維生素B12檢測試劑盒和方法及其樣本前處理方法與流程

2023-05-11 00:05:47 3

本發明涉及生物樣本檢測
技術領域：
，特別是涉及一種維生素b12檢測試劑盒和方法及其樣本前處理方法。
背景技術：
：維生素b12又叫鈷胺素，是唯一含金屬元素的維生素。其主要生理功能是參與製造骨髓紅細胞，防止惡性貧血；防止大腦神經受到破壞。維生素b12是b族維生素中迄今為止發現最晚的一種。維生素b12的結構如下所示：其特點為：1.分子中心為一個三價鈷離子；2.具有咕啉環(一個類似為卟啉環的結構)，該咕啉環的4個n原子與三價鈷離子形成4個配位鍵；3.二甲基吲唑結構的一個n原子與三價鈷離子形成一個配位鍵；4.吲唑與咕啉環之間由異丙烷、磷酸、5'-脫氧腺苷連接；5.r基團可以是oh-、cl-、cn-等帶負電荷的離子，其與三價鈷離子形成一個配位鍵。維生素b12在體內是與蛋白相結合而存在的，所以在檢測血漿等生物樣本時，需要對樣本進行前處理，使其將維生素b12由結合蛋白上釋放出，再進行檢測。目前，臨床上對生物樣本中的微量維生素b12的檢測方法有放射免疫分析法、酶聯免疫分析法和化學發光免疫分析等。但是，由於從結合蛋白釋放的維生素b12具有多種形式，r基團的不同會導致其有不同的穩定性，在採用上述分析方法進行檢測時，可能由於維生素b12不同的穩定性導致檢測結果出現偏差。技術實現要素：基於此，有必要針對上述問題，提供一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，採用該方法，能夠將待測樣本中的維生素b12轉變為穩定態進行檢測，提高了檢測穩定性，並且所用處理劑均為安全性高的試劑，具有可操作性強的優點。一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，包括以下步驟：取待測樣本溶液，加入蛋白釋放劑和絡合劑，所述蛋白釋放劑使待測樣本中的維生素b12由結合蛋白上釋放出；所述絡合劑為具有氰根離子的絡合物，所述絡合物在水溶液中氰根離子的總穩定常數β為1010～1045，該絡合物在溶液中解離出氰根離子，與上述釋放出的維生素b12結合，形成穩定的氰鈷胺素，供測定。在前期研究中發現，在維生素b12的多種形態中，以cn-絡和的結構為穩定結構。因此，常規技術中，普遍使用的是以氰化鈉或者氰化鉀作為樣本前處理液，利用其中的氰根離子與維生素b12結合形成穩定的氰鈷胺素，再通過免疫方法，檢測出其具體含量，如圖1所示。但是，氰化鈉和氰化鉀在水溶液中完全電離得到劇毒的氰根離子，氰根離子具有很強的絡和性，可與血紅蛋白上的鐵離子絡和，形成非常穩定的絡和物，使血紅蛋白失去活性，不能正常攜帶氧氣，導致窒息中毒。因此，這兩種物質是國家嚴格管制的劇毒品，健康成年人的致死劑量為0.1g。對於氰化鈉和氰化鉀的使用，必須考慮周邊環境影響，風險評估，危廢處理，以及申請建立劇毒品倉庫，對人員進行培訓，申請購買資質。另外，如在試劑配方中引入這樣劇 毒的物質，也會對人心理引起恐慌，其本身也具有較大的汙染和中毒風險。因此，以氰化鈉和氰化鉀作為前處理液大量使用，其操作性和可控性很差。為了尋找能夠在維生素b12前處理過程中替代氰化物的替代品，本發明人經過了大量的實驗摸索和嘗試後發現，按照常規思路，如果要提供足夠多的氰根離子與待測樣本中的維生素b12完全反應，需保證溶液中的氰根離子達到一定的濃度，如選擇氰根離子解離程度較小的物質作為供體，則需要大量的供體化合物，以維持溶液中氰根離子的高濃度，提供足夠多的氰根離子與維生素b12反應，但這樣的方式一方面提高了使用毒性，另一方面由於高濃度前處理劑的存在，有可能對樣品產生一些不良影響，因此，在實際應用中是難以實現的。