結合egfr家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途

2023-05-10 22:18:01

結合egfr家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途
【專利摘要】本發明屬於分子生物學和免疫學領域，涉及一種結合EGFR家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途。具體地，本發明涉及一種嵌合抗原受體，包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽以及跨膜區，其中，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽包含HERIN。本發明在維持T細胞殺傷特異性的前提下，提高了T細胞的增殖能力與殺傷作用。
【專利說明】結合EGFR家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學和免疫學領域，涉及一種結合EGFR家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途。
【背景技術】
[0002]腫瘤過繼細胞治療(adoptive cell therapy, ACT)是將經處理的自體或異體免疫細胞(主要是自體細胞)回輸給腫瘤患者，以增強患者免疫功能，達到治療目的的方法。當前腫瘤ACT進展迅速,利用腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-1nfiltrating lymphocyte, TIL)開展的過繼免疫治療方案針對黑色素瘤取得了非常好的臨床效果(Science2002; 298:850-4)。然而，T細胞活化需要兩個信號的刺激，即兩種T細胞活化相關信號。其中，T細胞表面TCR-CD3複合體與抗原肽-MHC分子結合，提供T細胞活化的第一信號，決定T細胞的殺傷特異性；T細胞表面的共刺激分子(如CD28)與相應配體(如Β7)結合，提供T細胞活化的第二信號，促進T細胞活化、增殖與存活。但腫瘤細胞第一信號刺激源(如MHC分子)與第二信號配體(如Β7)等缺乏或表達下降，無法有效提供T細胞活化相關的信號，從而激活T細胞免疫反應。因而，需要對T細胞進行基因改造。目前主要通過轉基因TCR(T cell receptor)及嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors, CAR)兩種方式來實現這種T細胞的基因改造(Blood 2010;116:103 5-44 ；Nat Rev Clin Oncol 2011;8:577-85)。
[0003]TCR改造具有比較大的限制性，①轉基因TCR鏈可能與病人的內源性的TCR鏈發生錯配，從而導致T細胞表面腫瘤反應性的TCR密度減少；(D TCR識別MHC分子遞呈的抗原，但不同的病人MHC分子是不同的，所以必須分離對所有MHC單體型特異的TCR，可操作性低；
③大部分TCR不能識別糖類或糖脂類抗原，抗原選擇範圍較窄只提供T細胞活化相關的第一信號，沒有提供第二信號，療效不足。因而，嵌合抗原受體CAR受體受到更多的青睞。
[0004]嵌合抗原受體(CAR)由一個scFv單鏈抗體(由抗體VL區胺基酸序列和VH區胺基酸序列經Linker連接而成),通過鉸鏈結構與源於TCR複合體或者IgE高親和受體的跨膜和胞內信號結構連接構成。表達CAR的T細胞可通過非MHC限制性途徑與抗原反應。此外，與常規的TCR只能針對的蛋白抗原相比，CAR並不局限於蛋白抗原，還包括糖類和糖脂類TAA,而這些抗原不像蛋白抗原那麼容易突變(Curr Opin Immunol 2009;21:215-23 ；Blood2010;116:1035-44 ；Cancer Res2011;71:3175-81 ；J Cancer 2011;2:378-82)。
[0005]自1989年，由Eshhar和其同事首次提出CAR的概念以來，其已經歷了三個不同的發展階段。
[0006]第一代CAR，包含胞外特異識別腫瘤抗原的scFv片段，胞內激活信號由⑶3 ζ或Fe ε RI y 的 ITAM (immunoreceptor tyros ine-based activation motifs)信號鏈來傳遞。但是第一代CAR受體缺乏T細胞的共刺激信號，導致T細胞只能發揮瞬間效應，在體內存在時間短、細胞因子分泌少。
[0007]第二代CAR在第一代CAR的基礎上增加了一個共刺激信號分子的胞內結構域，提供 T 細胞活化的兩種信號，包括如 CD28，CD134/0X40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specificprotein tyrosine kinase (LCK), inducible T-cell co-stimulator (ICOS)以及DNAX-activation protein 10 (DAPlO)等結構域,增強了 T細胞的增殖能力及細胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-Y以及GM-CSF增加，從而突破腫瘤微環境的免疫抑制、延長Al⑶(activation induced cell death, Al CD)。
[0008]第三代CAR，在第二代CAR的基礎上，增加了另外一種共刺激信號分子的胞內結構域，如在共刺激結構⑶28和I TAM信號鏈的之間再融合一個二級共刺激分子如4-1BB，產生一個三重信號的CAR，第三代CAR改造的T細胞具有更好的效應功能和體內存活時間。
[0009]目前，美國已有29項CAR修飾的T細胞過繼治療方案進入臨床試驗(Blood2010;116:1035-44 ；Nat Rev Clin Oncol 2011 ;8:577_85)。可以看到，第一代CAR只提供T細胞活化的第一信號，第二代與第三代的CAR是將T細胞激活所需的兩個信號進行了合併，將第二信號CD28或/和4-1BB細胞內信號區域直接連接到CD3z分子，從而繞過了腫瘤細胞通常第二信號如B7等缺乏所引起T細胞不能激活的障礙，第一信號與第二信號合併後，大大提高了對T細胞激活、增殖及殺傷能力，使之療效大幅度增加。但隨之給臨床治療帶來了一定風險，因為第二代與第三代CAR修飾後T細胞會針對某些少量表達腫瘤相關抗原的正常組織產生超強的反應，呈「瀑布」式過量增加，造成對正常組織的過激免疫反應。目前已有兩個注射CAR修飾後的T細胞而導致死亡的病例報導。其一例應用第三代CAR(針對Her2)，患者由於急性肺水腫而死亡，其原因是CAR+的T細胞誤攻擊低表達Her2的肺上皮細胞(MolTher 2010; 18:843-51);另一例應用第二代CAR (針對CD19)，死亡原因複雜，但伴隨著血液中細胞因子水平的增高(Hum Gene Ther 2010;21:1039-42 ；Mol Ther 2010;18:666-8)。
[0010]為解決這一安全性隱患，研究者將HSV-TK、A Fas、iCasp9、CD20_Rituximab等自殺系統引入T細胞的CAR修飾，發揮剎車作用，避免T細胞過量增殖(J Cancer2011;2:378-82 ；N Engl J Med 2011;365:1673-83)。然而，CAR+的 T 細胞脫靶引發的「瀑布」效應速度非常快，這些自 殺系統未必能及時發揮作用。另一種方法是減少CAR+的T細胞回輸數量，然而這種方案會使治療療效下降。
