一種鳥苷的生產工藝的製作方法

2023-05-02 21:15:46 1

專利名稱：一種鳥苷的生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鳥苷的發酵生產方法。
背景技術：
鳥苷(guanosine)是嘌呤核苷類物質的一種，分子式C10H13N505，相對分子質量283. 24，白色結晶性粉末，二水化合物為針狀結晶，110°C失水，熔點240°C (分解)，比旋光度-60°，能溶於稀礦酸、熱乙酸、稀鹼(lg/33mL)，沸水，微溶於冷水(lg/1320mL)，不溶於醇、醚、氯仿和苯。鳥苷是一個多用途的核苷，作為核苷類抗病毒藥物三氮唑核苷、無壞鳥苷和食品增鮮劑5』 -鳥苷酸的合成原料，其應用前景不亞於肌苷。鳥苷在醫藥工業中作為很多高效藥物的中間體，可用於三氮唑核苷、無壞鳥苷、鳥三磷，氟鐵龍等藥物的生產，對皰疹、感冒病毒，抗肝炎等有十分確切的療效，目前人們對該類藥品的認識水平日益提高，鳥苷的需求也不斷增加。 目前鳥苷的生產方法有化學合成法，酶水解RNA法，菌體自溶法和發酵法，由於化學合成法需要大量的有機溶劑，存在原料來源及環境汙染等問題在生產中極少試驗。發酵法生產鳥苷從二十世紀六七十年代以來，關於發酵法生產鳥苷的研究報導越來越多，鳥苷發酵屬於嘌呤類化合物的生產，其生物合成系統比較複雜，但許多微生物幾乎都有相同的生物合成和調節系統，其中研究的比較詳細的有枯草芽孢桿菌和產氨短桿菌，在枯草芽孢桿菌中，從PRPP開始經十步反應合成MP。由MP又分出兩條環形路線，一條經XMP合成GMP，再還原生產頂P。另一條環路經SAMP合成AMP，再回到MP。經過詳細研究已經清楚其反饋抑制和反饋阻遏的控制機制。核苷酸的生物合成途徑有兩條，一條是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5』 -磷酸核糖為出發物質的全合成途徑，一條是由嘌呤鹼基通過核糖基化及磷酸化而合成的補救途徑，但現有的鳥苷產量低、生產過程複雜。

發明內容
針對上述技術問題，本發明提供一種經濟有效的鳥苷的生產工藝，該工藝具有操作簡便、投資少、鳥苷的產量大的特點。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是一種鳥苷的生產工藝，包括菌種活化、種子培養、發酵和鳥苷提取步驟，菌種活化是指取_30±3°C下保藏的甘油種，解凍至室溫，吸取O. 1±0. 02ml接種於活化斜面，34±4°C恆溫靜置培養20_24h得工作種子。進一步在上述鳥苷的生產工藝中，所述的種子培養是指將載有工作種子的活化斜面接種至裝有種子培養基的搖瓶中(種子培養基是本領域常用的)，用紗布封口，140r/mon搖床上36±5°C振蕩培養8-10h得種子培養液。所述的發酵是取佔搖瓶發酵培養基體積6-12%的種子培養液接入裝有30mL發酵培養基的500mL搖瓶中，220r/min，36±5°C振蕩培養60±5h ;所述搖瓶發酵培養基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白腖2.0%、酵母粉2. O %、玉米漿水解液O. 5 %、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05 %、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02 %、這些物質重量比的誤差均為±10%。所述的發酵是取佔5L發酵罐發酵培養基體積10%的種子培養液接入5L自動控制發酵罐中，在5L發酵罐中裝有3L發酵培養基，通風量5±lL/min，培養溫度36±5°C，轉速150±10rpm，養50土a ;所述5L發酵罐發酵培養基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. I %、蛋白腖2. O %、酵母粉2.0%、玉米漿水解液10.0%、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨
