一種製備褐藻寡糖的方法與流程
2023-05-03 01:05:07 1
本發明屬於功能性小分子製備技術領域，具體涉及一種製備褐藻寡糖的方法。
背景技術：
褐藻膠是源自於褐藻植物的細胞壁的水溶性酸性多糖，其主要由α-l-古羅糖醛酸和β-d-甘露糖醛酸組成。在目前的研究中，褐藻膠主要用來降解製備褐藻寡糖。
海藻寡糖分子量低，水溶性強，穩定性高，實驗和臨床已經發現海藻寡糖具有免疫調節、降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗凝血及抗病毒等多種生理活性，還可以作為糖尿病、肥胖症、直腸結腸癌、習慣性便秘患者的療效食品。在藥物研製、功能食品開發、綠色農業等領域具有廣闊的開發應用前景。並且，褐藻寡糖具有抗氧化、免疫調節等多種不同的生物學活性，且寡糖存在分子量小，容易被吸收利用的優勢，因此在藥物製劑、功能食品、化工等多個領域具有廣闊的應用前景，是一種最新一代的功能性低聚糖。
目前通過褐藻膠來製備褐藻寡糖有多種方法，例如酸法降解、超聲降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相較於化學法製備反應溫和、易於控制，耗能低，產物回收率較高以及不會產生嚴重的汙染等優點。但是，現在使用褐藻膠酶降解褐藻膠製備的寡糖為二糖至五糖的混合物(p2-p5)，還需要通過凝膠柱層析分離才能獲得單一的寡糖組分(歐昌榮等，微生物發酵-膜分離法製備褐藻膠寡糖及其產物分析，微生物學報，45卷第2期，2005年4月)。但上述的分離方法避免不了會增加成本。因此，如何在酶解過程中控制酶解產物的均一性一直是褐藻膠寡糖製備領域的研究熱點。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種製備褐藻寡糖的方法，製備的褐藻寡糖主要為褐藻寡糖二糖和三糖，從而彌補現有技術的不足。
本發明的方法，是使用具有褐藻膠降解活性的酶來降解褐藻膠，從而製備褐藻寡糖；其中使用的酶包含有：
1)胺基酸序列為seqidno:1的酶；
2)將seqidno:1所示胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有1)的酶活性的，由1)衍生的酶；
編碼上述酶的基因，其一種編碼核苷酸序列為seqidno:2；
本發明的方法，其一種具體的操作如下：將褐藻膠配成重量百分比濃度為1-2％的水溶液，將酶加入到褐藻膠水溶液中，在35-37℃下進行培育反應；反應結束後進行離心獲得上清液；將上清液進行冷凍乾燥後的褐藻寡糖。
上述的方法中，所述的離心條件是在4℃，12000rpm離心30min。
上述方法製備的褐藻寡糖通過凝膠柱層析分離獲得單一的組分。
本發明方法使用篩選獲得的蛋白酶來酶解褐藻膠，從而使反應的副產物更少，有利於後續更方便的通過膠柱層析來分離單一寡糖，從而有效的提高了製備褐藻寡糖的效率，節省了成本。
附圖說明
圖1：本發明酶與ncbi編號為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶的blstp結果圖；其中query為本發明的酶，subject為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶；
圖2：本發明酶的基因擴增圖；
圖3：本發明篩選的酶對褐藻膠的降解產物的層析電泳圖，其中1為ncbi編號為wp_017069952.1的酶的產物；2為本發明篩選酶的降解產物。
具體實施方式
目前褐藻膠寡糖的製備包括化學方法和酶解方法，其中一種操作方法是通過篩選能產生褐藻膠酶的微生物，然後以褐藻膠為唯一碳源誘導產生具有褐藻膠裂解活性的酶，從而降解褐藻膠來製備寡糖。申請人的單位一直從事製備醫藥領域使用的褐藻膠寡糖。通過從海帶中篩選具有褐藻膠降解活性的菌；再以海藻酸鈉為唯一碳源，通過馴化培養、初篩、復篩獲得了一株能特異性的降解褐藻膠製備寡糖的菌(實驗室命名為pxy-1)。對產物進行薄層層析後發現相比於已有的能夠產生褐藻膠酶的菌株，該篩選菌株中二糖和三糖的產量有顯著的增加。在對該菌進行了全基因組測序後，對序列進行了生物信息學分析，獲得了一種酶蛋白，對該酶蛋白進行重組表達，降解褐藻膠後，確定其為能特異性的降解褐藻膠，產物主要為褐藻膠二糖和三糖的酶。
下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
實施例1：蛋白酶的篩選及酶學性質分析
一、通過商業測序基因公司對pxy-1菌株的通過鳥槍法進行全基因測序，測序進行拼接後獲得了全基因組序列。再對全基因組進行注釋後，將序列與已公布的褐藻膠酶進行比較，發現了疑似具有褐藻膠降解功能的序列，其核苷酸序列如下(序列表中編號為seqidn0：2)：