[0011 ] 因此，非常有必要對CAR自身的反應體系進行改造，提高CAR介導的腫瘤ACT的臨床安全性。

【發明內容】

[0012]本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種嵌合抗原受體。所述嵌合抗原受體能夠結合表皮生長因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)家族多個蛋白成員。具體地說，該嵌合抗原受體通過具有結合腫瘤細胞廣泛表達的EGFR膜受體家族蛋白多個蛋白成員能力的多肽，來傳遞T細胞活化相關信號。在本發明的一個實施方案中，用其傳遞T細胞活化相關的第一信號，能修飾未經抗原刺激活化的T細胞，特異殺傷EGFR家族蛋白過表達的細胞。用其傳遞T細胞活化相關的第二信號，能與另一種識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的第一代嵌合抗體受體組成雙嵌合抗原受體系統，共修飾未經抗原刺激活化的T細胞，或者單獨修飾經腫瘤抗原活化的T細胞，在維持其殺傷特異性的前提下，提高了T細胞的增殖能力與殺傷作用。由此提供了下述發明:
[0013]發明概述
[0014]本發明的一個方面涉及一種嵌合抗原受體，包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段和/或共刺激信號分子胞內結構域肽段，其中，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽包含HERIN。
[0015]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其中，所述跨膜區選自CD28跨膜區、CD8跨膜區、⑶3 ζ跨膜區、⑶134跨膜區、⑶137跨膜區、ICOS跨膜區、和DAPlO跨膜區中的一種或多種。
[0016]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其中，所述免疫受體酪氨酸活化基序肽段為CD3 ζ和/或Fe ε RI Y。
[0017]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其中，所述共刺激信號分子胞內結構域肽段選自CD28、CD134/0X40、CD137/4_1BB、LCK、IC0S、和DAPlO胞內結構域的肽段中的一種
或多種。
[0018]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其中，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽為單拷貝或多拷貝；具體地，為雙拷貝。
[0019]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽還包含 MUCl scFv-VH 和 MUCl ScFv-VL0
[0020]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其還包含信號肽，並且所述信號肽選自SEQ ID NO:17 (信號肽I)或SEQ ID NO: 19所示的肽段(信號肽2)。
[0021]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其中，其各部分即高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、免疫受體酪氨酸活化基序肽段和/或共刺激信號分子胞內結構域肽段、以及可選的信號肽之間`通過linker連接,優選地,所述linker選自SEQ ID NO:21(linkerl),SEQ ID NO:23 (linker2)、SEQ ID NO:25 (linker3)、SEQ ID NO:27 (linker4)、或 SEQ ID NO:29 (linker 5)所示的肽段。
[0022]不拘於理論的限制，本發明人通過選擇合適的信號肽和linker，增大了嵌合抗原受體的表達量，有利於得到空間構象更佳的嵌合抗原受體，從而提高了嵌合抗原受體的活性。
[0023]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其胺基酸序列為或者包含選自SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45JPSEQID NO:49所示的胺基酸序列。
[0024]本發明的另一方面涉及一種核酸，其編碼本發明中任一項所述的嵌合抗原受體；具體地,所述核酸為或者包含SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50 所示的核苷酸序列。
[0025]本發明的再一方面一種重組載體，其包含本發明任一項所述的核酸；具體地，所述重組載體為重組真核表達載體或重組病毒載體；更具體地，所述重組真核表達載體為重組P⑶NA3.1 ( + )載體；所述重組病毒載體為重組逆轉錄病毒載體；進一步具體地，所述重組逆轉錄病毒載體為重組pMXs-1RES-GFP載體。
[0026]本發明的再一方面涉及一種重組細胞，其包含本發明任一項所述的重組載體；具體地，所述重組細胞為重組T細胞；更具體地,所述重組細胞為重組Jurkat E6.1細胞。
[0027]本發明的再一方面涉及一種T細胞，其表達本發明中任一項所述的嵌合抗原受體。
[0028]本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體遺傳修飾的T細胞；具體地,所述T細胞為Jurkat E6.1細胞；具體地,所述遺傳修飾為基因槍法、轉染、電轉、或病毒轉導。
[0029]本發明的再一方面涉及一種組合物，其包含一種或多種本發明中任一項所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體或重組細胞或T細胞；可選地,其還包含藥學上可接受的載體或輔料。
[0030]根據本發明任一項所述的組合物，其為藥物組合物。
[0031]根據本發明任一項所述的組合物，其包含兩種嵌合抗原受體，其中，一種嵌合抗原受體包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段，另一種嵌合抗原受體包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及共刺激信號分子胞內結構域肽段。在本發明的一個實施方案中，所述組合物由兩種嵌合抗原受體組成，其中，一種嵌合抗原受體包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段，另一種嵌合抗原受體包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及共刺激信號分子胞內結構域肽段。
[0032]本發明將第一信號與第二信號從單一 CAR中分開,構建了雙信號獨立的兩種嵌合抗原受體，兩種CAR分別識別腫瘤細胞兩個不同家族的抗原，分別傳遞T細胞活化相關的兩種信號，有效地避免了安全性問題。
[0033]上述的兩種嵌合抗原受體可以在同一個載體中表達，也可以在獨立的載體中分別表達。
[0034]根據本發明任一項所述的組合物，其中，所述跨膜區選自CD28跨膜區、CD8跨膜區、⑶3 (跨膜區、⑶134跨膜區、⑶137跨膜區、ICOS跨膜區、和DAPlO跨膜區中的一種或多種。`