0.01%、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05%、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02%，這些物質的重量比誤差均為±10%。在發酵過程中，通過自動流加氨水溶液控制發酵液的pH=6.4±0.03。在發酵過程，如果泡多，可以通過消泡泵手動或自動加入已滅菌的泡敵數滴消泡，發酵開始時流加玉米漿水解液，到45小時停止，所加玉米漿水解液的總量是培養基的10%。所述的鳥苷提取步驟是本領域技術人員常用的技術。(泡敵是發酵過程中起泡時，為了防汙染及有利於氧的傳遞而加入的物質，通常泡敵就是本領域技術人員常用的消泡劑。與現有技術相比，本發明菌種活化就是將保藏狀態的菌種接入斜面培養基中擴大培養，一般需要2-3代的活化過程，多次轉接培養是為了得到純而壯的培養物，即獲得活力旺盛的、接種數量足夠的培養物。因為保存條件往往和培養條件不一致，所以要活化，讓菌 種逐漸適應培養環境。使用時取一支工作種再次轉活，按上述條件培養為斜面種後，接入種子液。為了獲的足夠多的活力強的菌液，必須進行種子擴大培養。培養的關鍵點是把握好種子的生長曲線，在其對數生長期的後期進行移種。這樣能保證種子的活力，縮短發酵的延滯期。生產菌的上遊工程改造可以提高鳥苷的產量，但在發酵生產過程中對其優化代謝調控同樣對鳥苷的產量起著相當大的影響，本發明可以使鳥苷產量提高25%以上。
具體實施例方式下面，將通過本發明的實施例進行更加詳細的說明。但以下這些實施例只是為了對本發明進行詳細的說明而列舉的示例，本發明的範圍並不只局限於這些實施例。實施例I (搖瓶發酵)菌種活化菌種活化就是將保藏狀態的菌種接入斜面培養基中擴大培養,一般需要2-3代的活化過程，多次轉接培養是為了得到純而壯的培養物，即獲得活力旺盛的、接種數量足夠的培養物。因為保存條件往往和培養條件不一致，所以要活化，讓菌種逐漸適應培養環境。本案例為取-30°C保藏的甘油種，快速解凍至室溫，吸取O. Iml接種於活化斜面，34°C恆溫靜置培養20-24h，作為工作種於10°C保存。使用時取一支工作種再次轉活，按上述條件培養為斜面種後，接入種子液。種子培養為了獲的足夠多的活力強的菌液，必須進行種子擴大培養。培養的關鍵點是把握好種子的生長曲線，在其對數生長期的後期進行移種。這樣能保證種子的活力，縮短發酵的延滯期。接一環生長良好的活化斜面種至裝有25mL的種子培養基的500mL搖瓶中，9層紗布封口，置於旋轉式搖床上(140r/mon)，36°C振蕩培養8_10h。發酵搖瓶發酵培養的關鍵是環境培養條件嚴格控制，使各搖瓶的培養條件一致，不會因為放置的位置不同而造成瓶內發酵液的培養條件不同，導致產苷水平不一致或體現不出發酵水平的差異。發酵前，取上述種子培養液以6-12%接種量(指佔搖瓶發酵培養基體積6-12%的種子培養液)接入裝有30mL發酵培養基的500mL搖瓶中，220r/min，36°C振蕩培養60h。
搖瓶發酵培養基配比味精I. O %、尿素O. I %、蛋白腖2.0%酵母粉2. O %、玉米漿水解液O. 5%、磷酸二氫鉀O. 03%、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05%、氯化鈉
O.I %、硫酸錳0.01%、氯化亞鐵0.02%、玉米漿水解液5.0%。通過高效液相進行檢測，與以往的數據比較，鳥苷產量提高27%。實施例2(5L罐發酵)按10%接種量將種子液接入5L自動 控制發酵罐(發酵液溶氧自動顯示。溫度和PH值自動控制)中，裝液量3L，通風量5L/min，培養溫度36°C，轉速150rpm。通過自動流加氨水溶液控制PH值為6. 4 ± O. 03。發酵過程泡沫較多時，通過消泡泵手動或自動加入已滅菌的泡敵數滴即可迅速消泡，Oh流加玉米漿水解液，到45小時停止，總量為10%，50h停止發酵。發酵罐培養基配比味精I. 0%，尿素O. I %，蛋白腖2.0%酵母粉2.0%玉米漿1.0%,磷酸二氫鉀O. 03%，硫酸銨O. 01 %，硫酸鎂O. 01 %，碳酸鈣O. 05%，氯化鈉O. I%硫酸錳O. 01 %，氯化亞鐵O. 02 %。