一種轉糖基α一半乳糖苷酶基因的製作方法

2023-05-02 14:44:31 4

專利名稱：一種轉糖基α一半乳糖苷酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種α-半乳糖苷酶基因，尤其涉及一種轉糖基α-半乳糖苷酶基因及其所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用。
背景技術：
寡糖是哺乳動物細胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物來源的生理活性物質的要素之一，具有強大的生物信息傳遞等功能。因而，寡糖用於藥物修飾、寡糖結構的分析和寡糖合成技術的發展就引起了人們的極大關注。寡糖作為一種療法雖然被科學家公認具有相當大的潛能，但是至今其重要的作用還是沒有得到充分的體現。其發展緩慢的原因之一是合成足夠於臨床使用量的寡糖非常困難。糖類化合物上多個可反應的羥基使特異性糖苷鍵的化學法合成步驟繁瑣，不適合大規模生產。酶法催化合成寡糖憑藉其簡單的步驟、特異的區域選擇性和立體選擇性，正在成為寡糖和糖綴合物合成的主流。
有兩類酶用於催化糖苷鍵的合成糖基轉移酶和糖苷酶。糖基轉移酶已經用於生產某些寡糖，但酶的較難獲得和核苷底物的高成本限制了其廣泛應用。而糖苷酶催化的糖苷和低聚糖合成反應途徑簡單，不需要其它輔助因子，底物通常為價格便宜的單糖和雙糖。酶較易獲得，性質穩定。但是，糖苷酶所進行的合成反應中，轉糖基新生成的糖苷和寡糖也可以重新被酶作為底物水解，反應處於水解和合成的動態平衡狀態，導致轉糖基產物的產量一般較低。為了打破這個平衡，科學家進行了不懈的努力。利用酶反應的熱力學及動力學原理加大底物濃度、提高反應溫度等可以在一定程度上提高糖苷產物的產量(10-40％)；採用高濃度有機溶劑(80-90％，v/v)或兩相反應體系，降低水的濃度和活性，促使反應平衡向糖苷合成的方向進行，進一步提高了糖苷產物的產量(40-60％)。但是反應體系中水的有效濃度的維持和低水環境下水的高活性都在一定程度上限制了產物的產量及這些方法的最終應用。
近年來，分子生物學技術的發展和進步大大推動了糖苷酶合成寡糖領域的研究。1998年，科學家對糖苷酶進行分子改造，在酶催化中心用非親核胺基酸殘基取代親核催化胺基酸殘基，產生了一類新型活性酶，只催化合成反應，因此命名為糖苷合成酶(Glycosynthases)。糖苷合成酶的出現，徹底解決了產物被水解的問題，從根本上提高了糖苷酶的轉糖基效率(轉糖基效率可達90％以上)。到目前為止，國際上發展的糖苷合成酶共有13種，來源於11種不同的微生物及植物，分別由β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-甘露聚糖苷酶等改造獲得，α-半乳糖苷合成酶的研究還未見報導。目前寡糖合成領域研究的熱點就是尋找不同來源的高效轉糖基糖苷酶，並獲得酶基因，以便在此基礎上進行基因改造獲得糖苷合成酶。
α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)，是一類重要的糖苷水解酶，在人、動物、植物及微生物體內均有發現，可特異性水解α-半乳糖苷鍵，還可以把α-半乳糖基轉移到不同的羥基類衍生物上。其水解活性研究得較多，被廣泛應用於加工農產品、人B→O血型改造、清除異種抗原以及治療遺傳性疾病法布萊氏病等；其轉半乳糖基活性直到1988年才被日本科學家報導，目前國際上僅報導了十種來源的α-半乳糖苷酶具有轉糖基活性，其中，有四種來源的α-半乳糖苷酶與蜜二糖進行了轉糖基反應並鑑定了產物結構，均為Galα(1→6)Galα(1→6)Glc。為了獲得新的酶法合成α-半乳糖苷鍵型，需要尋找新的轉糖基α-半乳糖苷酶。此外，由於不同來源的α-半乳糖苷酶轉半乳糖基反應的糖基受體專一性存在差異，因此尋找不同來源的轉糖基α-半乳糖苷酶對酶法合成不同α-半乳糖基寡糖及糖綴合物有著重要意義。
值得注意的是，轉糖基α-半乳糖苷酶遵循構型保持糖苷酶的作用機制，催化可逆反應，導致產物產率受到一定限制，因此在糖的大規模合成中存在局限性。這就需要進一步研究酶基因，為分子改造提供基礎，以獲得α-半乳糖苷合成酶，從根本上提高合成效率。目前國際上僅有五種轉糖基α-半乳糖苷酶基因報導，而有關α-半乳糖苷合成酶的研究報導還是空白。所以研究不同來源的轉糖基α-半乳糖苷酶基因，可以為糖苷酶的分子改造提供新的酶源，對高效合成不同鍵型的α-半乳糖基寡糖及糖綴合物有著重要意義。
經檢索，目前國際上沒有短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)轉糖基α-半乳糖苷酶基因的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的轉糖基α-半乳糖苷酶基因，為α-半乳糖苷合成酶的獲得提供新的酶源，並填補國內外短雙歧桿菌轉糖基α-半乳糖苷酶基因研究的空白。
