝洗後，剪成小片狀，用70％酒精消毒，置於PDA培養基上，室溫(25-30℃)下保溼培養，3～4天後解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，塗在PDA培養基上培養，取只含一個孢子的瓊脂塊，轉接到PDA斜面上培養成單孢系，然後轉接到稗草種子上培養9-11天後分裝於無菌的Eppendorf離心管中，3-5℃保藏菌種；2)蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種於新鮮PDA平板上，27-29℃黑暗培養6-8天後，取直徑6-8mm菌塊接種於PDB液體培養基中，室溫25-30℃靜置培養13-15天獲得發酵液。
2.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於所述的PDA培養基含有馬鈴薯180-220g/L、葡萄糖18-22g/L和瓊脂15-20g/L。
3.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於所述的培養基為稗草基質培養基，即採集於孕穗期的稗草植株，切成1-2cm長小段，60℃烘乾備用，使用時加水高壓滅菌。
4.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於所述的PDB液體培養為振蕩培養。
5.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於步驟1)中用火焰滅菌的解剖針挑出，塗在PDA培養基上培養7天。
6.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於步驟1)中轉接到稗草種子上的培養時間為10天，菌種保藏溫度為4℃。
7.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於步驟2)中長有菌絲及孢子的稗草種子接種於新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養7天後，取直徑7mm菌塊接種於PDB液體培養基中，室溫28℃靜置培養14天。
8.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於所述的PDA培養基含有馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L。
9.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法，其特徵在於所述培養基的pH值為6-7。
10.如權利要求1所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發酵液在生物除草劑和防治水稻紋枯病的抑菌劑中的應用。
全文摘要
蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養方法及其用途，屬於植物病原真菌技術領域。採集的感病稗草標樣消毒處理後，置於PDA培養基上，室溫(25－30℃)下保溼培養，3～4天後解剖鏡下觀察到平臍蠕孢菌屬的分生孢子，用火焰滅菌的解剖針挑出，塗在PDA培養基上，取只含一個孢子的瓊脂塊，轉接到PDA斜面上培養成單孢系，然後轉接到稗草種子上培養10天後分裝於無菌的Eppendorf離心管中，4℃保藏菌種；取一粒長有菌絲及孢子的稗草種子接種於新鮮PDA平板上，28℃黑暗培養7天後，取直徑7mm菌塊接種於PDB液體培養基中，室溫28℃靜置培養14天。蟋蟀草平臍蠕孢菌孢子和發酵液可用於製備生物除草劑和防治水稻紋枯病的抑菌劑。
文檔編號A01N63/04GK1986772SQ20061015540
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月22日 優先權日2006年12月22日
發明者張建萍, 餘柳青 申請人:中國水稻研究所