一種生產靈菌紅素的發酵液的方法
2023-05-11 05:02:11 2
一種生產靈菌紅素的發酵液的方法
【專利摘要】本發明提供一種生產靈菌紅素髮酵液的方法，該方法以源自木本植物種子的油脂作為發酵碳源，通過控制發酵條件，從而製備出靈菌紅素的含量為15-30g/L的發酵液。本發明具有的優勢包括：（1）原料具有種植廣泛、價格便宜、方便獲得及可持續性強等優點，不會產生「與人爭油，與人爭地」等現象；（2）本發明採用的木本植物可以種植於荒山坡地、荒灘沼澤、前庭後院以及鹽鹼地等不利於糧食作物種植生產的環境，對於保護生態環境，提高土地的經濟收益，保護耕地等方面也具有重要意義；（3）本發明將低價值的木本植物油脂通過發酵生成富含高附加值的醫藥產品靈菌紅素，市場前景廣闊，具有極大的開發價值。
【專利說明】一種生產靈菌紅素的發酵液的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於發酵【技術領域】，具體涉及一種生產靈菌紅素的發酵液的方法。
【背景技術】
[0002]靈菌紅素是一個具有三吡咯環結構的紅色素小分子，已被證明具有免疫抑制、抗癌、抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗黴和抗瘧疾等多種生物活性。美國國立癌症研究所的研究表明，靈菌紅素平均半數抑制濃度(IC5tl)為2.1 μ mol/L時，靈菌紅素對人體57種不同癌細胞均具有較強的抗性，對體外肝癌轉移和人原發癌細胞等多種人類癌細胞也有抗性，而對非惡性細胞系沒有明顯的毒性。靈菌紅素因其具有癌組織的高針對性和對正常細胞則表現的低毒害作用，而成為一種非常有潛力的抗癌物質。
[0003]在靈菌紅素生產方法上，早在20世紀60年代，靈菌紅素化學合成的全過程就已得到詳細闡述，但比較複雜和困難，難以實施。1996年，有學者提出了新的製備靈菌紅素類似物的方案，先將C環和B環相連然後再和A環結合，即得到靈菌紅素前體物質，但該方法不能用來合成天然的靈菌紅素，因此，不能用於工業化生產靈菌紅素。已經證明，採用微生物發酵方式是生成靈菌紅素的經濟有效的方法。
[0004]目前，已經報導的採用發酵法生產靈菌紅素的碳源為大豆油、花生油、芝麻油和橄欖油等人類可食用的油脂，屬於人們日常大量消費的食用油。然而，在我國，油脂加工企業每年從美國和巴西等國家進口大量大豆，並以此為原料生產大豆油，對國外依賴度大，而花生油、芝麻油和橄欖油的市場價格高。因此，採用價格相對較高的食用油脂大規模生產靈菌紅素，一方面可能導致「與人爭油，與人爭地」的不利局面；另一方面，可能影響我國食用油脂的安全。開發和利用新型發酵碳源，替代目前廣泛使用的食用油脂，大規模生產靈菌紅素，對於降低靈菌紅素的生產成本，提高靈菌紅素的市場競爭力，替代在癌症及免疫治療中對人體有毒害作用的化學藥物，具有重要的應用價值。
[0005]目前，國際上主要以大豆油、花生油及芝麻油等為底物進行發酵，或者將禾本科油料作物種子粉碎後進行發酵，油脂的利用效率低，成本較高。由於底物性質的差異，原有的技術不適宜木本油脂發酵產靈菌紅素；我國木本油料植物的開發利用還處於發展初期，目前存在的種植分散、管理落後及木本油料產量低的主要原因是木本植物油脂的開發沒有受到足夠的重視和支持，開發的技術水平落後，提高木本植物油脂的應用水平和附加值具有重要的經濟價值和重大的社會意義。迄今為止，還未有將本發明所述木本植物油脂應用產靈菌紅素的發酵液的報導。
【發明內容】
[0006]為了提高木本油料植物的開發利用，本發明提供一種生產靈菌紅素的發酵液的方法。該方法以源自木本植物種子的油脂作為發酵碳源，通過控制發酵條件，從而獲得高產率和高品質的靈菌紅素髮酵液。本發明具體的技術方案如下:
一種生產靈菌紅素的發酵液的方法包括如下步驟:(1)種子培養基配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂1-2%，酵母蛋白腖1-3%,硫酸銨1_3%，磷酸二氫鉀0.1-0.15%，硝酸鈉0.1-0.2%，七水硫酸鎂
0.01-0.05% ;pH值為7.5-9 ;配製獲得種子培養基；
(2)發酵培養基配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂3-15%，酵母蛋白腖1_3%，硫酸銨1_3%，磷酸二氫鉀0.1-0.2%，硝酸鈉0.1-0.2%，七水硫酸鎂
0.01-0.05% ;pH值為7.5-9 ;配製獲得發酵培養基；
(3)靈菌紅素製備:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌擴大培養至活細胞含量為IXlO6-2X106cfu/ml的菌液；再將菌液按質量比為2-8%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液；其中，發酵條件具體為:發酵溫度28-32°C，攪拌轉速200-300 rpm，通氣量0.5-L0 V/V.min，罐壓70-75 KPa，發酵時間30-40小時；所述靈菌紅素髮酵液中靈菌紅素的含量為15-30g/L。
[0007]作為優化方案，種子培養基配製步驟之前還包括:
木本植物油脂的製備:取木本植物的成熟種子，將成熟種子乾燥至水分含量為
5-10%，再機械粉碎至10-20目；然後對粉碎後的成熟種子進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為110-120°C，榨油機溫度為80-90°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油依次經水化脫膠、中和酸性、除臭以及除色後，獲得木本植物油脂。所述毛油是指壓榨後初步獲得的，沒經過精煉加工的植物油。所述木本植物油脂中所含的脂肪酸主要包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，其中以十六碳和十八碳的脂肪酸為主，不飽和脂肪酸含量高達90%以上，木本植物油脂含單不飽和脂肪 酸和亞麻酸，在高溫時化學結構仍能保持穩定。
[0008]所述木本植物為黃連木、光皮樹、油桐、烏桕、山茶、文冠果或麻瘋樹中的一種，但不限於此，可以是其他類似品種的木本植物。
[0009]本發明相對於現有技術的有益效果在於:
(1)本發明將絕大部分被自然界中的微生物分解腐爛掉的木本植物富含油脂的種子進行了高效利用。黃連木、光皮樹、油桐、烏桕、山茶、文冠果或麻瘋樹種植廣泛，價格便宜、方便獲得，不會產生「與人爭油，與人爭地」等現象；