本發明涉及的轉糖基α-半乳糖苷酶基因來源於短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700，特徵如下(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全長2226鹼基；(2)由於遺傳密碼的簡併性，具有不同於SEQ ID No.1所示核苷酸序列但與SEQID No.1所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；(3)該基因編碼741個胺基酸，序列如SEQ ID No.1所示。
上述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其方法是，將該基因克隆到pET-22b質粒表達載體上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達重組α-半乳糖苷酶，特徵如下(1)上述基因在大腸桿菌中表達的重組酶為雙亞基蛋白，聚合體分子量約為160kD，單亞基分子量約為80kD；酶對對硝基苯酚α-D-半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)的Km為0.17mmol/L，Vmax為4.43μmol/(L·min)，對蜜二糖和棉子糖的Km值分別為0.66mmol/L，2.20mmol/L，Vmax分別為0.58μmol/(L·min)，0.65μmol/(L·min)；酶對pNPG適宜反應的溫度為37℃～40℃，適宜反應的pH為5.5～6.5；酶於4℃保存時，在pH 5.5～9.5範圍內至少穩定保存24小時；Hg2+、Cu2+、Ag+強烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、DTT、EDTA對酶的活性沒有抑制作用；(2)上述基因在大腸桿菌中表達的重組酶在水解蜜二糖或棉子糖的反應體系中具有轉糖基活性，反應中有轉糖基產物生成，其中，酶在蜜二糖反應體系中的主要轉糖基產物結構為Galα(1→4)Galα(1→6)Glc，國際上現有的α-半乳糖苷酶的報導中，將半乳糖基轉至蜜二糖的鍵型全部為α(1→6)鍵；在以pNPG為糖基供體時，能將半乳糖基轉移到多種糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等；其廣泛的受糖體底物特異性，可用以合成多種α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。
其中，上述重組酶對pNPG的最適反應溫度為37℃。
其中，上述重組酶對pNPG的最適反應pH為5.5～6.0。
在上述pH5.5～9.5的緩衝範圍中，pH5.5～8.0範圍使用磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩衝液，pH8.0～10.0範圍使用硼酸—氫氧化鈉緩衝液。
在上述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用中，將該基因克隆到pET-22b質粒表達載體上，不僅可以獲得大量重組酶以解決雙歧桿菌難以培養的問題，同時還可用於基因改造，即對酶基因進行定點突變，在酶催化中心用非親核胺基酸殘基取代親核催化胺基酸殘基，以獲得α-半乳糖苷合成酶，徹底去除水解反應，從根本上提高α-半乳糖基寡糖及糖綴合物的合成效率。


圖1為本發明的α-半乳糖苷酶基因表達的重組酶以蜜二糖為底物的轉糖基反應。
其中Lane 1，蜜二糖與滅活酶液反應；Lane 2，蜜二糖與純酶反應。
圖2為本發明的α-半乳糖苷酶基因表達的重組酶以棉子糖為底物的轉糖基反應。
其中Lane 1，棉子糖與滅活酶液反應；Lane 2，棉子糖與純酶反應。
具體實施例方式
實施例1短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700染色體DNA的提取將短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700接種於5mL MRS培養基中，37℃厭氧培養24小時，取1.5ml培養物，12,000轉/分離心2分鐘，所得沉澱懸於565μL的TE緩衝液中，加入溶菌酶至終濃度10mg/ml，37℃溫育30分鐘；加入30μL10％(質量體積比)的十二烷基硫酸鈉(SDS)和5μL 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，於37℃溫育1小時；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)，混勻；12,000轉/分離心5分鐘，將上清液轉入新管中，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻；12,000轉/分離心5分鐘，將上清轉入新管中，加入2倍體積無水乙醇，輕輕混勻直到DNA沉澱下來；12,000轉/分離心5分鐘，DNA沉澱用70％乙醇洗滌2次；真空乾燥10分鐘，重溶於50μL的TE緩衝液。