但在實驗中，本發明人驚奇的發現，在實際應用中，如選用具有氰根離子的絡合物作為氰根離子的供體，即使以少量的絡合物作為供體，即便溶液中氰根離子的濃度並不非常高，也能具有較好的結合效果，能夠與樣本中的維生素b12完全結合，形成穩定的氰鈷胺素供測定，從而確保檢測結果的可靠性。而該類具有氰根離子的絡合物，雖然含有氰根離子，但其很難解離，因此，該類絡合物毒性很低，不屬於國家管制類物質。購買，運輸，儲存和使用都較為方便安全。並且，本發明人在實驗中還發現，限定所用絡合物在水溶液中氰根離子的總穩定常數β為1010～1045，其解離出的氰根離子既能滿足樣本處理要求，達到充分處理樣本的目的，又不至於產生較大毒性，具有較好的實際應用前景。在其中一個實施例中，所述絡合物的加入量為每毫升待測樣本溶液加入0.5mg～5mg的絡合物。優選加入1.5mg-5mg的絡合物。以上述使用量加入絡合物結合維生素b12，具有較好的前處理效果。在其中一個實施例中，所述絡合物包括：六氰合鈷酸鹽，六氰合鐵酸鹽，六氰合鉻酸鹽，四氰合鎳酸鹽，四氰合銅酸鹽，氰合金酸鹽，氰合鋅酸鹽，氰合汞鹽，氰合鉛酸鹽，或氰合錳酸鹽。上述六氰合鈷酸鹽，六氰合鐵酸鹽，六氰合鉻酸鹽，四氰合鎳酸鹽，四氰合銅酸鹽，氰合金酸鹽，氰合鋅酸鹽、氰合鉛酸鹽及氰合錳酸鹽中的金屬離子 包括各種可能的化合價的形態。例如六氰合鈷酸鹽是包括二價鈷的六氰合鈷ii酸鹽和三價鈷的六氰合鈷iii酸鹽。上述絡合物均可解離出微量氰根離子，從而使微量的氰根離子與維生素b12的三價鈷離子結合，並且又非劇毒物質，具有較好的應用前景。所述絡合物優選六氰合鈷酸鹽或六氰合鐵酸鹽，具有更佳的應用前景。特別是當所述絡合物為六氰合鈷酸鹽時，具有最佳的前處理效果。該六氰合鈷酸鹽包括六氰合鈷酸鉀，六氰合鈷酸鈉等。例如，在k3co(cn)6中具有三價鈷離子，同維生素b12中氰根離子的絡和係數一致，由k3co(cn)6可解離出微量氰根離子，微量的氰根離子與維生素b12的三價鈷離子結合，並且，該六氰合鈷酸鹽所具有的三價鉻與維生素b12中的三價鈷具有較好的一致性。由於金屬離子容易與蛋白結合，從而改變其活性，因此，如絡合物中引入了新的金屬離子，可能導致檢測誤差。而使用六氰合鈷酸鹽，未引入其它更多的金屬離子，規避了其它金屬離子幹擾，使檢測結果更加趨於真實。在其中一個實施例中，所述待測樣本為待測血清樣本。血清樣本的維生素b12的濃度為pg/ml級別，能夠被絡合物解離出的微量氰根離子結合，具有較好的前處理效果。在其中一個實施例中，所述蛋白釋放劑包括強鹼，或強鹼和二硫蘇糖醇(dtt)。其中：dtt能夠還原結合蛋白的二硫鍵，破壞其二級結構。以便強鹼更容易和充分水解結合蛋白，使維生素b12從結合蛋白上被充分釋放出來。可以理解的，所述強鹼包括：氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的至少一種，僅需能夠水解結合蛋白即可。可以理解的，上述強鹼破壞結合蛋白從而釋放出維生素b12的方法可採用常規處理手段，但是採用上述條件具有較好的釋放效果。在其中一個實施例中，所述蛋白釋放劑和絡合劑與待測樣本反應的條件為：在20℃～50℃下時間8分鐘～30分鐘，優選在37℃下反應10min-15min。可以理解的，也可採用其它反應條件，但是採用上述條件，能夠快速得到穩定的氰鈷胺素，又不影響維生素b12的穩定性。本發明還公開了一種維生素b12檢測方法，採用上述的樣本前處理方法。上述維生素b12檢測方法，由於採用了上述樣本前處理方法，將待測樣本中不同形式的維生素b12均轉變為穩定的氰鈷胺素，具有檢測結果準確、穩定的優點，並且無需使用劇毒的氰化物，具有非常好的應用前景。在其中一個實施例中，採用上述的樣本前處理方法後，以化學發光免疫分析法測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。本發明還公開了一種具有氰根離子的絡合物在作為維生素b12檢測前處理劑中的應用，所述絡合物在水溶液中氰根離子的總穩定常數β為1010～1045。