[0035]根據本發明任一項所述的組合物，其中，所述免疫受體酪氨酸活化基序肽段為CD3 ^ 和 / 或 Fe e RI Y。
[0036]根據本發明任一項所述的組合物，其中，所述共刺激信號分子胞內結構域肽段選自 CD28、CD134/0X40、CD137/4-1BB、LCK、ICOSjP DAPlO 胞內結構域的肽段中的一種或多種。
[0037]根據本發明任一項所述的組合物，其中，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽為單拷貝或多拷貝；具體地，為雙拷貝。
[0038]根據本發明任一項所述的組合物，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽還包含MUCl scFv-VH和 MUCl ScFv-VL0
[0039]根據本發明任一項所述的嵌合抗原受體，其胺基酸序列獨立地為或者包含選自SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:4U SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO:45 JPSEQ ID NO:49所示的胺基酸序列中的一種、兩種、或多種。
[0040]本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體或重組細胞或T細胞在製備治療和/預防和/輔助治療惡性腫瘤或病毒感染性疾病的藥物中的用途；具體地，所述腫瘤為肺癌、肝細胞癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌、或前列腺癌；具體地，所述病毒為愛滋病病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、皰疫病毒(Herpesvirus)、或巨細胞病毒(cytomegalovirus)。
[0041]本發明的再一方面涉及一種治療和/或預防和/或輔助治療惡性腫瘤或病毒感染性疾病的方法，包括使用有效量的本發明中任一項所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體或重組細胞或T細胞的步驟；具體地，所述腫瘤為肺癌、肝細胞癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌、或前列腺癌；具體地，所述病毒為愛滋病病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、抱疫病毒(Herpesvirus )、或巨細胞病毒(cytomegalovirus ) o
[0042]發明詳述
[0043]如上文所述，本發明涉及一種嵌合抗原受體。更具體地說，該嵌合抗原受體通過具有結合腫瘤細胞廣泛表達的EGFR膜受體家族蛋白能力的多肽來傳遞T細胞活化相關信號。
[0044]本發明中術語「嵌合抗原受體」(chimeric antigen receptors, CAR)是人工改造受體，能夠將識別腫瘤抗原的特異性分子(如抗體)錨定在免疫細胞(如T細胞)上，使免疫細胞識別腫瘤抗原和殺死腫瘤細胞。
[0045]本發明中術語「T細胞活化相關信號」是指與T細胞活化所需要兩個信號，即T細胞表面TCR-CD3複合體與抗原肽-MHC分子結合，提供T細胞活化的第一信號，決定T細胞的殺傷特異性；T細胞表面的共刺激分子(如CD28)與相應配體(如B7)結合，提供T細胞活化的第二信號，促進T細胞活化、增殖與存活。
[0046]本發明中術語「 免疫受體酪氨酸活化基序」(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs, ITAM )是指免疫細胞活化相關受體(如BCR/Ig a/Ig旦，TCR/Q33、Fca R和FcRy等)胞漿區所共有的以酪氨酸殘基(tyrosine，Y)為基礎的胺基酸序列基序，其特徵為:兩個酪氨酸殘基被大約13外其它氨酸殘基隔開(...YXX[L/V]X 7-1IYXX[L/V]...)，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位點，被磷酸化後能夠與信號轉導途徑下遊的信號分子結合，導致細胞的活化。
[0047]本發明中術語「共刺激信號分子」(Co-stimulating molecule)是指免疫細胞表面的一些粘附分子，如⑶28、⑶134/0X40、⑶137/4-1BB、⑶40等，通過與其配體結合，激活免疫細胞的第二信號，增強免疫細胞的增殖能力及細胞因子的分泌功能，延長活化免疫細胞的存活時間。
[0048]本發明中術語「單鏈抗體」(single-chainantibody variable regionfragment, scFv)是指由抗體VL區胺基酸序列和VH區胺基酸序列經Linker連接而成,具有結合抗原能力的抗體片段。
[0049]本發明中術語「EGFR」是指人類表皮生長因子受體(epidermal growth factorrec印tor)，又簡稱為 ERBBl 或 HER1，其家族成員包括 EGFR、ERBB2 (HER2)、ERBB 3 (HER 3)、ERBB4 (HER4)。
[0050]本發明中術語「Herin」或「HERIN」是指人類Her2的第8個內含子中編碼Herstatin的C末端79個胺基酸的DNA序列。
[0051]在本發明的一個實施方案中，構成嵌合抗原受體為HERIN、⑶28跨膜區、⑶3 ^信號鏈(G1-CARecfkX
[0052]在本發明的一個實施方案中，構成嵌合抗原受體為HERIN、⑶28跨膜區、⑶28胞內區、CD3(信號鏈(G2-CAREeFK)。
[0053]在本發明的一個實施方案中，構成嵌合抗原受體為HERI N、⑶28跨膜區、⑶28胞內區、4-1BB共刺激肽段、CD 3(信號鏈(G 3-CARegfe)0
[0054]在本發明的一個實施方案中，構成抗原嵌合受體為HERIN、⑶28跨膜區、⑶28胞內區(CAR2aEGFK)。
[0055]在本發明的一個實施方案中，構成抗原嵌合受體為HERIN、⑶28跨膜區、4-1BB共刺激肽段(CAR2b_)。
[0056]在本發明的一個實施方案中，構成抗原嵌合受體為HERIN、⑶28跨膜區、⑶28胞內區、4-1BB共刺激肽段(CAR2cegfk)。
[0057]在本發明的一個實施方案中，應用CAR2cE(；FK與針對腫瘤相關抗原MUCl的第一代嵌合抗原受體CARl ?01 (由抗MUCl的ScFv、⑶8跨膜區、⑶3(信號鏈構成)共同修飾未經抗原刺激的T細胞株。
[0058]在本發明的一個實施方案中，應用CAR2aEeFK或CAR2bEeFK修飾肝癌組織中分離培養的TIL細胞。
[0059]在本發明的一個實施方案中，應用CARlffiia與CAR2cE(；FK修飾的T細胞體外殺傷A431腫瘤細胞。
[0060]在本發明的一個實施方案中，應用CAR2aKFK或CAR2bKFK修飾後的TIL細胞體外殺傷SMMC-7721肝癌細胞。[0061]在本發明中，
[0062]術語「有效量」是指可在受試者中實現治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病或病症的劑量。
[0063]本文所用的術語「組合物」意指包括包含指定量的各指定成分的產品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產生的任何產品。