(2)本發明採用的木本植物可以種植於荒山坡地、荒灘沼澤、前庭後院以及鹽鹼地等不利於糧食作物種植生產的環境，對於保護生態環境，提高土地的經濟收益，保護耕地等方面也具有重要意義；
(3)本發明將低價值的木本植物油脂通過發酵生成富含高附加值的醫藥產品靈菌紅素，市場前景廣闊，具有極大的開發價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為從本發明的發酵液中分離出的靈菌紅素的TOF-MS質譜圖。(圖1中縱坐標代表離子信號強度，橫坐標代表離子核質比，324為分子量，325為[M+H]，通過與已有的報導以及標準品對照進行比較，證明本發明的發酵液中的紅色素產物為靈菌紅素)。
【具體實施方式】
[0011]下面通過實施例，對本發明作進一步地描述。
[0012]以下實施例所用原料的說明:酵母蛋白腖是市售的以高蛋白的麵包酵母為原料，經自溶、酶解、分離、濃縮和乾燥等工藝，製得的安全、穩定、營養全面的蛋白腖產品。所述磷酸二氫鉀、硫酸銨、硝酸鈉以及七水硫酸鎂均為化學純試劑，可採用國藥集團化學試劑有限公司生產的上述試劑，但不限於此。所用粘質沙雷氏菌(ferraiia ?arcescefls)為中國科學院普通微生物菌種保藏中心保藏菌種。
[0013]實施例1:
木本植物油脂的製備:取黃連木的成熟種子，乾燥至水分含量為5%，機械粉碎至15目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為110°C，榨油機溫度為90°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得成品的黃連木油脂。黃連木油脂所含的脂肪酸主要包括棕櫚酸、油酸、亞油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、花生四烯酸、亞麻酸，其中油酸、亞油酸、棕櫚酸含量之和佔脂肪酸總量的95%左右。黃連木種仁含油率56.5%，種子出油率20%-30%，果殼含油量3.28%，是一種不幹性油，油色淡黃綠色，帶苦澀味。
[0014](I)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑，配料及其質量比為:木本植物油脂1%，酵母蛋白腖1.5%，硫酸銨1.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉0.1%，七水硫酸鎂0.05% ;pH值為8 ;配製獲得種子培養基。
[0015](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑，配料及其質量比為:木本植物油脂10%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨1.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.01%, pH值為8 ；配製獲得發酵培養基。
[0016](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(Sferraiia marcescens)擴大培養至活細胞含 量為IX 106cfu/ml的菌液，將菌液按4%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度28°C，攪拌轉速200rpm，通氣量0.8 V/V*min，罐壓75 KPa，發酵時間30小時。
[0017]採用本實施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為45%，靈菌紅素的產量為30g/L。
[0018]實施例2:
木本植物油脂的製備:取光皮樹的成熟種子，乾燥至水分含量為8%，機械粉碎至10目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為120°C，榨油機溫度為90°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得光皮樹籽油脂，光皮樹籽油脂的脂肪酸組成主要為亞油酸及油酸，所述的光皮樹是一種木本油料植物，果肉和種仁均含有較多的油脂。
[0019](I)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂2%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.05% ；pH值為7.5 ；配製獲得種子培養基。
[0020](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂12%，酵母蛋白腖2%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀0.15%，硝酸鈉0.1%，七水硫酸鎂0.01% ；pH值為9 ；配製獲得發酵培養基。
[0021](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(Serraiia marcescens)擴大培養至活細胞含量為1.5X106cfu/ml的菌液，將菌液按2%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度28°C，攪拌轉速250rpm，通氣量0.5V/V.min，罐壓70KPa，發酵時間35小時。
[0022]採用本實施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為50%，靈菌紅素的產量為25g/L。
[0023]實施例3:
木本植物油脂的製備:取油桐的成熟種子，乾燥至水分含量為5%，機械粉碎至10目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為115°C，榨油機溫度為85°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得油桐油脂。油桐油脂的折光指數為1.5206，酸化值為5.1 mg/g,碘化值為165 mg/g,阜化值為190 mg/g,透明度為透明,色澤值顯示為
