一種生物合成腺苷蛋氨酸的方法
2023-05-10 22:56:16 3
一種生物合成腺苷蛋氨酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種腺苷蛋氨酸的合成方法，所述方法為：將腺苷蛋氨酸工程菌經發酵培養獲得的發酵液過濾，取溼菌體在60～65℃乾燥2～3h進行活化處理，獲得的活化菌體加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸鹽、硫酸鹽、蛋氨酸和水構成反應體系，在33～37℃條件下進行轉化反應，反應結束，獲得的反應液即為含腺苷蛋氨酸的混合液；本發明構建了SAM工程菌，使用該菌種可以在已有腺嘌呤合成ATP反應液中添加蛋氨酸，從而省去了SAM合成酶的菌種培養、SAM合成酶的提取以及在反應中添加SAM合成酶等操作，使生產更為簡便；腺嘌呤等原料都可以從市場大量較低價購得，利用本發明方法可以高效、大規模合成SAM。
【專利說明】一種生物合成腺苷蛋氨酸的方法
(—)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種腺苷蛋氨酸的合成方法，特別涉及利益工程菌進行生物合成腺苷蛋氨酸的合成方法。
(二)【背景技術】
[0002]S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)又名S-腺苷甲硫氨酸,在生物體內主要起著轉甲基、轉硫和轉氨丙基的作用，參與眾多重要的生化反應，從而具有多種治療作用，對抑鬱症、關節炎、肝膽疾病、胰腺炎等均有較好療效。在歐洲一直將其作為憂鬱症和關節炎的處方治療藥物。從1999年美國FDA批准其作為食品營養補充劑上市到現在，SAM的功效已經逐漸為大眾了解。由於生產技術水平所限，目前SAM的價格還比較昂貴，因此研究開發低成本的SAM生產技術仍然具有現實意義。
[0003]由於SAM結構複雜，化學合成法原料價格昂貴、合成困難，因此國內外的合成研究和實際生產都集中在生物合成方法。生物合成SAM主要有兩類方法:一類是採用添加蛋氨酸的發酵法；另一種是採用腺苷、腺苷三磷酸(ATP)等和蛋氨酸兩種前體物的轉化合成法。
[0004]在轉化合成法中，發明專利CN1217002C(2005.08.31)、CN101285085B(2011.04.27)等公開了一種採用克隆了 SAM合成酶的大腸桿菌工程菌，將ATP和蛋氨酸兩種前體物轉化合成SAM的方法；發明專利CN100363499C(2008.01.23)公開了一種採用ATP合成菌種，以腺苷合成分泌ATP，並添加蛋氨酸和SAM合成酶，偶聯轉化合成SAM的方法。
[0005]米用腺嘌呤合成ATP已經有許多報導(Akihiko Maruyama and Tatsuro Fujl0.Biosc1.Biotechnol.Biochem.2001，65(3):644-650)，腺嘌呤比 ATP 和腺苷的相對分子量都小，採用腺嘌呤合成SAM，在相同分子轉化率情況下，相同重量的腺嘌呤可以產生較多SAM，而且腺嘌呤的價格也較低，因此採用腺嘌呤合成ATP進而合成SAM，有望進一步降低SAM生產成本。
(三)
【發明內容】
[0006]本發明目的是提供一種利用ATP合成菌種構建的SAM工程菌，以腺嘌呤和蛋氨酸等原料轉化合成腺苷蛋氨酸的方法，使該工程菌用腺嘌呤大量合成ATP的同時，高效轉化合成分泌腺苷蛋氨酸的方法。
[0007]本發明採用的技術方案是:
[0008]本發明提供一種生物合成腺苷蛋氨酸的方法，所述方法為:將SAM工程菌經發酵培養獲得的發酵液過濾，取溼菌體在60-65°C乾燥2-3h進行活化處理，獲得活化菌體，活化菌體加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸鹽、硫酸鹽、蛋氨酸和水構成反應體系，在33~37°C條件下進行轉化反應，反應結束後，獲得的反應液即為含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反應體系中活化菌體的用量為70~100g/L(即終濃度)，腺嘌呤的用量為2~4g/L(終濃度)、葡萄糖的用量為80~100g/L(終濃度)，磷酸鹽的用量為70~90g/L(終濃度)，硫酸鹽的用量為3~5g/L (終濃度)，蛋氨酸的用量為3~5g/L (終濃度)；
