大型真菌菌種的長期保藏方法
2023-05-03 05:45:16 2
專利名稱：大型真菌菌種的長期保藏方法
技術領域：
本發明涉及菌種保藏方法技術領域，特別是涉及大型真菌菌種的長期保藏方法。
背景技術：
目前大型真菌菌種的長期保藏方法主要有(A)液體石蠟保藏法，即在培養好的斜面上加上一層無菌無水液體石蠟，石蠟高出斜面1cm處，置於4-15℃保存，保存時間為3-5年。本方法的缺點是(1)耗時耗空間；(2)保存的菌種轉接時生活力很低。(B)液氮超低溫保藏法，即輕輕刮取平板上的菌絲體使成菌懸液，或用保護劑製成孢子懸液，加入10％的甘油或10％二甲基亞碸，吸取0.5-0.8mL懸液注入安瓿管中，熔封管口，置液氮冷凍器裡保存。此法雖然能長期保存菌種，但是操作繁瑣，設備昂貴，液氮來源困難且價格高，大部分研究機構沒有條件使用。(楊新美著，《食用菌研究方法》，中國農業出版社，1999；黃年來主編，《中國食用菌百科》，中國農業出報社，1993年5月)。
目前，我國國家級的大型真菌菌種保藏機構主要有「中國微生物菌種保藏管理委員會微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)」、「中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)以及「農業微生物菌種保藏管理中心食用菌菌種分中心」3個，省級有十多個，還有一些地方菌種保存機構，這些中心或機構每年用於保藏大型真菌的菌種耗資巨大，如能提供一種簡單經濟的大型真菌菌種保藏方法，那意義非常重大。
發明內容
本發明的目的在於克服現有大型真菌菌種的長期保藏方法上存在的不足，提供一種簡單、經濟的大型真菌菌種的長期保藏方法。
一種大型真菌菌種的長期保藏方法，包括如下步驟(1)將需要保藏的菌種先接種到固體培養基上培養，等菌絲體將要長滿平板時將固體培養基切割成若干菌種塊；(2)先在容器中加入液體培養基與抗凍劑，再放進菌種塊，蓋緊瓶蓋，於-70℃下保存。
上述容器優選凍存管，上述抗凍劑優選甘油，甘油濃度優選15％。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明的大型真菌菌種的保藏方法可長期保藏，簡便且經濟，菌種不易產生變異。
圖1為金針菇Fve1菌種在-70℃下保存2年後接種到斜面上的菌絲生長情況；圖2為金針菇Fve4菌種在-70℃下保存2年後接種到斜面上的菌絲生長情況；
圖3為金針菇Fve1菌種在-70℃下保存2年後接種到液體培養基中的出菇情況圖4為金針菇Fve5菌種在-70℃下保存2年後接種到液體培養基中的出菇情況；圖5為金針菇Fve5菌種在-70℃下保存2年後接種到固體培養基中的出菇情況；圖6為金針菇Fve4菌種在-70℃下保存2年後接種到固體培養基中的出菇情況；圖7為金針菇Fve1菌種在-70℃下保存2年後接種到固體培養基中的出菇情況。
具體實施例方式
實施例1金針菇菌種的保存1.所用的培養基為常用的金針菇培養基，它們的配方分別為(1)PDSA固體平板培養基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B15-10mg，瓊脂20g，H2O 1L；(2)PDSB液體培養基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B15-10mg，H2O 1L。
2.供試金針菇菌株購自貴州市習水縣習酒鎮食用菌研究中心，菌株編號為Fve1、Fve2、Fve3、Fve4、Fve5。