通過高效液相進行檢測，與以往的數據比較，鳥苷產量提高25%。實施例3(50L罐發酵)在搖瓶發酵及5L罐發酵可行的基礎上，進行放大發酵。種子製備過程與實施例2相同。按10%接種量將種子液接入50L自動控制發酵罐(發酵液D0、溫度、PH值、轉速自動控制)，裝液量30L，通風量8L/min，培養溫度36 °C，轉速200rpm，通過設定的pH值為6.4±0. I自動控制氨水溶液的流加。發酵後期泡沫較多，通過消泡泵自動加入已滅菌的泡敵消泡，Oh後流加玉米漿水解液，到45小時停止，總量為10%，約50h停止發酵。發酵罐培養基配比味精1.0%，尿素O. I %，蛋白腖2.0%酵母粉2.0%玉米漿1.0%,磷酸二氫鉀O. 03%，硫酸銨O. 01 %，硫酸鎂O. 01 %，碳酸鈣O. 05%，氯化鈉O. I%硫酸錳O. 01 %，氯化亞鐵0.02%。通過高效液相進行檢測，與以往的數據比較，鳥苷產量提高26%。
權利要求
1.一種鳥苷的生產工藝，包括菌種活化、種子培養、發酵和鳥苷提取步驟，其特徵在於菌種活化是指取-30±3°C下保藏的甘油種，解凍至室溫，吸取O. 1±0. 02ml接種於活化斜面，34±4°C恆溫靜置培養20-24h得工作種子。
2.根據權利要求I所述鳥苷的生產工藝，其特徵在於所述的種子培養是指將載有工作種子的活化斜面接種至裝有種子培養基的搖瓶中，用紗布封口，140r/mon搖床上36 ±5°C振蕩培養8-10h得種子培養液。
3.根據權利要求2所述鳥苷的生產工藝，其特徵在於所述的發酵是取佔搖瓶發酵培養基體積6-12%的種子培養液接入裝有30mL發酵培養基的500mL搖瓶中，220r/min，36 ±5°C振蕩培養60±5h ； 所述搖瓶發酵培養基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白腖2.0%、酵母粉2. O %、玉米漿水解液O. 5 %、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05%、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02%、這些物質重量比的誤差均為+10% ο
4.根據權利要求2所述鳥苷的生產工藝，其特徵在於所述的發酵是取佔5L發酵罐發酵培養基體積10%的種子培養液接入5L自動控制發酵罐中，在5L發酵罐中裝有3L發酵培養基，通風量5±lL/min，培養溫度36±5°C，轉速150± lOrpm，養50±2h ； 所述5L發酵罐發酵培養基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白腖2.0%、酵母粉2. O %、玉米漿水解液10. O %、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05 %、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02 %，這些物質的重量比誤差均為+10% ο
5.根據權利要求4所述鳥苷的生產工藝，其特徵在於在發酵過程中，通過自動流加氨水溶液控制發酵液的pH = 6. 4±O. 03。
6.根據權利要求4或5所述鳥苷的生產工藝，其特徵在於在發酵過程，通過消泡泵手動或自動加入已滅菌的泡敵數滴消泡，發酵開始時流加玉米漿水解液，到45小時停止。
全文摘要
本發明公開了一種鳥苷的生產工藝，包括菌種活化、種子培養、發酵和鳥苷提取步驟，其特徵在於菌種活化是指取-30±3℃下保藏的苷油種，解凍至室溫，吸取0.1±0.02ml接種於活化斜面，34±4℃恆溫靜置培養20-24h得工作種子。該工藝具有操作簡便、投資少、鳥苷的產量大的特點。
文檔編號C12P19/40GK102864193SQ20121032768
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月30日 優先權日2012年8月30日
發明者黃永嫦, 謝暢豐, 鄭凝堅, 馮今亮 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司