檢測呋喃它酮的磁顆粒化學發光試劑盒及其應用的製作方法

2023-05-11 04:41:01 1

專利名稱：檢測呋喃它酮的磁顆粒化學發光試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種直接化學發光檢測試劑盒及其測試方法，特別是檢測飼料樣本中呋喃它酮殘留量的磁顆率化學發光檢測試劑盒。
背景技術：
呋喃它酮(Frazolidone)是一種人工合成的廣譜抗菌藥，藥效穩定，能抑制或殺滅多種革蘭陽性和陰性菌，並對某些原蟲、真菌有一定作用，由於高效廉價，呋喃它酮在畜牧、水產養殖中得到了廣泛的應用。但呋喃它酮在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入會引起各種疾病，根據聯合國糧食及農業組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)食品添加劑聯合專家委員會的報告，呋喃它酮及其代謝產物有致癌性，且易產生抗藥菌株，容易引起畸胎。我國在2002年3月有農業部發布的《食品動物禁用的首要及其他化合物清單》中將呋喃它酮列為禁用藥。因此建立一種有效地呋喃它酮的檢測方法成為獸藥殘留分析領域中十分緊要的任務。目前，呋喃它酮殘留量的常規檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)和酶聯免疫吸附法(ELISA)等。1、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測精度高、假陽性率低的特點HPLC法對於呋喃它酮的最低檢測限為lyg/kg。HPLC法的主要缺點是儀器價格昂貴，操作比較繁瑣，耗時長，檢測費用昂貴，對檢測人員專業要求較高，樣本前處理較複雜。2、液相色譜-質譜法(LC-MQ，樣品不需要衍生化處理，可對尿液、血液、肝臟、毛髮和眼球樣品進行檢測。LC-MS/MS聯用，可進一步提高信噪比，所以可用於對陽性結果的確認手段。但是，無論LC-MS還是LC-MS/MS，都未能解決儀器造價昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理複雜，對操作人員專業素養要求高等問題。3、酶聯免疫吸附法(ELISA)是20世紀70年代出現，用於微量物質的檢測，最早應用於傳染病、腫瘤標誌物、激素水平等臨床檢測，90年代開始在我國食品安全檢測領域推廣應用，目前依託ELISA技術的試劑盒、試紙條已經成為食品安全快速檢測領域的主導產品，同時也是我公司研發和銷售的主要產品類型。酶聯免疫檢測法基於抗原-抗體的特異性反應，檢測靈敏度較高、特異性較好，技術操作簡易，容易掌握，確實解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質如抗生素、激素、農藥殘留等的定性、定量分析工作，對食品安全快速檢測技術的發展起到了積極的促進作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現在1)非均相反應檢測過程中為分離游離物與結合物，需要多步洗板過程，耗時費力，難以提高操作的自動化程度。2)酶催化反應藉助酶催化底物顯色，測定反應液吸光度值。反應的時間與溫度對酶活力存在較大影響，試劑穩定性差。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種呋喃它酮檢測試劑盒，採用該試劑盒進行呋喃它酮的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應速度。本發明的另一個目的在於提供一種呋喃它酮的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現上述目的，本發明提供一種呋喃它酮檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發光標記物、螢光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用於包被羊抗FITC單克隆抗體，其內芯是!^e3O4或Y -Fe2O3，使得微珠具有順磁性。所述的發光標記物是異魯米諾衍生物標記的呋喃它酮半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。所述的試劑盒還包括標準品，質控品和濃縮洗液。所述的螢光素標記物是FITC標記的呋喃它酮單克隆抗體。本發明還提供一種利用試劑盒檢測呋喃它酮的方法，包括下列步驟1)分別吸取20 μ 1-100 μ 1標準品或樣本，然後加入20 μ 1-100 μ 1發光標記物，再加20 μ 1-100 μ 1螢光素標記物，充分混勻後，37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻後在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清後用清洗液300-500 μ 1衝洗複合物沉澱；4)上述清洗步驟重複2-4次；5) 4)所得分離好的複合物直接放入測量暗箱，加入激發底物1和激發底物2，延遲3-5s後檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關係，可以通過RLU集合標準曲線法計算呋喃它酮的濃度。所述的發光底物的主要成分是NaOH和Η202。本發明中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵1和2、測量室、發光室、光電倍增管計數器和輸出系統，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟體，可進行資料錄入、結果匯總、質量控制、結果儲存和結果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結果，自動生成並儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所採用的系統是CI-2008系統。本發明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是0. 1-0. 3eqm/g,其保存於 pH7. 1-7. 5，含有 3-5 % 酪蛋白，0. 1-0. 3 % 吐溫-20,0. 02-0. 04 %硫柳汞防腐劑，0. 03-0. 05mol/LTRIS緩衝液中。所述的FITC是異硫氰酸螢光素。所述百分
含量為質量百分含量。所述的發光標記物是異魯米諾衍生物ABEI,AHEI或ABEN標記的呋喃它酮半抗原，其保存於ΡΗ7· 2-7. 6，含0. 1-0. 3%吐溫-20，0. 02-0. 04% NaN3的TRIS緩衝液中。所述百