具體步驟如下(1)按常規方法配製固體平板培養基，在超淨工作檯中分別接種0.5cm2大小的5個金針菇斜面母種於平板中間，接種後置於21℃溫度下培養；(2)一周後菌絲剛剛長滿培養皿時，在超淨工作檯中利用解剖刀輕輕分割平板，使成為0.5cm2的方形菌種塊；或利用自行設計的空心不鏽鋼柱切割成為直徑0.5cm的圓盤菌種塊。
(3)取5支1.8mL的無菌凍存管，在超淨工作檯中加入0.5-1.0mL的液體培養基(PDSB)，之後加入甘油使其終濃度為15％，分別放進3-8塊Fve1、Fve2、Fve3、Fve4和Fve5的0.5cm2的方形菌種塊或直徑為0.5cm的圓盤菌種塊，讓液體培養基全部掩蓋菌種塊。蓋緊瓶蓋，寫上標籤，於-70℃超低溫冰箱中保存。每個菌種保存10管。
實施例2金針菇保存菌種的檢測平板斜面菌絲觀察(1)按常規配製PDSA培養基，分別製作成平板和斜面。
(2)每隔半年從-70℃超低溫冰箱中取出金針菇菌種分別接種於斜面上，之後置於21℃的恆溫培養箱中培養。
(3)一周後觀察，發現菌種的菌絲形態正常和生長狀態良好(見圖1，圖2)。
(4)在超淨工作檯中，把在-70℃下保存2年的同一菌種同時接到平板兩側，菌落的菌絲接觸時沒有產生拮抗線，說明菌種沒有變異。
液體培養基出菇試驗
(1)按常規配製PDSB液體培養基，分裝於250mL的三角瓶中，每個三角瓶裝50mL。
(2)在超淨工作檯中，將實施例1所保存的金針菇接種於三角瓶中，之後置於21℃的恆溫培養箱中培養。
(3)3周後，-70℃保存的菌種均能長出正常的子實體(見圖3，圖4)。
固體培養基出菇試驗固體培養基配方棉籽殼85％，麥麩10％，糖1％，玉米粉3％，碳酸鈣1％。
(1)按固體培養基配方準確稱取各成分，以1∶1.5的料水比，混勻培養基。
(2)取17×30cm的聚丙烯塑膠袋，小心裝進培養基至1/2袋，培養基鬆緊合適，套上套環，塞好棉塞。
(3)把裝好的培養基袋置於121℃，1.5kg/cm2的壓力下滅菌1.5小時。
(4)待培養基冷卻後，在超淨工作檯中取以上活化的金針菇斜面菌種接一塊0.5cm2的菌種塊於培養袋中，之後置於21℃的恆溫培養箱中培養。
(5)3周後菌絲長滿菌袋，進入出菇管理階段，金針菇的出菇管理按《中國金針菇生產》(郭美英主編，中國農業出版社，2000年)的方法和步驟進行。出菇情況見圖5、圖6和圖7。
實施例3將本發明的保藏方法與現有斜面保藏法進行比較，具體見表1。
表1本發明方法與常規長期保存方法比較
權利要求
1.大型真菌菌種的長期保藏方法，其特徵在於包括如下步驟(1)將需要保藏的菌種先接種到固體培養基上培養，等菌絲體將要長滿平板時將固體培養基切割成若干菌種塊；(2)先在容器中加入液體培養基與抗凍劑，再放進菌種塊，蓋緊瓶蓋，於-70℃下保存。
2.如權利要求1所述的保藏方法，其特徵在於所述容器為凍存管。
3.如權利要求1所述的保藏方法，其特徵在於所述抗凍劑為甘油。
4.如權利要求1所述的保藏方法，其特徵在於所述菌種為金針菇、p香菇或靈芝。
全文摘要
本發明公開了大型真菌菌種的長期保藏方法，包括如下步驟(1)將需要保藏的菌種先接種到固體培養基上培養，等菌絲體快要長滿平板時將固體培養基切割成若干菌種塊；(2)先在容器中加入液體培養基與抗凍劑，再放進菌種塊，蓋緊瓶蓋，於－70℃下保存。本發明的大型真菌菌種的保藏方法可長期保藏，簡便且經濟，菌種不易產生變異。
文檔編號C12N1/14GK1952108SQ20061012338
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月7日 優先權日2006年11月7日
發明者林俊芳, 郭麗瓊, 王秀旭, 阮秋菊, 韓君莉 申請人:華南農業大學