0.1,氣味無異味,密度0.9376 g/mL,熱聚合時間446秒,含β -桐酸,所述的油桐的果實約含有10粒種仁，種仁含油率約為62.89%。
[0024](I)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂1%，酵母蛋白腖1%，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.15%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.05% ;ρΗ值為7.5 ；
配製獲得種子培養基。
[0025](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂3%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀0.2%，硝酸鈉0.1%，七水硫酸鎂0.01% ；ρΗ值為8 ;配製獲得發酵培養基。
[0026](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(Serraiia marcescens)擴大培養至活細胞含量為2X 106cfu/ml的菌液；將菌液按5%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度30°C，攪拌轉速300rpm，通氣量1.0 V/V.min，罐壓75 KPa，發酵時間40小時。
[0027]採用本實施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為35%，靈菌紅素的產量為22 g/L。
[0028]實施例4:
木本植物油脂的製備:取烏桕的成熟種子，乾燥至水分含量為10%，機械粉碎至10目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為110°C，榨油機溫度為90°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得烏桕油脂。烏桕油脂的主要成分為含油酸、亞油酸、亞麻酸的甘油酯，含有少量2，4-癸二烯酸和棕櫚酸，外觀白色、微黃、不透明，雜質為0.03%，游離脂肪酸3%，相對密度(25/25°C)為0.937，折射率(25°C )為1.482，酸價3mgKOH/g，碘值 175，皂化值 210 mgKOH/g。
[0029](I)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂1%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉0.1%，七水硫酸鎂0.01%，pH值為7.5 ；配製獲得種子培養基。
[0030](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑，配料及其質量比為:木本植物油脂9%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉0.1%，七水硫酸鎂0.01% ;pH值為7.5 ；配製獲得發酵培養基。
[0031](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(5fer_raiia marcescens、貧大培養至活細胞含量為2X 106cfu/ml的菌液；將菌液按8%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度32°C，攪拌轉速200rpm，通氣量0.5V/V.min,罐壓70KPa,發酵時間30小時。
[0032] 採用本實施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為30%，靈菌紅素的產量為15g/L。[0033]實施例5:
木本植物油脂的製備:取山茶的成熟種子，乾燥至水分含量為10%，機械粉碎至18目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為115°C，榨油機溫度為80°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得山茶籽油脂。山茶籽油脂中油酸和亞油酸的總含量為85%，主要由棕櫚酸和硬脂酸組成的飽和脂肪酸含量為10%，顏色淺黃，澄清透明，
氣味清香。
[0034](1)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂2%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀0.15%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.01% ；pH值為9 ；配製獲得種子培養基。
[0035](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂15%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀0.2%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.01%, pH值為7.5 ；配製獲得發酵培養基。
[0036](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(Sferraiia marcescens)擴大培養至活細胞含量為lX106cfu/ml的菌液；將菌液按2%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度30°C，攪拌轉速300rpm，通氣量0.7V/V*min，罐壓75 KPa，發酵時間32小時。
[0037]採用本實施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為45%，靈菌紅素的產量為28g/L。
[0038]實施例6:
木本植物油脂的製備步驟:取文冠果的成熟種子，乾燥至水分含量為10%，機械粉碎至20目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為110°C，榨油機溫度為80°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得文冠果油脂。文冠果油脂的硬脂酸和油酸總含量為38.9%，亞油酸含量為40.2%，黃色而透明，本發明採用的文冠果是我國特有的經濟木本油料樹種，種子含油率為30.4-47%，種仁含油量66.39%。