上述MRS培養基配方為蛋白腖1g/L；K2HPO40.2g/L；檸檬酸三銨0.2g/L；牛肉浸膏1g/L；NaAc·3H2O 0.05g/L；MgSO4·7H2O 0.02g/L；MnSO4·4H2O 0.005g/L；酵母浸膏0.5g/L；葡萄糖2g/L；Tween 800.1g/L；pH 6.0～6.6，115℃滅菌30分鐘；TE緩衝液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，調pH為8.0。
實施例2B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段克隆從GenBank中檢索到不同菌株的α-半乳糖苷酶基因的DNA序列，用在線軟體Clustal W比較序列同源性，利用引物設計軟體Primer5.0設計了一對簡併PCR引物Wtz-F5』-(TC)TI AA(TC)A(AC)(N)TGG GA(AG)G-3』Wtz-R5』-(GA)TC CCA(CT)TT(N)A(CT)(GA)TA(GA)TC-3』以提取的B.breve ATCC 15700染色體DNA為模板，用上述引物進行PCR。PCR擴增體系總體積為50μL，含超純水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa Taq 2.5U。PCR擴增條件95℃預變性5分鐘；反應28個循環(95℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘)；28個循環結束後72℃延伸10分鐘。PCR產物約為460bp左右，經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測，然後回收，所得產物即為B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段，測得序列如SEQ ID No.2。
詳列如下gattatccca ctttatgtag tctatgccga gttcgctcac aagcgcatcc atgcagccgt 60acacctagcc gtaggcctgt gggttcgtca ggtcgaccac ctgctggttg cggccctgca 120ttggcaggcg atgcgccgtg gggcgcagca cccagtcggg gtgctctcgg tacatgtccg 180aatcgggatt caccatctct ggctcgaacc acaagccgaa ctccatgcct ttggcgtgca 240cgtagtcggc gagcgccttg agtgaatggt cgccgtctgg ccacacgtcc tgagctatgt 300gccagtcgcc cagcccagcg gtatcgtcgc gccgggcgcc gaaccacccg tcgtccacca 360cgaagcgttc cacgccgcta gcggcggcct tgtcggcgag cgccttcaac gtgtcgaaat 420catgctggaa ctacaccgcc tcccatgtgt tcaaatc 480上述α-半乳糖苷酶基因保守序列DNA片段與已報導的2株雙歧桿菌——青春雙歧桿菌(B.adolescentis)和長雙歧桿菌(B.longum)的α-半乳糖苷酶基因均有較高的同源性，說明此保守DNA片段非常適合作為探針進行標記，與B.breve ATCC 15700的DNA進行Southern雜交，篩選B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因。
實施例3B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因克隆(1)B.breve ATCC 15700部分基因文庫的構建B.breve ATCC 15700染色體DNA提取後，同時進行六組完全酶切，六組酶分別是BamH I-HindIII、BamH I-Nde I、BamH I-Xba I、HindIII-Nde I、HindIII-Xba I、BamH I(TaKaRa)。電泳後轉膜，用已克隆的457bp的DNA片段為探針，進行Southern雜交。結果顯示B.breve ATCC 15700染色體DNA經BamH I和Nde I雙酶切後，可與探針雜交的片段在6kb左右，可用於構建部分基因文庫。經實驗估測，部分基因文庫中81.3％左右的重組菌連有外源片段，文庫構建成功。
(2)含α-半乳糖苷酶基因重組質粒的篩選、驗證及序列測定挑選重組菌單菌落接種到5ml LB液體氨苄(100μg/mL)培養基中，37℃過夜搖床培養，離心收集菌細胞，測定酶活，篩選到有α-半乳糖苷酶水解活性的重組菌(編號為51)，提取質粒分別進行BamH I單酶切及BamH I-HindIII雙酶切驗證，結果顯示，單酶切得到11.5kb左右的一條帶，而雙酶切得到5.5kb左右和6kb左右的兩條帶，分別符合載體和外源片段的大小。將該重組菌質粒進行測序，測序由上海博亞生物技術有限公司完成。
上述LB培養基配方為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉7g/L，pH 7.0～7.5，121℃滅菌20分鐘。
