一組微擬球藻的檢測探針的製作方法

2023-05-11 03:13:01

一組微擬球藻的檢測探針的製作方法
【專利摘要】一組微擬球藻的檢測探針，屬於核酸檢測領域。依據微擬球藻rRNA保守序列設計成三條相互關聯的寡核苷酸探針，針對微擬球藻18SrRNA特定區域設計的分析探針SEQIDNO:1，在S1酶保護下與此區域保守序列特異性結合，進行生物信息學比對時僅與微擬球藻18SrRNA在1610～1790區域核苷酸互補，而與其他藻類在內的真核微生物無同源性，其長度為60bp；捕獲探針SEQIDNO:2，與分析探針的3』端互補，在5'端有生物素Biotin標記；信號探針SEQIDNO:3，與分析探針的5'端互補，在5'端有異硫氰酸FITC標記。本發明用於培養體系中微擬球藻的檢測，特異性高，實用性好，在每毫升海水0.18×103~2.1×103個微擬球藻細胞數範圍內，檢測信號與藻細胞數呈線性關係，可用於規模化微藻養殖過程中微擬球藻的過程監測。
【專利說明】一組微擬球藻的檢測探針
【技術領域】
[0001]本發明涉及一組藻類檢測的寡核苷酸探針，具體是針對微擬球藻{Nannochloropsis sp.)定性和定量檢測的特異性探針,屬於核酸檢測領域。
【背景技術】
[0002]微擬球藻sp.)又稱微擬球藻，是一種分布廣泛的海水藻類，其油脂含量佔乾重的比重最高達68%以上，是公認的最有希望用於工業化的高產油海水藻，並且富含高價值的不飽和脂肪酸。在美國、日本、歐洲等地微擬球藻已進行規模化養殖用於提取高純度EPA，國際上EPA已被廣泛認為是很有發展潛力的天然藥物和營養保健品。微擬球藻在食品、飼料、醫藥、環保和生物能源等諸多方面具有廣泛的應用前景。葉輪混和跑道式開放養藻池這是目前國內外大量生產微藻最常用方法，由於在開放式的微藻培養水體中存在著各種微藻藻種，並且各種微藻藻種相互競爭生長，目標藻不能佔到優勢致使養殖水體中目標藻細胞密度低，雜藻(生產品種以外的其它微藻)如:團藻、柵藻、牟氏角刺藻，三角褐指藻、底棲舟形藻、海水小球藻和鈍頂螺旋藻，以及裸藻類的纖細裸藻等均有繁殖。加之微型原生動物以及細菌的汙染往往嚴重地影響產品的產量和質量，甚至造成停產。
[0003]由於微藻個體微小一般光學顯微鏡難於觀察，有時需藉助電子顯微鏡辨別鑑定，並且有些藻類的結構不利於電子顯微鏡製片；另外，這種以形態學為基礎的分析方法，因其分析速度慢、耗時長、對操作人員的要求較高，難以滿足微藻規模化養殖過程中「快速、準確」監測目的藻種數量和受汙染程度的要求，目前尚未形成有效對微藻定性和定量監測的成熟技術。 [0004]核糖體RNA大、小亞基基因序列，尤其是大亞基序列的結構具有保守區與聞變區鑲嵌的特點，在研究不同生物類群時，可採用不同區域作為分析比較的分子指標，並且藻類的系統進化與rRNA序列密切相關，rRNA含量豐富以及具有屬種的高度保守序列是作為藻類定性檢測的優良選擇。雖然國內近年來有報導用改進的三明治雜交方法對藻類進行定性定量檢測，但是主要集中於對於浮遊藻類如甲藻、尖刺菱形藻等的檢測，還尚未有對微擬球藻的高效檢測方法。因此，需要提供一種適合於規模化養殖過程中微擬球藻的檢測探針組合物，以及簡單重複性好的操作方法，快速定性定量檢測微擬球藻，監測微擬球藻生長及受汙染程度。

【發明內容】

[0005]本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種開放式培養系統中對微擬球藻進行監測的探針組合物及相關檢測方法，可以快速定性定量檢測混菌環境下微擬球藻的數量和受汙染情況，且檢測方法操作簡單、重複性好，適於規模化應用。
[0006]本發明的技術方案:在本發明的第一方面，提供了一種微擬球藻(Nannochloropsis sp.)的檢測探針組合物，由三種寡核苷酸探針組成,針對微擬球藻18SrRNA特定區域設計的分析探針SEQ ID NO: 1，在SI酶保護下與此區域保守序列特異性結合；捕獲探針SEQ ID NO:2用於結合在載體上並與所述分析探針3』端特異性結合；信號探針SEQ ID NO:3用於捕獲SI酶酶切處理和變性處理後溶液內的分析探針。檢測信號與藻細胞數目呈現線性關係R2=0.9922，可用於規模化微藻養殖過程中微擬球藻的過程監測。