[0039](I)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂1%，酵母蛋白腖1%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀0.15%，硝酸鈉0.15%，七水硫酸鎂0.03%, pH值為7.5 ;配製獲得種子培養基。
[0040](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂11%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.2%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.04%, pH值為9 ;配製獲得發酵培養基。
[0041](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(5fer_raiia marcescens、貧大培養至活細胞含量為1.5X106cfu/ml的菌液；將菌液按2%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度32°C，攪拌轉速280rpm，通氣量0.5 V/V.min，罐壓70 KPa，發酵時間30小時。
[0042]採用本實施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為39%，靈菌紅素的產量為15g/L。
[0043]實施例7:
木本植物油脂的製備:取麻瘋樹的成熟種子，乾燥至水分含量為10%，機械粉碎至10目；然後進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為120°c，榨油機溫度為90°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油經水化脫膠、中和酸性，除臭，除色工藝，獲得麻瘋樹籽油脂。麻瘋樹籽油脂富含75%的油酸和亞油酸；油脂碘值低，半乾性油，麻瘋樹籽的含油率為40%-60%。
[0044](I)種子培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂1%，酵母蛋白腖3%，硫酸銨2%，磷酸二氫鉀0.15%，硝酸鈉0.2%，七水硫酸鎂0.02%, pH值為8 ；配製獲得種子培養基。
[0045](2)發酵培養基的配製:以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂15%，酵母蛋白腖2%，硫酸銨2%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉0.1%，七水硫酸鎂0.01%, pH值為9 ;配製獲得發酵培養基。
[0046](3)製備靈菌紅素:在種子培養基中，將粘質沙雷氏菌(Sferraiia marcescens)擴大培養至活細胞含量為1.5X106cfu/ml的菌液；將菌液按8%的量接種於裝有發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液。發酵條件為:發酵溫度28°C，攪拌轉速200rpm，通氣量0.5V/V.min，罐壓72KPa，發酵時間40小時。
[0047]採用本實 施例提供的製備方法，木本植物油脂的利用率為50%，靈菌紅素的產量為29g/L。
【權利要求】
1.一種生產靈菌紅素的發酵液的方法，其特徵在於包括如下步驟: (1)種子培養基配製 以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂1-2%、酵母蛋白腖1_3%、硫酸銨。1-3%、磷酸二氫鉀0.1-0.15%、硝酸鈉0.1-0.2%、七水硫酸鎂0.01-0.05% ;pH值為7.5-9 ;配製獲得種子培養基； (2)發酵培養基配製 以蒸餾水為溶劑；配料及其質量比為:木本植物油脂3-15%、酵母蛋白腖1-3%、硫酸銨。1-3%、磷酸二氫鉀0.1-0.2%、硝酸鈉0.1-0.2%、七水硫酸鎂0.01-0.05% ;pH值為7.5-9 ;配製獲得發酵培養基； (3)製備靈菌紅素 在所述種子培養基中，將粘質沙雷氏菌擴大培養至活細胞含量為IXlO6 -2X IO6Cfu/ml的菌液；再將菌液按質量比為2-8%的量接種於裝有所述發酵培養基的發酵罐中，進行發酵，獲得靈菌紅素髮酵液；其中，發酵條件具體為:發酵溫度28-32°C，攪拌轉速200-300rpm,通氣量0.5-1.0 V/V.min,罐壓70-75 KPa,發酵時間30-40小時；所述靈菌紅素髮酵液中靈菌紅素的含量為15-30g/L。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述種子培養基配製步驟之前還包括: 木本植物油脂的製備:取木本植物的成熟種子，將所述成熟種子乾燥至水分含量為。5-10%，再機械粉碎至10-20目；然後對粉碎後的成熟種子進行軋胚蒸炒，當蒸炒溫度為。110-120°C，榨油機溫度為80-90°C時，進行壓榨，獲得毛油；將毛油依次經水化脫膠、中和酸性、除臭以及除色後，獲得木本植物油脂，所述木本植物油脂中所含的脂肪酸主要包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，其中以十六碳和十八碳的脂肪酸為主，不飽和脂肪酸含量高達90%以上，木本植物油脂富含單不飽和脂肪酸和亞麻酸，在高溫時化學結構仍能保持穩定。
3.根據權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於，所述木本植物為黃連木、光皮樹、油桐、烏桕、山茶、文冠果或麻瘋樹中的一種。
【文檔編號】C12R1/43GK103923958SQ201410187497
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】楊培周, 姜紹通, 程曉蕾, 張丹峰, 鄭志, 羅水忠, 潘麗軍, 蘇文娟 申請人:合肥工業大學