[0009]所述SAM工程菌是指將釀酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)的SAM合成酶基因2 (sam2)克隆至雅致放射毛黴(Actinomucor elegans) ZGBl中，構建的腺苷蛋氨酸工程菌，即SAM工程菌。具體，本發明採用SAM工程菌是選用能夠大量合成ATP菌種為SAM工程菌的出發菌株，具體選用從腺嘌呤大量合成分泌ATP的雅致放射毛黴(Actinomucor elegans)ZGBl (詳見專利CN102154117A)為出發菌株；再選用SAM合成酶基因，具體選用基因資料庫GeneBank所公布的釀酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)來源的SAM合成酶基因2(sam2,登陸號M23368)，依其序列設計引物，通過PCR擴增得到sam2 ;然後將sam2裝配入重組質粒pCB1004-PgpdA (詳見專利CN1285721C)，得到由強啟動子PgpdA驅動的sam2基因的重組表達質粒pCB1004-PgpdA-sam2，將pCB1004-PgpdA-sam2線性化，轉化上述雅致放射毛黴ZGBl菌株，篩選驗證得到SAM工程菌。
[0010]進一步，優選所述磷酸鹽為磷酸氫二鉀或磷酸氫二鈉。
[0011]進一步，優選所述硫酸鹽為硫酸鎂。
[0012]進一步，優選所述反應體系中活化菌體的用量為80~90g/L(終濃度)，腺嘌呤的用量為3~3.5g/L (終濃度)、葡萄糖的用量為80~90g/L (終濃度)，磷酸鹽的用量為70~80g/L(終濃度)，硫酸鹽的用量為3.5~4.0g/L(終濃度)，蛋氨酸的用量為4.0~4.5g/1(終濃度)。
[0013]進一步，優選所述溼菌體在60~65°C乾燥2~2.5h活化處理。
[0014]本發明反應結束後，SAM產量測定採用高效液相色譜法(HPLC)進行，具體條件:Inertsil 0DS-SP 柱(5 μ m，4.6X 250mm)，流動相 15% 甲醇-85%緩衝液(含 0.6% 乙酸銨、
0.01 %辛烷磺酸鈉的水溶液)，用甲酸調至PH3.0，流速0.5mL/min,檢測波長254nm。
[0015]SAM合成酶基因2(sam2，登陸號M23368)序列為SEQ ID N0.1所示。
[0016]本發明的有益效果主要體現在:
[0017]1、本發明選用能夠從腺嘌呤大量合成分泌ATP的菌株為出發菌株，構建SAM工程菌，使所構建的SAM工程菌能夠從分子量較小、價格較低的腺嘌呤大量合成ATP進而合成SAM,以降低SAM合成成本；並且選用的出發菌株為毛黴菌，菌絲體培養和分離操作簡便，有利於轉化合成反應與產物分離操作；
[0018]2、本發明構建了上述SAM工程菌，使用該菌種可以在已有腺嘌呤合成ATP反應液中添加蛋氨酸,參照已有合成ATP技術直接大量合成分泌SAM，不用外加SAM合成酶，從而省去了 SAM合成酶的菌種培養、SAM合成酶的提取以及在反應中添加SAM合成酶等操作，使生產更為簡便。
[0019]3、腺嘌呤等原料都可以從市場大量較低價購得，利用本發明方法可以高效、大規模合成SAM。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為重組質粒pCB1004-PgpdA_sam2的構建示意圖。
(五)【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此:
[0022]實施例1工程菌的構建
[0023]本發明採用的含有釀酒酵母SAM合成酶基因2(sam2)的SAM工程菌的具體構建方法如下(雅致放射毛黴原生質體製備，目的基因的克隆、酶切驗證、重組質粒構建及轉化、原生質體再生及轉化子篩選的具體條件和方法，詳見論文《ATP合成關鍵酶基因APTl在雅致放射毛黴中的克隆表達》(朱家榮、楊善巖、陳麗芬等.食品與發酵工業，2012，38(6)，43-47.):
[0024]1、實驗材料
[0025]雅致放射毛黴(Actinomucorelegans)ZGBl已在專利 CN102154117A 中公開。
[0026]E.coli DH5 α購於生工生物工程(上海)有限公司；
[0027]釀酒酵母1964(Saccharomyces cerevisiael964)購於中國工業微生物菌種保藏管理中心；
[0028]質粒pCB1004_PgpdA (詳見專利 CN1285721C)；
[0029]pMD19_T simple vector 購於 Takara 公司。
[0030]蝸牛酶(BR)、纖維素酶(BR)購自國藥集團化學試劑有限公司；BamH I,Kpn I等限制酶及所有分子試劑均購自TaKaRa公司；孟加拉紅購於生工生物工程(上海)有限公司；潮黴素B購於上海寶曼生物科技有限公司；其他常用試劑為國產生化或分析純試劑。
[0031]LB培養基(g/L):蛋白腖10，酵母膏5，NaCllO,(瓊脂20)，溶劑為水，ρΗ7.0 ；
[0032]高滲緩衝液(mol/L):山梨醇1.0, Tris0.01，ρΗ7.0 ；
[0033]轉化緩衝液(mol/L):山梨醇1.0, Tris0.01，CaCL225, ρΗ7.0 ；