以上述具有氰根離子的絡合物提供微量氰根離子，作為結合維生素b12的前處理劑，既能夠滿足樣本處理要求，達到充分處理樣本的目的，又非劇毒物質，具有安全性好，操作性強的優點。在其中一個實施例中，所述絡合物為六氰合鈷酸鹽，六氰合鐵酸鹽，六氰合鉻酸鹽，四氰合鎳酸鹽，四氰合銅酸鹽，氰合金酸鹽，氰合鋅酸鹽，氰合汞鹽，氰合鉛酸鹽，或氰合錳酸鹽。所述絡合物優選六氰合鈷酸鹽或六氰合鐵酸鹽，具有更佳的應用前景。特別是當所述絡合物為六氰合鈷酸鹽時，具有最佳的前處理效果。該六氰合鈷酸鹽包括六氰合鈷酸鉀，六氰合鈷酸鈉等。例如，在k3co(cn)6中具有三價鈷離子，與氰根離子的絡和係數一致，由k3co(cn)6可解離出微量氰根離子,微量的氰根離子與維生素b12的三價鈷離子結合，並且，該六氰合鈷酸鹽所具有的三價鉻與維生素b12中的三價鈷具有較好的一致性，不引入其它金屬離子，提高了檢測的穩定性和準確性。本發明還公開了一種維生素b12檢測試劑盒，包括以下組分：前處理劑：包括蛋白釋放劑和絡合劑，所述絡合劑為具有氰根離子的絡合物，所述絡合物在水溶液中氰根離子的總穩定常數β為1010～1045；磁性微粒體系：結合了內因子特異性結合物或者內因子的磁性微粒；標記物體系：標記了內因子特異性結合物或者內因子的示蹤標記物；其中，內因子特異性結合物或者內因子中的一種標記示蹤物，則另一種包被磁性微粒，優選的，內因子特異性結合物為維生素b12。。上述維生素b12檢測試劑盒，採用了蛋白釋放劑與具有氰根離子的絡合物相配合的方式，在前處理中，無需使用劇毒品或大量氰根離子供體，就能夠較好的將維生素b12完全結合，形成穩定的氰鈷胺素供測定，具有安全性高的優點。隨後，採用常規化學發光免疫分析方法，即可完成維生素b12的檢測。可以理解的，上述前處理劑中，蛋白釋放劑為能夠使待測樣本中的維生素b12由結合蛋白上釋放出的物質，如強鹼，或強鹼和二硫蘇糖醇等。上述蛋白釋放劑和絡合劑可以根據其具體性質和存放要求，對各試劑單獨包裝或合併包裝。上述磁性微粒體系中，結合了維生素b12的磁性微粒既可以是將維生素b12直接包被於磁性微粒上，也可以是通過間接方式連接，比如生物素和抗生物素抗體或者親和素等能夠相互結合的搭橋物以間接結合的方式結合。如該磁性微粒體系可以包括包被了抗生物素抗體及結合了生物素化維生素b12的磁性微粒等。同樣，上述標記物體系既可以是將內因子直接結合標記物，如豬內因子結合鹼性磷酸酶標記物的複合物，也可以通過生物素和抗生物素抗體、親和素等能夠相互結合的搭橋物以間接結合的方式結合。上述標記物指的是化學發光免疫分析中使用的能夠直接發光的標記物，如魯米諾及其衍生物、異魯米諾或其衍生物、吖啶酯等；或者在化學發光酶免疫分析中使用的配合相應底物可以發光的標記物，如鹼性磷酸酶或過氧化物酶等。如前所述，本申請中用具有氰根離子的絡合物替代現有維生素b12試劑盒中氰化鈉進行樣本的預處理，因此，本試劑盒中的前處理劑也可以與其他維生素b12檢測試劑盒中的磁微粒體系和酶標記體液組合，得到本申請的維生素b12檢測試劑盒。例如，roche的維生素b12檢測試劑盒(電化學發光法)提供的磁微粒體系和標記物體系，或者beckmancoulter的維生素b12檢測試劑盒(化學發光法)，提供的磁微粒體系和標記物體系，都適用於本申請。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明的一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，以含有氰根離子，但又較難解離的絡合物作為氰根離子的供體，利用解離出的微量氰根離子與待測樣本中的維生素b12反應，生成穩定的氰鈷胺素，供後續測定。並通過選用具有 特定氰根離子解離常數的絡合物，以達到既能滿足樣本處理要求，充分處理樣本，又不至於產生較大毒性的目的。