[0064]術語「組合物」，其還可以是指藥物組合物，可用於在受試者中實現治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病或病症。
[0065]術語「受試者」可以指患者或者其它接受本發明組合物以治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病或病症的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。
[0066]術語「疾病和/或病症」是指所述受試者的一種身體狀態，該身體狀態與本發明所述疾病和/或病症有關。
[0067]可改變本發明藥物組合物中各活性成分的實際劑量水平，以便得到能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應。劑量水平須根據具體活性、給藥途徑、所治療病況的嚴重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領域的做法是，劑量從低於為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。
[0068]發明的有益效果
[0069]與現有T細胞的CAR修飾方法相比，本發明具有如下有益效果:
[0070]本發明將具有結合腫瘤細胞廣泛表達如EGFR家族成員蛋白能力的多肽引入嵌合抗原受體，用其傳遞T細胞活化相關的第一信號，能修飾未經抗原刺激活化的T細胞，特異殺傷EGFR過表達的細胞。用其傳遞T細胞活化相關的第二信號，能與另一種識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的第一代嵌合抗體受體組成雙嵌合抗原受體系統，共修飾未經抗原刺激活化的T細胞，在保證安全性(如實施實例6-8所示，相對於MUCl的第三代CAR,對MUCl低表達的細胞的非特異性殺傷明顯減弱)的前提下，提高T細胞的增殖能力與殺傷作用；或者用於修飾經腫瘤抗原活化的T細胞，在維持其殺傷特異性的前提下，提高T細胞的增殖能力與殺傷作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0071]圖1:CAR的結構模式圖。SP表不信號肽，SPl表不信號肽I, SP2表不信號肽2 ；L1- L5 分別表示 Linker 1-Linker 5; CD28TM 表示 CD28 跨膜區；CD28IR 表示 CD28 胞內區；⑶28表示或包含⑶28跨膜區與胞內區。
[0072]圖2:CARImuciCAR2egfe 的表達載體結構圖(簡稱 pcDNA 3.1-CARl: 2)。
[0073]圖3:A-B,經EGFR家族特異性 CAR修飾的 Jurka t 細胞(JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eCAK、JurkatG3^eCAE)接觸A431或MCF7腫瘤細胞後的增殖情況。
[0074]圖4:經 EGFR 家族特異性 CAR 修飾的 Jurkat 細胞(JurkatG1-eGAK、JurkatG2_eCAE,JurkatG3^eCAE)與A431或MCF7腫瘤細胞共培養後，INFr y的分泌量。
[0075]圖5:A-B,經EGFR家族特異性 CAR修飾的 Jurka t 細胞(JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eCAK、JurkatG3^eCAE)對A431或MCF7腫瘤細胞的殺傷作用。
[0076]圖6:A-C,經雙 CAR 修飾的 Jurkat 細胞(JurkatmGAKleGAK2)及 MUCl 特異性單 CAR 修飾的 Jurka t 細胞(JurkatmGAK1、JurkatG3_mGAK1)接觸 A431、MCF7、U_20S 腫瘤細胞後的增殖情況。
[0077]圖7:經雙CAR修飾的Jurkat細胞(JurkatmGAKleGAK2)及MUCl特異性單CAR修飾的Jurka t 細胞(Jurka tmG AK1、JurkatG3-mGAK1)與 A431、MCF7、U_20S 腫瘤細胞共培養後，INFr y的分泌量。
[0078]圖8:A-C,經雙 CAR 修飾的 Jurkat 細胞(JurkatmGAKleGAK2)及 MUCl 特異性單 CAR 修飾的 Jurkat 細胞(Jurka tmCAE\ JurkatG3_mCAE1)對 A431、MCF7、U-20S 腫瘤細胞的殺傷作用。
[0079]圖9:經CAR修飾前後TI L細胞接觸SMMC-7721後的增殖情況。
[0080]圖10:經CAR修飾前後TIL細胞對SMMC-7721的殺傷作用。
【具體實施方式】
[0081]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)、相應的參考文獻、或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0082]實施例1 =CAR表達框的合成與表達載體的構建
[0083]根據構成CAR各組分的胺基酸序列與編碼序列，拼接成整個融合的胺基酸序列與編碼DNA表達框，其中構成CAR2aE(；FK及CAR2bKFK的肽段包括:
[0084]HERIN的胺基酸殘基序列為:
[0085]GTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEG(SEQ ID NO:1)。[0086]HERIN的編碼序列為:
[0087]GGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGC(SEQ ID NO:2)。
[0088]⑶28跨膜區(⑶28TM)胺基酸殘基序列為:
[0089]PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFffVRS(SEQ ID NO:3)。
[0090]⑶28跨膜區(⑶28TM)的編碼序列為:
[0091 ] CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGT(SEQ ID NO:4)。
[0092]⑶28胞內區(⑶28IR)胺基酸殘基序列為:
[0093]KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:5)。
[0094]⑶28胞內區(⑶28IR)的編碼序列為:
[0095]AAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:6)。
[0096]⑶28跨膜區及胞內區(⑶28)胺基酸殘基序列為:
[0097]PFWVLVVVGGVLAC`YSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:7)。
[0098]⑶28跨膜區及胞內區(⑶28)的編碼序列為:
[0099]CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:8)。
[0100]⑶3 (的胺基酸殘基序列為:
[0101 ] RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)。
[0102]⑶3 4的編碼序列為:
[0103]AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:10)。