[0034]種子培養基(g/L):葡萄糖20，蛋白腖10，酵母膏5，NaC15，溶劑為水，ρΗ6.0~6.2,(固體培養加20g/L瓊脂)；
[0035]菌體培養基(g/L):葡萄糖40，酵母膏3，玉米漿10，NH4Cl3, MgSO4.7H201，FeSO4.7Η200.2，K2HPO4.3Η203，溶劑為水，ρΗ6.0 ~6.5 ;
[0036]再生培養基:以高滲緩衝液配製的種子培養基。
[0037]2、實驗方法
[0038]2.1目的基因sam2的獲得
[0039]重組質粒pCB1004_PgpdA在Not I/BamH I位點已連接構巢麴黴(Aspergillusnidutans)甘油醛3-磷酸脫氫酶基因的強啟動子PgpdA，可將目的基因克隆至該啟動子下遊，強化目的基因的表達。此外，該質粒上含有潮黴素和氯黴素抗性基因，可用於陽性轉化子的抗性篩選。
[0040]選用GeneBank所公布的釀酒酵母(Saceharomucescerevisiae)來源的SAM合成酶基因2 (sam2,登陸號M23368)，依其序列和pCB1004_PgpdA的PgpdA下遊BamH I/Kpn I酶切位點設計引物:
[0041]sam-F5，~CGCGGATCCATGTCCAAGAGCAA~3，(BamH I)，
[0042]sam-R5，~CGGGGTACCTTAAAATTCCAATTTC~3，(Kpn I)
[0043]氯化苄法(參見:鍾鈴，汪天虹.氯化苄提取染色體DNA.微生物學雜誌，1997(3):62-63.)提取釀酒酵母總DNA，PCR擴增sam2基因(見表1、表2，sam2基因片段回收、純化採用生工生物工程(上海)有限公司膠回收試劑盒)，T/A克隆至pMD19-T simplevector (見表3)，轉化E.coli DH5 α (利用Takara公司的感受態細胞製備試劑盒製備DH5 α感受態細胞，42°C水浴90s熱擊轉化)，轉化細胞塗布含x_gal40 μ g/ml與IPTG40 μ g/ml的氨苄青黴素100 μ g/ml的LB培養基平板，37°C培養12_16h (藍白斑試驗)，挑出白斑轉化子，轉化子SDS鹼裂解法(楊獻光；齊志廣；趙寶存等.鹼裂解法提取質粒DNA的研究[J].生物技術通報2003 (6): 24-26)提取質粒，BamH I/Kpn I雙酶切(見表4)，I %瓊脂糖凝膠電泳驗證後，由生工生物工程(上海)有限公司完成測序，其序列與GeneBank所公布sam2序列完全相同，雙酶切回收sam2基因片段即獲得目的基因sam2。
[0044]表1PCR 體系
[0045]
【權利要求】
1.一種腺苷蛋氨酸的合成方法，其特徵在於所述方法為:將腺苷蛋氨酸工程菌經發酵培養獲得的發酵液過濾，取溼菌體在60~65°C乾燥2~3h進行活化處理，獲得的活化菌體加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸鹽、硫酸鹽、蛋氨酸和水構成反應體系，在33~37°C條件下進行轉化反應，反應結束，獲得的反應液即為含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反應體系中活化菌體的用量為70~100g/L，腺嘌呤的用量為2~4g/L、葡萄糖的用量為80~100g/L，磷酸鹽的用量為70~90g/L，硫酸鹽的用量為3~5g/L，蛋氨酸的用量為3~5g/L ； 所述腺苷蛋氨酸工程菌是指將來源於釀酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)的SAM合成酶基因2克隆至雅致放射毛黴(Actinomucor elegans)ZGBl中，構建的腺苷蛋氨酸工程菌；所述來源於釀酒酵母的SAM合成酶基因2在GeneBank的基因登陸號為M23368。
2.如權利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特徵在於所述磷酸鹽為磷酸氫二鉀或磷酸氫二鈉。
3.如權利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特徵在於所述硫酸鹽為硫酸鎂。
4.如權利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特徵在於所述反應體系中活化菌體的用量為80~90g/L，腺嘌呤的用量為3~3.5g/L、葡萄糖的用量為80~90g/L，磷酸鹽的用量為70~80g/L，硫酸鹽的用量為3.5~4g/L，蛋氨酸的用量為4~4.5g/L。
【文檔編號】C12R1/645GK103993055SQ201410163487
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】朱家榮, 鄭計瑞, 陳麗芬, 楊善巖 申請人:浙江工業大學