atgagcggatccgacttccctaacaacaaagaaacgggtgaagcacttcttactccggttgatgctaccgctagcagccacgatggaaatggcacaacacgctggtcgtcagcgggtgacggtgagtgggcaatgctagattatggttcagtacaagagtttgacgctgttcaagcatccttcagtaaaggtaatgagtctcaatcgaaatttgacattcaagtgagtgtcgatggtgaaacctggacgacggtacttaacggtgtgctcagttctggtaaagctatcggcctagagcgtttccaatttgagcctgcggtgaaagcacgttacgtaagatatgttggtcacggcaacaccaaaaacggttggaacagtgtgactgggttagcagcggttaactgtccagatgatgtatccgagtggaaccttagcatcaacgcttgtccagcgagtcaaatcatcacttcagacgtggtggctgcagaagcggtgcttattgctgaaatgaaaacggtgtgcaaagcgcgtacagcagcacgcaaagatctacgctcaggtaacttcggcgtagcagcagtttacccttgtgagacttcagttaaatgtgacactcgcagcgcgctcccagttccgacaggcctaccagcgacacccgttgccggtaatgcaccgagcgaaaacttcgacatgactcactggtacctgtctcaaccattcgaccatgacaaaaacggtaaggcaaacgggtatcaacacccagaaatcttctataccgcagacgaaggtggtctagtgttcaagtcttacgtgaaaggtgtacgtacatctaaaaacactaagtacgcgcgtaccgagcttcgtgagatgatgcgtcgtggtgaccagtctatcagtacgaaaggtgttaataagaacaactgggtattctcaagagcccctgaagctgatttagaagctgcggctggtatcgatggcgttctagaagcaacattgaaaatcgatcatgcgacaacaacgggtaatgcgaatgaagtaggtcgctttatcattggtcagattcacgatcaaaacgatgagccgattcgtttgaaatttcctgatcaagaggcagtttactttgcacacgaaagccaagacgcgaccaaagaggacttctatcctctagtgggagacatgacggctgaagtaggtgaagatggtatcgcacttggtgaagtgttcagctaccgtattgacgttaaaggcaacacgatgacggtaacgctaatgcgtgaaggcaaagacgatgttgtacaagtggttgatatgagcaacagcggctacatgtatttcaaagcgggtgtttacaaccaaaatatcagcggcgacctagacgattactcacaagctactttctaccagctagacgtatcgcacgatcaatacaaaaagtag；
其翻譯過的胺基酸序列如下(序列表中編號為seqidn0：1)：
msgsdfpnnketgealltpvdatasshdgngttrwssagdgewamldygsvqefdavqasfskgnesqskfdiqvsvdgetwttvlngvlssgkaiglerfqfepavkaryvryvghgntkngwnsvtglaavncpddvsewnlsinacpasqiitsdvvaaeavliaemktvckartaarkdlrsgnfgvaavypcetsvkcdtrsalpvptglpatpvagnapsenfdmthwylsqpfdhdkngkangyqhpeifytadegglvfksyvkgvrtskntkyartelremmrrgdqsistkgvnknnwvfsrapeadleaaagidgvleatlkidhatttgnanevgrfiigqihdqndepirlkfpdqeavyfahesqdatkedfyplvgdmtaevgedgialgevfsyridvkgntmtvtlmregkddvvqvvdmsnsgymyfkagvynqnisgdlddysqatfyqldvshdqykk。
將上述的序列與ncbi中進行blastp比對，結果發現與ncbi編號為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶序列上最接近。但是，通過alignment比較發現，本發明所篩選的酶與ncbi編號為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶相比，很多位點上存在胺基酸的差異。更重要的是，本發明的酶與海藻酸裂解酶存在大段的胺基酸序列的插入缺失差異(圖1)。
為了驗證本發明篩選的胺基酸序列為seqidno:1的酶的功能，對該酶進行了重組表達，並驗證了酶學性質及降解褐藻膠的能力。
實施例2、酶的重組表達
1)根據酶基因的序列設計上遊引物和下遊引物，用pcr擴增得到基因全序列。pcr條件為：94℃預變性3min，隨後以94℃30s、55℃30s、72℃2min進行30個循環，最後在72℃延伸5min。以上遊引物和下遊引物擴增酶編碼基因的全序列(圖1)，用t4連接酶連接擴增的片段和表達載體pproexhta用ecorⅰ和hindⅲ酶切，用t4連接酶連接表達質粒pgex6p-1，熱激轉入大腸桿菌bl21中。
隨機挑取單克隆菌落，測序分析獲得陽性克隆重組菌株。
2)重組酶的製備
將篩選後的的陽性重組菌株單克隆接種在含有氨苄青黴素的lb液體培養基中進行擴大培養，在37℃搖床培養12h後製成種子液。再取種子液接入含有氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床培養至od600值為0.5-0.6時，加入iptg進行誘導表達。繼續培養後，4℃6000rpm離心10分鐘得到發酵粗酶液。