[0104]4-1BB共刺激信號域肽段(41BB)的胺基酸殘基序列為:
[0105]KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:11)。
[0106]4-1BB共刺激信號域肽段(41BB)的編碼序列為:
[0107]AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:12)。
[0108]MUCls cFv-VH (VHmuci)的胺基酸殘基序列為:EVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)。[0109]MUCl scFv-VH (VHmuci)的編碼序列為:
[0110]GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:14)。
[0111]MUCl scFv-VL (VLmuci)的胺基酸殘基序列為:
[0112]DIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLI⑶KAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSE(SEQ ID NO:15)。
[0113]MUCls cFv-VL ( VLmuci )的編碼序列為:
[0114]GATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAG(SEQ ID NO:16)。
[0115]信號肽I的胺基酸殘基序列為:
[0116]MEFffLSffVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO: 17)。
`[0117]信號肽I編碼序列為:
[0118]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:18)。
[0119]信號肽2的胺基酸殘基序列為:
[0120]MEAPAQLLFLLLLffLPDTTG(SEQ ID NO: 19)。
[0121]信號肽2編碼序列為:
[0122]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ IDNO:20)。
[0123]Linkerl的胺基酸殘基序列為:
[0124]EPKSCDKTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO:21)。
[0125]Linkerl的編碼序列為:
[0126]GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA(SEQ ID NO:22)。
[0127]Linker2的胺基酸殘基序列為:
[0128]GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)。
[0129]Linker2的編碼序列為:
[0130]GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCG(SEQ ID NO:24)。
[0131]Linker3的胺基酸殘基序列為:
[0132]GGGGGGGGG (SEQ ID NO:25)。
[0133]Linker3的編碼序列為:
[0134]GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT(SEQ ID NO:26)。
[0135]Linker4的胺基酸殘基序列為:[0136]GGSGSGGSGSGGSGS(SEQ ID NO:27)。
[0137]Linker4的編碼序列為:
[0138]GGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCT(SEQ ID NO:28)。
[0139]Linker5的胺基酸殘基序列為:
[0140]PKLEEGEFSEARVDIVLTQSP (SEQ ID NO:29)。
[0141]Linker5的編碼序列為:
[0142]CCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCA (SEQID NO:30)。
[0143]⑶8跨膜區肽段(⑶8TM)的胺基酸殘基序列為:
[0144]YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:31)。
[0145]⑶8跨膜區肽段(⑶8TM)的編碼序列為:
[0146]TACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:32)。
[0147]Furin_2A的胺基酸殘基序列為:
[0148]RAKRAPVKQTLNFDL LKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:33)。
[0149]Furin_2A的編碼序列為:
[0150]CGTGCTAAACGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCC(SEQ ID NO:34)。
[0151]G1-CARegfk 依次由信號肽 1-HERIN-Linkerl-CD28TM-Linker2-CD3 4 融合構成(見圖1)，其胺基酸序列為:
[0152]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:35)。
[0153]G1-CARkfk的編碼序列為:
[0154]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:36)。
[0155]G2-CARegfk 依次由信號肽 1-HERIN-Linkerl-CD28TM-CD28IR—Linker2-CD3 ^ 融合構成(見圖1)，其胺基酸序列為:
[0156]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:37)。
[0157]G2-CAREeFK的編碼序列為:
[0158]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:38)。
[0159]G3-CARegfe 依次由信號肽-HERIN-Linkerl-CD28TM-CD28IR—Linker2-4-lBB-Linker3-CD3 (融合構成(見圖1):
[0160]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGSGGGGSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGGGGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:39)。
[0161]G3-CAREeFR的編碼序列為:
[0162]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:40)。
[0163]CAR2aEGFE依次由信號肽1_HERIN-Linker2-CD28融合構成(見圖1)，其胺基酸序列為:
[0164]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:41)。