[0007]所述微擬球藻分析探針具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，長度為60bp，在進行生物信息學比對時其僅與微擬球藻18S rRNA在1610~1669區域核苷酸互補，BLAST結果表明100%同源性序列皆為微擬球藻屬，並且無99%同源性序列，而與其他藻類在內的真核微生物無同源性，在一定條件下可特異結合於微擬球藻rRNA上，(GC%=41.7%，Δ G= -3.68kcal/mol)。
[0008]所述微擬球藻捕獲探針具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，長度為21bp，(GC%=42.9%, Δ G= -0.73 kcal/mol)，所述捕獲探針結合於分析探針3』端，在其5』端具有生物素標記。
[0009]所述微擬球藻信號探針具有SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，長度為21bp，(GC%=42.9%, Δ G= -0.32 kcal/mol)，與分析探針的5』端互補，其5』端具有檢測信號標記，所述標記是異硫氰酸(FITC)標記。
[0010]本發明的檢測探針可以檢測樣品中是否存在微擬球藻及數量，並具體包括以下步驟:
(I)將藻樣品裂解後釋放出的rRNA與分析探針雜交得到雜交產物；分析探針與rRNA分子雜交後形成DNA/RNA雜合體。
[0011](2)在所述雜交產物中加入核酸SI酶消化處理得到消化產物；在SI酶的作用下，單鏈的DNA或RNA分子以及DNA/RNA雜合體的不匹配部分被消化，留下與目標RNA分子數量上相等的DNA/RNA雜合體，代表了樣品中相應rRNA含量。
·[0012](3 )對所述消化產物進行變性處理得到變性產物；將DNA/RNA雜合體變性為DNA單鏈和RNA單鏈，變性方法可以採用該領域常用變性技術，例如熱變性方法，由於單鏈RNA非常不穩定，很容易被RNA酶降解掉。
[0013](4)將所述變性產物與固定在載體上的所述捕獲探針雜交，然後洗滌；雜交後形成DNA/DNA雜合體，洗滌是為了除去非特異性吸附。
[0014](5)加入所述信號探針與所述分析探針雜交，然後洗滌；雜交後形成「三明治」雜交複合體，洗滌同樣是為了除去非特異性吸附。
[0015](6)加入帶酶標記的抗體與所述檢測信號標記進行結合，然後洗滌。
[0016](7)加入所述酶標記的底物以顯色。
[0017]所述信號探針可以標記螢光信號，通過螢光檢測信號強度；也可以在信號探針上標記地高辛、螢光素或者生物素等。
[0018]所述酶標記可以是任何合適的酶，較佳地，所述酶標記是辣根過氧化物酶標記，所述底物是四甲基聯苯胺。酶和底物組成顯色系統，顯色系統還可以採用其它顯色系統，例如
鄰苯二胺等。
[0019]本發明的有益效果:
(O特異性好:由於規模化養殖微藻過程中大多米用開放式系統，培養液中多混有雜藻，形態相近，現有顯微技術監測微擬球藻的生產過程具有較大難度，本發明採用的Si酶保護分析探針進行生物信息學比對時僅與微擬球藻18S rRNA在1610~1669區域核苷酸互補，而與其他藻類在內的真核微生物無同源性，BLAST結果表明100%同源性序列皆為微擬球藻屬，並且無99%同源性序列。說明該分析探針具有很高的特異性。並且採用夾心雜交方法通過一系列反應顯色，建立吸光度與菌濃之間的標準曲線，大大提高了定量檢測的頭用性。
[0020](2)穩定性高:由於檢測過程中設計的分析探針在SI酶保護下將藻細胞內不穩定的RNA信號轉化為當量樣品濃度的DNA信號，其他步驟均是針對DNA進行的，大大提高了檢測的穩定性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是採用本發明的微擬球藻探針對不同藻類檢測結果圖。