分含量是質量百分含量。所述的螢光素標記物是FITC標記的呋喃它酮單克隆抗體，其保存於ρΗ7. 2-7. 6，含8-10%卵清蛋白，0. 02-0. 04%硫柳汞防腐劑，0. 1-0. 2mol/LPBS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。呋喃它酮標準品溶液(Ong/ml，0.Olng/ml，0. 03ng/m，0. 09ng/ml，0. 27ng/ml，0. 81ng/ml)，標準品稀釋液為 ρΗ7· 2-7. 6,0. 03-0. 05%硫柳汞防腐劑，0. 05-0. lmol/LTRIS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。呋喃它酮質控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml，0. 5ng/ml，質控品稀釋液PH7. 2-7. 4,0. 03-0. 05%硫柳汞防腐劑，0. 05-0. lmol/LTRIS緩衝液。所述百分含量為質量
百分含量。所述的濃縮洗液為ρΗ7· 0-7. 4,0. 2-0. 4%吐溫-20,0. 2-0. 4% NaN3,0. 1-0. 2mol/LPBS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。本發明的有益效果如下1)本發明試劑盒可特異性檢測呋喃它酮，對其他藥物無交叉。2)本發明試劑盒的靈敏度較高，對呋喃它酮的檢測靈敏度可達0. Olng/ml。3)本發明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低於20min。
具體實施例方式實施例1試劑盒具體組分的製備1、發光標記物的製備a)呋喃它酮半抗原的合成將呋喃它酮通過衍生化，製備具有-C00H的呋喃它酮半抗原。b)發光標記物製備取4. 5mmol/L ABEI，溶於4ml蒸餾水中，5. Ommol/L N-羥基琥珀醯亞胺溶於0. 5mlN，N-二甲基甲醯胺中，二者充分混勻後室溫反應3-4h。取上述製備的呋喃它酮半抗原15mg，用pH7. 4PBS調節體積到1. 5ml，然後加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻後室溫反應過夜，過G-25凝膠柱純化。2、螢光標記物製備a)免疫原的製備將呋喃它酮半抗原與卵清蛋白採用混合酸酐法進行偶聯得到免疫原。b)呋喃它酮單克隆抗體的製備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為150 μ g/只，使其產生抗血清。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復甦將雜交瘤細胞用凍存液製成IX IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。單克隆抗體的製備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天後腹腔注射雜交瘤細胞5 X IO5個/只，7天後採集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。C)螢光標記物製備
用0. 025mol/L, pH9. 0的碳酸鹽緩衝液將呋喃它酮單克隆抗體稀釋成質量百分比濃度；根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加0. Olmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩衝液將FITC配成0. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4°C避光條件下電磁攪拌、標記30-4 ；將標記溶液3000r/min,室溫離心20min，除去其中少量的沉澱物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩衝液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物，通過kphadexG-25或G-50柱，分離游離螢光素，收集標記的螢光標記物進行鑑定，分裝，貯存於4°C冰箱中。3、分離試劑製備a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購於DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是0. 15eq/g;取100 μ 1 磁珠，用 100 μ 1 25mmol/L, ρΗ5· 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗滌兩次，磁分離後移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ 1新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置於磁分離架上磁分離鈿in，移除上清，加入100μ l，25mmol/L，pH5. 0，MES清洗2-3次後即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯羊抗FITC單克隆抗體將50-100 μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60 μ 1，25mmol/L，ρΗ5· OMES中，用所述MES溶液調節總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與羊抗FITC單克隆抗體；室溫條件下至少偶聯30min或4°C偶聯2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態；離心管置於磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應的-C00H，可加入100μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應15min 或 100μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA,0. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3_5次；最後將磁珠復溶於含0. 1-0. 5%BSA, 0. 01-0. 1% Tween-20, 0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩衝液中，2_8°C保藏。實施例二試劑盒的組建組建檢測呋喃它酮的磁顆粒化學發光檢測試劑盒，使其含有下列組分FITC標記的呋喃它酮單克隆抗體的螢光標記物ABEI標記的呋喃它酮半抗原的發光標記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米磁珠的分離試劑呋喃它酮標準品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/m，0. 09ng/ml，0. 27ng/ml，0. 81ng/ml)，標準品稀釋液為ρΗ7· 4，含有0. 05% NaN3,0. lmol/LTRIS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。呋喃它酮質控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml,0. 5ng/ml，質控品稀釋為pH7. 4，含有0. 05%硫柳汞防腐劑，0. lmol/LTRIS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。濃縮洗液為ρΗ7· 2,0. 4%吐溫-20,0. 3% NaN3，0. lmol/L PBS緩衝液。所述百分