[0165]CAR2aEGFE的編碼序列為:
[0166]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:42)。
[0167]CAR2bEGFE 依次由信號肽 1_HERIN-Linker2-CD28TM-Linker3-41BB 融合構成(見圖1)，其胺基酸序列為:
[0168]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:43)。
[0169]CAR2bEGFK的編 碼序列為:
[0170]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:44)。
[0171]CAR2cEeFK 依次由信號肽 1-HERIN-Linker2-CD28-Linker3-41BB 融合構成(見圖 1)，其胺基酸序列為:
[0172]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:45)。
[0173]CAR2cEGFK的編碼序列為:
[0174]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO:46)。
[0175]CARImuci 依次由信號肽 S-VHffiic1-LinkeM-VLffiic1-Linkerl-CDSTM-LinkerS-CDS ζ 融合構成(見圖1)，其胺基酸序列為:
[0176]MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:47)。
[0177]CARImuci的編碼序列為:[0178]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:48)。
[0179]CAR1muc1CAR2egfe 由 CARImuci 與 CAR2cE(；FK 經 Furin_2A 連接構成，其胺基酸序列為:
[0180]MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFffVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:49)。
[0181]CAR1muc1CAR2egfe 的編碼序列為:
[0182]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCCGTGCTAAACG`AGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:50)。
[0183]對照G S-CkRwci 依次由信號肽 Z-VH^a-LinkeM-VLj^-Linkerl-a^S-Linkerfl1BB-Linker5-CD3 ζ融合構成(見圖1 )，其胺基酸序列為:[0184]MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLI⑶KAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:51)。
[0185]GS-CARmuci的編碼序列為:[0186]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQID NO:52)。
[0187]分別按G1-CARkfk 的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:36)、G2-CARegfe 的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:38)、G3-CAR腿的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:40)，CAR2aEGFE 的 DNA 編碼序列(SEQ ID 勵:42)、0麼1?21^(^的0嫩編碼序列(SEQ ID NO:44)、CAR2cEeFK 的 DNA 編碼序列(SEQID NO:46) XARImuci 的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:48),CARImuciCAR2EGFE 的編碼序列(SEQ IDNO:50)、G3-CAR?cl的編碼序列(SEQ ID NO:52)，委託生工⑧生物工程(上海)有限公司合成其整個表達框，插入PCDNA3.1 ( + )載體(Invitrogen) EcoR1-XbaI位點(見圖2)，轉化到E.coli (DH5 a )，經測序正確後,使用Qiagen公司的質粒純化試劑盒提取並純化質粒,獲得各重組表達載體的聞品質質粒。[0188]實施例2:T細朐株的遺傳修飾
[0189]將實施例1中構建並純化獲得的各重組表達載體的高品質質粒，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)分別轉染至Jurkat Ε6.1 (Τ淋巴細胞株，購自美國典型物保藏中心，ATCC)。2天後，將轉染後的Jurkat Ε6.1細胞轉移到具有新黴素的RPMI1640培養基中，並通過有限稀釋法將細胞克隆化。經21天的篩選，分別建立具有新黴素抗性、經 G1-CARegfk、G2-CARegfe, G3-CAR腿、CARImuci, CAR1muc1CAR2egfe, G3-CAR腿遺傳修飾的Jurkat Ε6.I 細胞株 Jurkat G1_eGAK、Jurkat G2_eGAK、JurkatG3_eGAK、JurkatmGAK1、JurkatmGAKleGAK2 及JurkatG3『AK。
_0] 實施例3:經EGFR家族特異性CAR遺傳修飾後T細胞株增殖情況測定[0191 ]將 JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eGAK、Jurkat~eGAK 以及未修飾的 JurkatE6.1 細胞(5 X IO5/孔，RPMI 1640培養基，含20U/ml IL-2)，分別加入預鋪經放射處理的A431、MCF7細胞(均購自ATCC)的6孔板(5X IO5/孔)中，分別在第3天、第7天，對懸浮的Jurkat細胞進行計數。結果表明，接觸EGFR陽性的A431細胞後，JurkatG2_e?、JurkatG3^eCAE均能大量增殖，而JurkatG1_e?基本不增殖；接觸EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7細胞後，JurkatG1^eCAE,JurkatG2_eCAE, JurkatG3_eCAE 均基本不增殖(見圖 3A-B)。
[0192]實施例4 ?經EGFR家族特異件CAR遺傳修飾後T細朐株IFN Y分泌量測定
[0193]將JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eGAK、Jurkat~eGAK 以及未修飾的 JurkatE6.1 細胞(5 X IO5/孔)在24孔板中與A431、MCF7細胞(均購自ATCC，IX IO5/孔)共培養，72小時後收集上清，通過IFNy的ELI SA檢測試劑盒(BD Biosciences)檢測IFNy的分泌量。結果表明，與EGFR陽性的A431細胞共培養後，JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eGAK能大量分泌IFN Y，分泌量高於 JurkatG1_eGAK ;與 EGF R 家族蛋白弱陽性的 MCF7 細胞共培養後，JurkatG1_eGAK、JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eCAE均基本不分泌 IFN Y。