並且，本發明還對多種具有氰根離子的絡合物進行了考察、篩選，發現以六氰合鈷酸鹽作為氰根離子的供體，對待測樣本進行前處理，避免引入新的金屬離子，規避了其它金屬離子幹擾，使檢測結果更加趨於真實。本發明的一種維生素b12檢測方法，由於採用了上述樣本前處理方法，將待測樣本中不同形式的維生素b12均轉變為穩定的氰鈷胺素，具有檢測結果準確、穩定的優點，並且無需使用劇毒的氰化物，具有非常好的應用前景。本發明的一種維生素b12檢測試劑盒，採用了蛋白釋放劑與具有氰根離子的絡合物相配合作為前處理劑，在前處理中，無需使用劇毒品或大量氰根離子供體，就能夠較好的將維生素b12完全結合，形成穩定的氰鈷胺素供測定，具有安全性高的優點。隨後，採用常規化學發光免疫分析方法，即可完成維生素b12的檢測。具有安全性高，操作方便的優點。附圖說明圖1為常規技術中以氰化鈉或者氰化鉀中氰根離子與維生素b12結合形成穩定的氰鈷胺素示意圖；圖2為實施例1中k3co(cn)6解離出氰根離子與維生素b12結合形成穩定的氰鈷胺素示意圖；圖3為實施例1中kcn和k3co(cn)6對比測試結果；圖4為實施例1檢測方法與roche方法對比測試結果；圖5為實施例1檢測方法線性回收測試結果；圖6為實施例2中k3co(cn)6和k3fe(cn)6對比測試結果；圖7為實施例2中k3co(cn)6和k4fe(cn)6對比測試結果；圖8為實施例2中k3fe(cn)6與k3co(cn)6對比測試結果；圖9為實施例2中k4fe(cn)6與k3co(cn)6對比測試結果。具體實施方式為了便於理解本發明，下面將參照相關附圖對本發明進行更全面的描述。附圖中給出了本發明的較佳實施例。但是，本發明可以以許多不同的形式來實現，並不限於本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬於本發明的
技術領域：
的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在於限制本發明。實施例1一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，包括以下步驟：取待測血清樣本50μl，加入維生素b12前處理劑50μl，該前處理劑為氫氧化鈉濃度為0.5mol/l和k3co(cn)6濃度為1.5g/l的水溶液(即每毫升待測樣本溶液加入1.5mg的絡合物)，以及dtt濃度為1.028g/l的檸檬酸鈉緩衝液，在37℃下反應12.5min，使其中的維生素b12由結合蛋白上釋放出，並與k3co(cn)6在溶液中解離出的微量氰根離子結合，形成穩定的氰鈷胺素，供測定，如圖2所示；k3co(cn)6在水溶液中氰根離子的總穩定常數β為1042。一種維生素b12檢測方法，採用本實施例的前處理方法對待測血清樣本進行處理後，以常規化學發光免疫分析法測定待測樣本中氰鈷胺素的含量，在本實施例中，採用以下試劑盒進行檢測。一種維生素b12檢測試劑盒，包括以下組分：前處理劑：包括蛋白釋放劑和絡合劑，包括含有500mmol/lnaoh和1.5g/lk3co(cn)6水溶液的預處理液1和含有1.028g/ldtt檸檬酸鈉緩衝液的預處理液2。磁性微粒體系：懸浮於tris緩衝液中的包被著抗生物素抗體及結合了生物素化維生素b12的超順磁性微粒，該包被著抗生物素抗體及結合了生物素化維生素b12的超順磁性微粒的濃度為0.2g/l。標記物體系：濃度為3mg/l的豬內因子-鹼性磷酸酶標記物的磷酸緩衝液。上述試劑盒中的磁微粒和標記物，可以用常規的抗體包被方法和標記技術，將抗生物素抗體包被到磁微粒，和將豬內因子與鹼性磷酸酶結合標記。採用上述試劑盒進行維生素b12的檢測，以三步競爭化學發光免疫分析法進行，具體操作如下：第一步：將血清樣本與上述預處理液1和預處理液2混合，37℃孵育12.5分鐘。