含量為質量百分含量。實施例三實際樣品中呋喃它酮的檢測1、飼料樣本前處理稱取l.Og士0. 05g飼料樣本至50ml離心管中，加入8ml乙酸乙酯，再加入^iil乙腈；振蕩5min，靜止lOmin，室溫3000g以上，離心lOmin，取上層清液2ml至IOml乾淨的玻璃試管中，於50 60°C水浴氮氣流下吹乾；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加入Iml復溶工作液，用渦旋儀渦動30s ；3000g以上，室溫O0_25°C )離心IOmin ；除去上層有機相，取下層水相200μ 1與200 μ 1復溶工作液混勻；取50 μ 1用於分析，樣品稀釋倍數:10。2、用試劑盒檢測與結果分析分別吸取20 μ 1-100 μ 1標準品、樣本，然後加入20 μ 1-100 μ 1發光標記物，再加20 μ 1-100 μ 1螢光素標記物，充分混勻後，37°C溫育15min ；加入包被有抗FITC抗體的磁珠80-150μ 1，混勻後在37°C溫育5min ；用磁分離架分離5min，棄上清後用清洗液300-500 μ 1衝洗複合物沉澱；所得分離好的複合物直接放入測量暗箱，加入激發底物1和激發底物2，延遲3- 後檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中呋喃它酮的含量與RLU成一定比例關係，可以通過RLU結合標準曲線法計算呋喃它酮的濃度。激發底物1是NaOH，激發底物2是H202。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10_20遍，排空管道內殘存的水跡後，再將相應的底物直接放入儀器內，將泵管插入底物瓶中；用底物衝洗管道5次，並測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理範圍內。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，並蓋上蓋子，以防蒸發。隨後用蒸餾水清洗管道，並排空，以免強鹼溶液腐蝕底物泵。本發明採用6 個呋喃它酮標準品(Ong/ml,0. 0lng/ml,0. 03ng/ml,0. 09ng/ml,0. 27ng/ml,0. 81ng/ml)進行曲線測繪。儀器根據所述方法檢測得到一條RLU值與呋喃它酮濃度相關的定標曲線，此後測量中，每一個樣本中的呋喃它酮濃度與標準曲線相比較得出樣本中的呋喃它酮殘留含量。實施例四試劑盒質量的測定1、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為0. 0lng/ml 02、樣本的準確度和精密度準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重複性，常用變異係數表示。按照實施例三的樣本提取方法，以0. 2ng/g、0. 4ng/g兩個濃度的呋喃它酮對飼料樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結果見下表。表1準確度和精密度測定ng/g
權利要求
1.一種檢測呋喃它酮的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有發光標記物、螢光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述的順磁性納米微珠是裡面包覆有Fe3O4或γ -Fe2O3，表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特徵在於所述的發光標記物是異魯米諾衍生物標記的呋喃它酮半抗原。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述的異魯米諾發光標記物是ABEI、AHEI 或 ABEN。
6.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒還包括標準液、質控品和濃縮洗液。
7.根據權利要求1-3之一所述的試劑盒，其特徵在於所述的螢光素標記物是FITC標記的呋喃它酮單克隆抗體。
8.一種利用權利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測呋喃它酮的方法，包括下列步驟1)分別吸取20μ 1-100 μ 1標準品或樣本，然後加入20 μ 1-100 μ 1發光標記物，再加·20 μ 1-100 μ 1螢光素標記物，充分混勻後，37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ1，混勻後在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清後用清洗液300-500μ 1衝洗複合物沉澱；4)上述清洗步驟重複2-4次；5)所得分離好的複合物直接放入測量暗箱，加入激發底物1和激發底物2，延遲3- 後檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中呋喃它酮的含量與RLU成一定比例關係，可以通過RLU集合標準曲線法計算呋喃它酮的濃度。
全文摘要
本發明涉及一種檢測呋喃它酮的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有發光標記物、螢光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。發光標記物是異魯米諾發光標記物標記的呋喃它酮半抗原，螢光標記物是指螢光素或其衍生物標記的呋喃它酮單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發明還涉及一種採用所述的試劑盒飼料中呋喃它酮的方法，本方法對呋喃它酮檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
文檔編號G01N33/52GK102565403SQ20101059292
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者萬宇平, 何方洋, 馮才茂, 馮月君, 常平平, 羅曉琴, 陳娟 申請人:北京勤邦生物技術有限公司