粗酶液硫酸銨沉澱
離心得到的發酵粗酶液進行70％硫酸銨沉澱。冰水浴保溫，磁力攪拌的條件下均勻緩慢地向發酵粗酶液加入粉碎並乾燥的硫酸銨。4℃靜置過夜後離心收集沉澱，用20mmph8.0tris-hcl緩衝液復溶沉澱，並在此緩衝液中透析。用ph8.0的20mmtris-hcl緩衝液充分平衡deaesepharoseff離子交換柱(10cmx1.2cm)，上樣吸附。然後用ph8.0的20mmtris-hcl含有nacl(0.1-0.6mofnacl)進行梯度洗脫,收集od280出峰的平衡液及洗脫液。對收集管中的溶液進行冷凍乾燥後獲得重組酶。
實施例3、酶學性質分析
1、酶活測定
採用紫外吸收法測定本發明篩選的酶的比活力，測定本發明的酶對褐藻酸鈉(檢測的時候用於替代褐藻膠)降解的比活力值為20-22unit/ml，能滿足生產的需要。
2、ph對酶活的影響
每一試管中加入3ml粗酶液和15ml濃度分別為1.5％的褐藻膠水溶液，置放於不同的ph條件下，反應30分鐘後，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。結果表明酶的最適反應ph為7.5。ph過高或過低都會對酶活性產生影響,使酶活降低。
3、溫度對酶活的影響
每一個試管中加入3ml粗酶液和15ml濃度分別為1.5％的褐藻膠水溶液，調節ph為7.5，置於不同溫度條件下，反應30分鐘後，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。結果酶的最適應溫度為34-37℃。初始階段著溫度的升高酶活性逐漸增高，至37℃時隨著溫度的升高酶活性開始降低。
實施例4：用重組表達的酶降解褐藻膠製備褐藻寡糖
將本發明重組表達的胺基酸序列為seqidno:1的酶來降解褐藻膠來製備褐藻寡糖，將褐藻膠(平均分子量20000)配成重量百分比濃度為1％的水溶液，按照重量比1:80的比例將酶加入到褐藻膠水溶液中作為實驗組。同時，將編號為wp_017069952.1的酶(胺基酸序列為seqidno:3)按照實施例1中的步驟進行重組表達，作為實驗組；對照組和實驗組各做三個平行試驗。
將對照組和實驗組在35℃下進行培育，培育時間為12h。反應結束後12000rpm離心5min，取上清通過薄層層析方法(tlc法)對上清液中的降解產物進行分析。具體就是分別取實驗組和對照組的上清液3μl，點樣於矽膠板上(silicagel60f254，merck)。吹乾後將矽膠板置於展開劑中開始層析，展開劑按以下比例配置：正丁醇/甲酸/水(v/v)＝4:6:1。層析結束後，取出矽膠板並吹乾，在矽膠板上噴灑顯色劑(苯胺-二苯胺顯色劑)，吹乾，再將矽膠板置於高溫條件下顯色，直至出現明顯的斑點。檢測結果如圖3所示，結果表明，相比於編號為wp_017069952.1的酶，本發明篩選的酶對褐藻膠的降解產物主要是褐藻膠寡糖的二糖和三糖；經過質譜鑑定，降解產物為dp1和dp2(褐藻寡糖的二到五寡糖的分子量分別為175da、351da、527da、703da)；而wp_017069952.1酶降解的產物從褐藻寡糖二糖到五糖都有相應的產物。
上述結果表明本發明篩選的酶能特異性的降解褐藻膠為二糖和三糖，有利於後續更方便的通過膠柱層析來分離單一寡糖。
實施例5：製備褐藻寡糖
將褐藻膠配成重量百分比濃度為1-2％的水溶液，將實施例2製備的重組酶加入到褐藻膠水溶液中，在35-37℃下進行培育反應；採用dns法測定反應液中寡糖含量的變化，在酶解5h後，反應液中寡糖含量已達到最高峰。然後通過100℃水浴使酶失活，再在4℃，12000g離心30min離心獲得上清液,tlc法測定結果表明上清液中成分為褐藻寡糖二糖和三糖的混合物。將上清液進行冷凍乾燥後獲得褐藻寡糖；計算結果表明寡糖的回收率在80％以上。
製備獲得的寡糖可進一步採用凝膠柱層析方法分離獲得單一的二糖和三糖。
sequencelisting
陳藝燕
一種製備褐藻寡糖的方法
3
patentinversion3.5
1
478
prt
1
1
metserglyserasppheproasnasnlysgluthrglyglualaleu
151015
leuthrprovalaspalathralaserserhisaspglyasnglythr
202530
thrargtrpserseralaglyaspglyglutrpalametleuasptyr
354045
glyservalglnglupheaspalavalglnalaserpheserlysgly
505560
asngluserglnserlyspheaspileglnvalservalaspglyglu
65707580
thrtrpthrthrvalleuasnglyvalleuserserglylysalaile
859095
glyleugluargpheglnphegluproalavallysalaargtyrval
100105110
argtyrvalglyhisglyasnthrlysasnglytrpasnservalthr
115120125
glyleualaalavalasncysproaspaspvalserglutrpasnleu
130135140
serileasnalacysproalaserglnileilethrseraspvalval
145150155160