第二步：將豬內因子-鹼性磷酸酶標記物添加到反應管中，中和變性處理後的樣本，同時樣本中的維生素b12與豬內因子-鹼性磷酸酶標記物的複合物結合。第三步：將包被著抗生物素抗體及結合了生物素化維生素b12的超順磁性微粒添加到反應管中，經過孵育，磁性微粒上的維生素b12競爭結合複合物上的維生素b12，形成維生素b12-豬內因子-鹼性磷酸酶標記物和磁性微粒-維生素b12-豬內因子-鹼性磷酸酶標記物的混合物。磁場吸附磁性微粒，洗去不含磁性微粒部分。最後加入化學發光底物(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧醯)-苯基-1,2-二氧環乙烷，amppd)，37℃孵育12分鐘，磁性微粒-維生素b12-豬內因子-鹼性磷酸酶標記物的鹼性磷酸酶，可以催化底物發光，且發光值與鹼性磷酸酶含量成正比例關係。記錄發光讀數。所產生光子數與樣本內維生素b12的濃度成反比。樣本內分析物的量由校準曲線來計算得到。以下對上述方法進行方法學考察。一、以kcn和k3co(cn)6進行對比測試。分別使用kcn和k3co(cn)6作為樣本前處理劑，進行血清中維生素b12的對比測定實驗。其中，以k3co(cn)6作為樣本前處理劑的具體方法按照本實施例上述樣本前處理方法；以kcn作為樣本前處理劑的具體方法參照上述樣本前處理方法，僅是將其中加入的k3co(cn)6替換為0.9g/l濃度的kcn50μl；並按照上述化學 發光免疫分析法分別測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。結果如圖3所示，圖中橫坐標為樣本中維生素b12的濃度，單位為pg/ml，縱坐標的斜率通過以下公式計算得到：其中：c0指樣本中維生素b12為零時的檢測發光值；cs指樣本中維生素b12為橫坐標濃度時的檢測發光值；從圖中可以看出，以kcn和k3co(cn)6作為樣本前處理劑，在各個濃度梯度下，定標斜率都很明顯，且曲線相似度較高。說明可用k3co(cn)6替代kcn使用，具有較好的前處理效果。二、本實施例的維生素b12檢測方法與roche比較。採用上述本實施例的維生素b12檢測方法對39例真實樣本進行檢測，並同時採用roche(羅氏)的vb12檢測試劑(型號：cobas411)進行平行檢測，roche的檢測方法為電化學發光法，進行方法學的對比。檢測結果如圖4所示，圖中橫坐標為本實施例的維生素b12檢測方法得到濃度值，縱坐標為roche檢測試劑得到濃度值。將二者進行線性擬合後，其直線方程的中相關係數r的r2為0.9774，說明本實施檢測方法與roche的vb12檢測試劑相比，二者的一致性較好。三、線性回收的測定。使用含高濃度維生素b12的樣本進行逐級稀釋，以本實施例的方法檢測其中維生素b12的含量，結果如圖5所示。圖中橫坐標為本實施例的維生素b12檢測方法得到濃度值，縱坐標為高濃度樣本稀釋後的理論值。將二者進行線性擬合後，其直線方程中相關係數r的r2為0.9969，說明本實施檢測方法得到的測定值與理論值幾乎無差異，二者具有較高的一致性。四、低濃度樣本測定。為了考察在低濃度樣本中檢測的準確性，選取2例低濃度樣本進行檢測， 結果如下表所示。表1.低濃度樣本檢測。樣本濃度值測定濃度測值偏差正確度低值樣本1281.72270.124.29％正確度低值樣本2622.41600.643.63％上表中濃度值是具有較高溯源等級參考血清，由邁瑞溯源測試得到。從上述結果中可以看出，本方法對不同低濃度樣本檢測的準確度較好，其偏差均在5％以內。