[0022]圖2是採用本發明的微擬球藻探針對不同濃度微擬球藻檢測的標準曲線。
【具體實施方式】
[0023]為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明，目的在於更好理解本發明的內容而非限制本發明的保護範圍。在本實施例中，採用特異性探針對不同藻細胞濃度的微擬球藻進行檢測，製作其標準曲線，並對其特異性進行驗證。
[0024]1、微擬球藻檢測探針的設計`
將微擬球藻屬七個已報導的不同種Nannochloropsis salina、Nannochloropsisoceanica.、Nannochloropsis gaditana.、Nannochloropsis granulata.、Nannochloropsisocu I a ta, Nannochloropsi s limne ti ca, Nannochloropsi s mari tima 的 18S rRNA 序歹[J 進比對並與其他藻種序列進行比對，找到在1610~1669區域核酸的互補序列，而與其他藻類無同源性，確定為特徵區域，設計分析探針為:
SEQ ID NO:1:5』-GGAAACCTTG TTACGACTTC ACCTTCCTCT AAATGATGAG GTTTAGATAACTTCTCACGC-3，，
根據上述探針設計合成檢測所需其他探針:
捕獲探針為SEQ ID NO: 2:5'-GCGTGAGAAG TTATCTAAAC C-3』，與分析探針的3』端互補，在5』端有生物素Biotin標記；
信號探針為SEQ ID NO: 3:5' -TGMGTCGTA ACAAGGTTTC C-3』，與分析探針的5』端互補，在5』端有異硫氰酸FITC標記。
[0025]2、捕獲探針包被板製備:
鏈黴親和素用包被液配成5 μ g/mL,向微孔板各孔內加入100 μ L，用封口膜封好後於4°C過夜，次日取出，用PBS洗滌液洗滌3次，再用0.1% BSA 250 μ L在37°C下封閉60min，最後用PBS洗滌液洗滌3次,乾燥後封好於4°C下保存待用,可保存2月。100μ L(500nM溶於pH7.2 PBS)捕獲探針加入鏈黴素包被微孔板，於37°C下保溫2h，並用洗滌液PBS衝洗3次，隨後儲存於4°C下。
[0026]3、藻細胞rRNA的獲取
取對數期微擬球藻顯微鏡計數計算細胞濃度，離心(10000r/min, 5min),除去上清液，隨後直接於4 °C下加入1.5mL含有50nM SI酶保護的裂解液(1% SDS、1.2M Urea,20%Formamide,0.3M NaCl、50mM Tris、ρΗ6.4，加入0.3g/mL的玻璃珠後，置于振蕩器上渦旋5min。
[0027]進行微擬球藻的檢測曲線分析時，將過濾收集到的微擬球藻樣品用含有SI酶保護分析探針的裂解液10倍逐級稀釋6次共獲得7個樣品。
[0028]進行微擬球藻探針特異性實驗時，將開放式培養過程中常見海水藻:斜生柵藻、中肋骨條藻、牟氏角刺藻，三角褐指藻、鹽生杜氏藻、海水小球藻，等鞭金藻，亞心形四片藻等藻細胞分別進行上述處理。
[0029]4、RNA信號轉化
加入100 μ L微擬球藻樣品，50 μ L礦物油，15 μ L 500nmoL/L的分析探針(採用上述裂解緩衝液稀釋)，95°C水浴處理15min，37°C水浴處理lh。加入100 μ L的核酸SI酶(100U於 1.4Μ NaCI, 22.5mM ZnSO4, 250mM CH3COONa, ρΗ4.5)，40°C水浴處理 30min。加入 500 μ L終止緩衝液(62.5mM NaOH, 30mM EDTA,0.5M PBS,pH7.2)，95°C處理 15min，DNA-RNA 雜合體變性形成單鏈DNA和單鏈RNA，與此同時，單鏈RNA被降解，因此溶液中僅含結合於靶序列的分析探針。將100 μ L上述反應混合液分別移入到預固定有捕獲探針的酶標板微孔中，50°C雜交lh，然後用0.01moL/L pH7.2 PBS緩衝液洗滌三次。每孔加入含有100 μ L、500nM連接探針的雜交緩衝液(4X SSC, 10%甲醯胺，0.02%SDS, ρΗ7.2)，於50°C雜交30 min，用PBS洗滌三次。