[0194]實施例5:經EGFR家族特異性CAR遺傳修飾後T細胞株的體外殺傷作用測定
[0195]按不同的效靶比(50:1，25:1，5:1，1:1)，將^ JurkatG1_eCAE, JurkatG2_eCAE,JurkatG3^eCAE以及未修飾的Jurkat E6.1細胞與A431、MCF7共培養，應用LDH乳酸脫氫酶-細胞毒性檢測分析試劑盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit, Biovision)檢測不同方法遺傳修飾後的Jurkat E6.1細胞對不同類型腫瘤細胞的體外殺傷能力。方法如下:靶細胞鋪96孔板(5 X IO3/孔)，設培養基背景、體積校正、靶細胞自發LDH釋放、靶細胞最大LDH釋放、效應細胞自發LDH釋放對照孔，治療組孔，每組重複3孔，每個孔的終體積相同且不少於100 μ L0250g離心4min，在37°C，5%C02孵育至少4h。在離心前45min，向靶細胞最大釋放孔加入IOX裂解液，體積校正孔加入等量的裂解液。再次離心，從每孔轉移50 μ L上清至新的96孔板中，再加入50 μ L底物溶液，室溫避光孵育30min。每孔加入50 μ L終止液，Ih內測定D490。細胞毒性(％)=[ (D實驗孔-D培養基背景孔)-(D效應細胞自發LDH釋放孔-D培養基背景孔)-(D靶細胞自發LDH釋放孔-D培養基背景孔)]/[ (D靶細胞最大LDH釋放孔-D體積校正孔)-(D靶細胞自發LDH釋放孔-D培養基背景孔)]X 100%。
[0196]結果表明，JurkatG1_eGAK、JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eGAK均能有效殺傷 EGFR 陽性的A431腫瘤細胞，殺傷作用JurkatG1-eGAK〈JurkatG2-eGAK〈JurkatG3-eGAK對EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7 的殺傷作用，JurkatG1_eGAK、JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eGAK 與未經修飾的 Jurkat 細胞相似，基本不殺傷(見圖5A-B)。[0197]實施例6:經雙CAR修飾及MUCl特異件單CAR修飾的T細朐株增葙情況測定
[0198]將JurkatmCAK1、JurkatmCAEleCAE2, JurkatG3_mCAE 以及未修飾的 JurkatE6.1 細胞(5X IO5/孔，RPMI 1640培養基，含20U/ml IL-2)，分別加入預鋪經放射處理的A431 (人表皮癌細胞)、MCF7 (人乳腺癌細胞)、U-20S (人骨肉瘤細胞)(購自ATCC)的6孔板(5X IO5/孔)中，分別在第3天、第7天,對懸浮的Jurkat細胞進行計數。結果表明，接觸MUCl與EGFR雙陽性的A431細胞後，JurkatmGAKleGAK2能大量增殖，增殖倍數高於JurkatG3_mGAK ;接觸MUCl高陽性而EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7細胞後，Jurkatm_eGAK2的增殖倍數與JurkatmGAK1相似，略低於JurkatG3_mGAK ;接觸MUCl弱陽性、EGFR弱陽性的U-20S細胞後，JurkatmGAKleGAK2基本不增殖，而JurkatG3_mGAK仍能增殖(見圖6A-C)。
[0199]實施例7:經雙CAR修飾及MUCl特異件單CAR修飾的T細朐株IFN Y分泌量測定
[0200]將JurkatmGAK1、JurkatmCAEleCAE2> JurkatG3_mCAE 以及未修飾的 JurkatE6.1 細胞(5X IO5/孔)在24孔板中與A431、MCF7、U-20S (均購自ATCC, IXlO5/孔)共培養，72小時後收集上清，通過IFNy的ELISA檢測試劑盒(BD Biosciences)檢測IFNy的分泌量。結果表明，與MUCl與EGFR雙陽性的A431細胞共培養後，JurkatmCAEleCAE2能大量分泌I FN Y，分泌量高於JurkatG3_mGAK ;與MUCl高陽性而EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7細胞共培養後，JurkatmCAEleCAE2 的 IFNy 分泌量與 JurkatmCAE1 相似，低於 JurkatG3_mCAE ;與 MUCl 弱陽性、EGFR弱陽性的U-20S細胞共培養後，JurkatmCAEleCAE2基本不分泌IFN Y，而JUrkatG3_mGAK仍能分泌較多的IFNy (見圖7)。
[0201]實施例8:經雙CAR修飾及MUCl特異件單CAR修飾的T細朐株的體外殺傷作用測定
[0202]按不同的效靶比(50:1，25:1，5:1，1:1)，將 JurkatmCAE1、JurkatmCAEleCAE2、JurkatG3_mCAK以及未修飾的Jurkat E6.1細胞與A431、MCF7、U-20S共培養，應用LDH乳酸脫氫酶-細胞毒性檢測分析試劑盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit, Biovision)檢測不同方法遺傳修飾後的Jurkat E6.1細胞對不同類型腫瘤細胞的體外殺傷能力，方法同實施例5。
[0203]結果表明，JurkatmGAKleGAK2能有效殺傷MUCl與EGFR雙陽性的A431腫瘤細胞；對MUCl高陽性而EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7的殺傷作用與JurkatmGAK1相似，低於JurkatG3_mCAE ;對MUCl弱陽性、EGFR弱陽性的U-20S細胞基本不殺傷(見圖8A-C)。
[0204]實施例9:肝癌組織來源TIL的分離培養
[0205]收集新切除的肝癌標本，立即在無菌條件下進行處理。具體方法如下:去除肝癌標本周圍的正常組織和壞死區域，從標本的不同區域取下大小為l_2mm3的小組織塊，24孔板的每一孔放置一塊。每孔加2mL完全培養基(含10%FBS的GT-T551培養基)和3000 IU/mL的IL-2。將24孔板置於37°C，5% C02培養箱中培養。培養起始後的第5_6天為所有孔進行半量換液。之後，根據TIL生長情況，每隔1-2天進行一次半量換液。一旦孔內TIL長滿，且所有貼壁細胞已除去，就將各個長滿孔內的TIL收集起來。
[0206]隨後，I X IO6TIL重懸於含150mL完全培養基、30ng/mL抗CD3抗體、不少於200倍於TIL的照射過的飼養細胞(來自3個不同健康人的PBMC)和6000IU/mL IL-2的T175培養瓶中，將培養瓶豎直培養。培養至第5天，瓶內65%液體換為新的完全培養基和IL-2。培養至第7天，2個T175培養瓶內的細胞懸液轉移至細胞培養袋內，加入300mL完全培養基和IL-2。從第6天開始，每隔I天進行一次臺盼藍染色計數，通過加入新的完全培養基和IL-2控制細胞密度至0.5-2X106/mL。擴增的第14天，收集細胞。