實施例2一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，與實施例1的方法基本相同，不同之處在於：本實施例分別採用的六氰合鐵酸鹽(六氰合鐵酸鉀)和六氰合亞鐵酸鹽(六氰合亞鐵酸鉀)為絡合物對樣本進行前處理，其中，六氰合鐵酸鉀的加入量為5g/l的六氰合鐵酸鉀水溶液50μl(即每毫升待測樣本溶液加入5mg的絡合物)，六氰合亞鐵酸鉀的加入量為3g/l濃度的六氰合亞鐵酸鹽水溶液50μl(即每毫升待測樣本溶液加入3mg的絡合物)。六氰合鐵酸鉀在水溶液中的總穩定常數β為1042，六氰合亞鐵酸鉀在水溶液中的總穩定常數β為1035。一種維生素b12檢測方法，採用本實施例的前處理方法對待測血清樣本進行處理後，以實施例1的化學發光免疫分析法測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。以下對上述方法進行方法學考察。一、以k3co(cn)6，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6進行對比測試。分別使用k3co(cn)6，k3fe(cn)6，和k4fe(cn)6作為樣本前處理劑，進行血清中維生素b12的對比測定實驗。其中，以k3co(cn)6作為樣本前處理劑的具體方法按照實施例1中樣本前處理方法；以k3fe(cn)6，和k4fe(cn)6作為樣本前處理劑的具體方法參照實施 例1，僅是將實施例1中加入的k3co(cn)6分別替換為5g/l的k3fe(cn)6水溶液和3g/l濃度的k4fe(cn)6；並按照上述化學發光免疫分析法分別測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。結果如圖6和圖7所示，圖中橫坐標為樣本中維生素b12的濃度，單位為pg/ml，縱坐標的斜率參照實施例1的公式計算得到：從圖中可以看出，以k3co(cn)6，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6作為樣本前處理劑，在各個濃度梯度下，定標斜率都很明顯，且曲線趨勢相似度較高，說明k3fe(cn)6和k4fe(cn)6與k3co(cn)6類似，均有較好的前處理效果。但是在高濃度範圍，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6與k3co(cn)6相比，曲線吻合度稍差，說明在樣本中含有較高濃度維生素b12時，引入的fe離子對測定結果造成了少量的影響。二、本實施例與實施例1的維生素b12檢測方法比較。採用上述本實施例的維生素b12檢測方法(絡合物為k3fe(cn)6和k4fe(cn)6)分別對39例真實樣本進行檢測，並同時採用實施例1的檢測方法進行平行檢測，進行方法學的對比。其中，絡合物為k3fe(cn)6的檢測結果如圖8所示，絡合物為k4fe(cn)6)的檢測結果如圖9所示，圖中橫坐標為本實施例的維生素b12檢測方法得到濃度值，縱坐標為實施例1檢測得到濃度值。將二者進行線性擬合後，其直線方程的相關係數r的r2分別為0.9028和0.9197，均大於0.9，說明k3fe(cn)6和k4fe(cn)6與k3co(cn)6相比，有相似的前處理效果，可以用於維生素b12的前處理。以上所述實施例的各技術特徵可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特徵所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特徵的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的範圍。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的 普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。當前第1頁12