alaalaglualavalleuilealaglumetlysthrvalcyslysala
165170175
argthralaalaarglysaspleuargserglyasnpheglyvalala
180185190
alavaltyrprocysgluthrservallyscysaspthrargserala
195200205
leuprovalprothrglyleuproalathrprovalalaglyasnala
210215220
prosergluasnpheaspmetthrhistrptyrleuserglnprophe
225230235240
asphisasplysasnglylysalaasnglytyrglnhisprogluile
245250255
phetyrthralaaspgluglyglyleuvalphelyssertyrvallys
260265270
glyvalargthrserlysasnthrlystyralaargthrgluleuarg
275280285
glumetmetargargglyaspglnserileserthrlysglyvalasn
290295300
lysasnasntrpvalpheserargalaproglualaaspleugluala
305310315320
alaalaglyileaspglyvalleuglualathrleulysileasphis
325330335
alathrthrthrglyasnalaasngluvalglyargpheileilegly
340345350
glnilehisaspglnasnaspgluproileargleulyspheproasp
355360365
glnglualavaltyrphealahisgluserglnaspalathrlysglu
370375380
aspphetyrproleuvalglyaspmetthralagluvalglygluasp
385390395400
glyilealaleuglygluvalphesertyrargileaspvallysgly
405410415
asnthrmetthrvalthrleumetarggluglylysaspaspvalval
420425430
glnvalvalaspmetserasnserglytyrmettyrphelysalagly
435440445
valtyrasnglnasnileserglyaspleuaspasptyrserglnala
450455460
thrphetyrglnleuaspvalserhisaspglntyrlyslys
465470475
2
1437
dna
2
2
atgagcggatccgacttccctaacaacaaagaaacgggtgaagcacttcttactccggtt60
gatgctaccgctagcagccacgatggaaatggcacaacacgctggtcgtcagcgggtgac120
ggtgagtgggcaatgctagattatggttcagtacaagagtttgacgctgttcaagcatcc180
ttcagtaaaggtaatgagtctcaatcgaaatttgacattcaagtgagtgtcgatggtgaa240
acctggacgacggtacttaacggtgtgctcagttctggtaaagctatcggcctagagcgt300
ttccaatttgagcctgcggtgaaagcacgttacgtaagatatgttggtcacggcaacacc360
aaaaacggttggaacagtgtgactgggttagcagcggttaactgtccagatgatgtatcc420
gagtggaaccttagcatcaacgcttgtccagcgagtcaaatcatcacttcagacgtggtg480
gctgcagaagcggtgcttattgctgaaatgaaaacggtgtgcaaagcgcgtacagcagca540
cgcaaagatctacgctcaggtaacttcggcgtagcagcagtttacccttgtgagacttca600
gttaaatgtgacactcgcagcgcgctcccagttccgacaggcctaccagcgacacccgtt660
gccggtaatgcaccgagcgaaaacttcgacatgactcactggtacctgtctcaaccattc720
gaccatgacaaaaacggtaaggcaaacgggtatcaacacccagaaatcttctataccgca780
gacgaaggtggtctagtgttcaagtcttacgtgaaaggtgtacgtacatctaaaaacact840
aagtacgcgcgtaccgagcttcgtgagatgatgcgtcgtggtgaccagtctatcagtacg900
aaaggtgttaataagaacaactgggtattctcaagagcccctgaagctgatttagaagct960
gcggctggtatcgatggcgttctagaagcaacattgaaaatcgatcatgcgacaacaacg1020
ggtaatgcgaatgaagtaggtcgctttatcattggtcagattcacgatcaaaacgatgag1080