[0030]5、顯色反應及信號檢測
每孔加入100 μ L含有標記了辣根過氧化物酶的抗螢光素抗體(I: 5000稀釋於PBS、
0.1%牛血清白蛋白)，37°C保溫30 min，然後用PBS洗4次。每孔加入TMB顯色液(用無水乙醇將TMB配成1%濃度，4°C保存半年以內使用，使用前用pH 5.0磷酸-檸檬酸緩衝液9.9 mL加入0.1mL TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H2O2 I μ L，混勻後立即使用)100 μ L，37°C處理15 min後，每孔加入100 yL 2 moL/L硫酸終止反應。將酶標板置於讀板機上於450 nm和630 nm測定光吸收值。
[0031]6、結果
檢側結果如圖1和圖2所示:
圖1顯示了用於針對不同藻的檢測結果，只有微擬球藻信號結果較高，證明了本發明方法具有極高的可行性和特異性。常規統計方法進行擬合得到標準曲線公式，即檢測公式如下；
y=0.256χ-0.0226
R2=0.9922 ；
X為樣品中微擬球藻的細胞數，IO3個/mL，y為實際測定的OD比值，R為相關係數。
[0032]下表列出了用本實施例方法測定的微擬球藻樣品藻細胞數量與顯微計數結果的比較，結果顯示在每毫升海水0.18 X IO3~2.1 X IO3個微擬球藻細胞數範圍內，檢測信號與藻細胞數目呈現線性關係，R2=0.9922，可用於規模化微藻養殖過程中微擬球藻的過程監測。
[0033]
【權利要求】
1.一組微擬球藻(Nannochloropsis sp.)的檢測探針,其特徵在於該檢測探針由三種寡核苷酸探針組成，針對微擬球藻18S rRNA特定區域設計的分析探針SEQ ID NO: 1，在SI酶保護下與此區域保守序列特異性結合；捕獲探針SEQ ID NO:2用於結合在載體上並與所述分析探針3』端特異性結合；信號探針SEQ ID NO:3用於捕獲SI酶酶切處理和變性處理後溶液內的分析探針，檢測信號與藻細胞數目呈現線性關係R2=0.9922，用於規模化微藻養殖過程中微擬球藻的過程監測。
2.根據權利要求1所述的微擬球藻的檢測探針，其特徵在於分析探針具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，長度為60bp，在進行生物信息學比對時其僅與微擬球藻18S rRNA在1610~1669區域核苷酸互補,BLAST結果表明100%同源性序列皆為微擬球藻屬，並且無99%同源性序列，而與其他藻類在內的真核微生物無同源性，在一定條件下可特異結合於微擬球藻 rRNA 上；其 GC%=4L 7%, Δ G= -3.68 kcal/mol。
3.根據權利要求1所述的微擬球藻的檢測探針，其特徵在於捕獲探針具有SEQIDNO: 2所示的核苷酸序列，長度為21bp，GC%=42.9%，AG= -0.73 kcal/mol，所述捕獲探針結合於分析探針3』端，在其5』端具有生物素標記。
4.根據權利要求1所述的微擬球藻的檢測探針，其特徵在於信號探針具有SEQIDNO: 3所示的核苷酸序列，長度為21bp，GC%=42.9%, Δ G= -0.32 kcal/mol，與分析探針的5』端互補，其5』端具有檢測 信號標記,所述標記是異硫氰酸FITC標記。
【文檔編號】C12Q1/04GK103667474SQ201310646550
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】楊海麟, 王武, 辛瑜, 夏小樂, 張玲, 鞏波 申請人:江南大學