[0207]實施例10:TIL的遺傳修飾
[0208]將CAR2aEeFK的編碼序列(SEQ ID NO:42)、CAR2b_ 的編碼序列(SEQ ID NO:44)插入逆轉錄病毒包裝載體pMXs-1RES-GFP (購自Cell BioLabs) EcoR1-XhoI位點中，轉化到E.coli (DH5 α )，經測序正確後，使用Qiagen公司的質粒純化試劑盒提取並純化質粒。於175_cm2fIasks 中培養包裝細胞 Amphotropic(購自 Cell BioLabs,細胞數約為 1-2X107),利用Lipofec tamine 2000 (Invitrogen)將純化後的高品質質粒轉染到中。3天後，收集含有病毒顆粒的細胞培養基，以4000g離心lOmin，收集上清液，並用0.45 μ m濾器過濾，濾過的液體置於40mL超速離心管中，4°C，25000r/min離心20分鐘，使用500ul冰PBS液重懸病毒沉澱，分別獲得攜帶CAR2aEeFK、CAR2bE(；FK表達框的重組逆轉錄病毒。隨後，分兩次(每次100 μ L)將病毒懸液與2 X IO6的TIL細胞共培養，分別收集感染後的TIL細胞TIL?2a與
TIL麵。
[0209]實施例11:遺傳修飾後TIL細胞的增殖情況測定
[0210]將TIL獅、TILCAE2b以及未修飾的TIL細胞(5X IO5/孔，GT-T551培養基基，含3000U/ml IL-2)，分別加入預鋪經放射處理的SMMC-7721 (購自上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所)的6孔板(5X IO5/孔)中，分別在第3天、第7天，對懸浮的TIL細胞進行計數。結果表明，修飾後的TILeAK2a接觸SMMC-7721細胞後能大量增殖，而未修飾的TIL細胞則基本不增殖(見圖9)。
[0211]實施例12:遺傳修飾後TIL細胞的體外殺傷作用測定
[0212]按不同的效靶比(50:1，25:1，5:1，1:1 )，將TILCAE2\TILCAE2b以及未修飾的TIL細胞與SMMC-7721共培養，應用 LDH乳酸脫氫酶-細胞毒性檢測分析試劑盒(LDH-CytotoxicityAssay Kit,Biovision)檢測遺傳修飾前後的TIL細胞對SMMC-7721細胞的體外殺傷能力，方法同實施例5。結果表明，經遺傳修飾的TILeAK2a能有效殺傷SMMC-7721腫瘤細胞，殺傷作用顯著高於未經修飾的TI L細胞(見圖10)。
[0213]儘管本發明的【具體實施方式】已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
【權利要求】
1.一種嵌合抗原受體，包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段和/或共刺激信號分子胞內結構域肽段，其中，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽包含ffiRIN。
2.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述跨膜區為CD28跨膜區、CD8跨膜區、⑶3 (跨膜區、⑶134跨膜區、⑶137跨膜區、ICOS跨膜區、和DAPlO跨膜區中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述免疫受體酪氨酸活化基序肽段為CD3 ^ 和 / 或 Fe e RI Y。
4.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述共刺激信號分子胞內結構域肽段選自CD28、CD134/0X40、CD137/4_1BB、LCK、IC0S、和DAPlO胞內結構域的肽段中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽為單拷貝或多拷貝；具體地，為雙拷貝。
6.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，所述高效結合EGFR家族蛋白的多肽還包含MUCl scFv-VH 和 MUCl ScFv-VL0
7.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其胺基酸序列為或者包含選自SEQID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45JPSEQ IDNO:49所示的胺基酸序列。
8.—種核酸，其編碼權利要求1至7中任一項所述的嵌合抗原受體；具體地，所述核酸為或者包含 SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50`所示的核苷酸序列。
9.一種重組載體，其包含權利要求8所述的核酸；具體地，所述重組載體為重組真核表達載體或重組病毒載體；更具體地，所述重組真核表達載體為重組PCDNA3.1 ( + )載體；所述重組病毒載體為重組逆轉錄病毒載體、重組慢病毒載體；進一步具體地，所述重組逆轉錄病毒載體為重組pMXs-1RES-GFP載體。
10.一種重組細胞，其包含權利要求9所述的重組載體；具體地，所述重組細胞為重組T細胞；更具體地，所述重組細胞為重組JurkatE6.1細胞。
11.一種T細胞，其表達權利要求1 一 7中任一項所述的嵌合抗原受體。
12.權利要求1至7中任一項所述的嵌合抗原受體或權利要求8所述的核酸或權利要求9所述的重組載體遺傳修飾的T細胞；具體地,所述T細胞為Jurkat E6.1細胞；具體地，所述遺傳修飾為基因槍法、轉染、電轉、或病毒轉導。
13.—種組合物，其包含一種或多種權利要求1至7中任一項所述的嵌合抗原受體或權利要求8所述的核酸或權利要求9所述的重組載體或權利要求10所述的重組細胞或權利要求11或12所述的T細胞；可選地，其還包含藥學上可接受的載體或輔料。
14.根據權利要求13所述的組合物，其包含兩種嵌合抗原受體，其中，一種嵌合抗原受體包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段，另一種嵌合抗原受體包含高效結合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區、以及共刺激信號分子胞內結構域肽段。
15.權利要求1至I中任一項所述的嵌合抗原受體或權利要求8所述的核酸或權利要求9所述的重組載體或權利要求10所述的重組細胞或權利要求11或12所述的T細胞在製備治療和/預防和/輔助治療惡性腫瘤或病毒感染性疾病的藥物中的用途；具體地，所述腫瘤為肺癌、肝細胞癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌、或前列腺癌；具體地，所述病毒為愛滋病病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、皰疫病毒(Herpesvirus)、或巨細胞病毒(cytomegalovir us )。
【文檔編號】C07K19/00GK103483453SQ201210191472
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月12日 優先權日:2012年6月12日
【發明者】錢其軍, 金華君, 丁娜, 俞德超, 李林芳, 吳孟超 申請人:上海吳孟超醫學科技基金會, 上海白澤生物科技有限公司