ccgattcgtttgaaatttcctgatcaagaggcagtttactttgcacacgaaagccaagac1140
gcgaccaaagaggacttctatcctctagtgggagacatgacggctgaagtaggtgaagat1200
ggtatcgcacttggtgaagtgttcagctaccgtattgacgttaaaggcaacacgatgacg1260
gtaacgctaatgcgtgaaggcaaagacgatgttgtacaagtggttgatatgagcaacagc1320
ggctacatgtatttcaaagcgggtgtttacaaccaaaatatcagcggcgacctagacgat1380
tactcacaagctactttctaccagctagacgtatcgcacgatcaatacaaaaagtag1437
3
522
prt
3
3
metlysglnilethrleulysthrleuleualaserserileleuleu
151015
alavalglycysalaserthrserthrprothrvalasppheproasn
202530
asnlysgluthrglyglualaleuleuthrprovalalavalalaala
354045
serserhisaspglyasnglyproaspargleuileaspglnaspleu
505560
thrthrargtrpserseralaglyaspglyglutrpalametleuasp
65707580
tyrglyservalglnglupheaspalavalglnalaserpheserlys
859095
glyasngluargglnserlyspheaspileglnvalservalaspgly
100105110
gluthrtrpthrthrvalleugluasnglnleuserserglylysala
115120125
ileglyleugluargpheglnphegluproalavalglnalaargtyr
130135140
valargtyrvalglyhisglyasnthrlysasnglytrpasnserval
145150155160
thrglyleualaalavalasncysasnileasnalacysproalaser
165170175
hisileilethrseraspvalvalalaalaglualavalileileala
180185190
glumetlysalavalglulysalaarglysaspalaarglysaspleu
195200205
argserglyasnpheglyvalalaalavaltyrprocysgluthrser
210215220
valglucysaspthrargseralaleuprovalprothrglyleupro
225230235240
alathrprovalalaglyasnalaprosergluasnpheaspmetthr
245250255
histrptyrleuserglnpropheasphisasplysasnglylyspro
260265270
aspaspvalserglutrpasnleualaasnglytyrglnhisproglu
275280285
ilephetyrthralaaspaspglyglyleuvalphelyssertyrval
290295300
lysglyvalargthrserlysasnthrlystyralaargthrgluleu
305310315320
argglumetmetargargglyaspglnserileserthrlysglyval
325330335
asnlysasnasntrpvalpheserseralaprogluseraspleuglu
340345350
alaalaalaglyileaspglyvalleuglualathrleulysileasp
355360365
hisalathrthrthrglyasnalaasngluvalglyargpheileile
370375380
glyglnilehisaspglnasnaspgluproileargleutyrtyrarg
385390395400
lysleuproasnglnalathrglyalavaltyrphealahisgluser
405410415
glnaspalathrlysgluaspphetyrproleuvalglyaspmetthr
420425430
alagluvalglyaspaspglyilealaleuglygluvalphesertyr
435440445
argileaspvallysglyasnthrmetthrvalthrleumetargglu
450455460
glylysaspaspvalvalglnvalvalaspmetserasnserglytyr
465470475480
aspvalglyglylystyrmettyrphelysalaglyvaltyrasngln
485490495
asnileserglyaspleuaspasptyrserglnalathrphetyrgln
500505510
leuaspvalserhisaspglntyrlyslys
515520