上述α-半乳糖苷酶水解活性測定取菌細胞30mg，加150μL 50mmol/L醋酸鈉緩衝液(pH5.5)配製的2mmol/LpNPG，37℃反應10分鐘後，加入1.05ml、0.2mol/L、pH 10.5硼酸緩衝液終止反應，12000轉/分離心2分鐘，上清液於400nm比色。活力單位規定每分鐘從對硝基苯酚糖苷底物中水解釋放1μmol硝基苯酚的糖苷酶量為1個酶活單位(U)。
(3)B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因序列的確定對上述測序得到的序列進行分析，顯示有一個開放閱讀框架，由2226個核苷酸組成，編碼741個胺基酸，與已發表的青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌的α-半乳糖苷酶胺基酸序列同源性均超過70％，並且具有α-半乳糖苷酶的保守序列模式，因而確定該核苷酸序列為B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因序列，如SEQ ID No.1所示。
實施例4 B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因的亞克隆及其在大腸桿菌中的表達設計引物，引入能插入pET-22b質粒(Novagen)的Nde I和BamH I酶切位點(pET-22b質粒載體具有C端6His標記，便於表達蛋白的純化)，序列如下22b-F5』-CTCTCATATGATGGCAATCATGGATTTCCACGGGAG-3』22b-R5』-ATATGGATCCGCTCTC ACGCGCGTGGCGCTGAAC-3』將重組菌51接種於5ml LB液體氨苄培養基中，37℃過夜搖床培養，提取質粒DNA作為模板，採用上述引物進行PCR擴增。PCR擴增體系總體積為50μL，含超純水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa LA Taq 2.5U。PCR擴增條件95℃預變性5分鐘；反應28個循環(95℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘)；28個循環結束後72℃延伸10分鐘。PCR產物約為2.2kb左右，經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測，然後回收，所得產物即為B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因片段。依次加Nde I和BamH I於37℃酶切3小時，進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測，回收目的片段，同時採用同樣酶切方法處理pET-22b質粒載體。將製備好的酶基因片段與pET-22b載體按一定比例混合，採用連接試劑盒(TaKaRa DNA LigationKitVer.2.0)於16℃連接8小時。然後採用CaCl2轉化法轉化宿主菌E.coli BL21(DE3)，轉化菌液塗布氨苄青黴素平板，37℃過夜培養。提取陽性菌落質粒，酶切驗證，對質粒酶切正確的重組菌進行表達實驗，即重組菌經IPTG誘導培養後，離心收集菌細胞，測α-半乳糖苷酶水解活性和轉糖基活性，將完全符合要求的重組菌作為菌種保存。
上述α-半乳糖苷酶水解活性測定方法同實施例3。
上述α-半乳糖苷酶轉糖基活性測定方法取50mg菌細胞，懸浮於1mL pH7.0、10mmol/L的磷酸鉀緩衝液中，於冰水浴用玻璃珠破碎細胞，懸液於10000轉/分鐘離心20分鐘，所得上清液即為粗酶液。取20μL粗酶液，加入100μL pH7.0磷酸鉀緩衝液配製的100mmol/L蜜二糖或棉子糖溶液，於37℃反應2小時，12,000轉/分離心5分鐘，上清液即為反應產物。
將反應產物進行薄層層析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，確定轉糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)點樣後，在展層劑(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展層，霧噴顯色劑(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羥基甲苯)，於120℃烘烤10分鐘，糖斑點顯色，如果底物糖斑點以下生成了新的大分子寡糖斑點，則α-半乳糖苷酶有轉糖基活性。
實施例5 B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達與純化將實施例4所保存的E.coli BL21(DE3)重組菌接種於200mL LB氨苄培養液，37℃培養12小時，轉接於2L LB氨苄培養液，37℃培養，測定培養液在600nm下的吸光度變化。當吸光值達0.5～0.8時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，再繼續培養3～5小時，於12000轉/分離心3分鐘，獲得細胞沉澱，懸浮於80mL pH7.0，10mmol/L的磷酸鉀緩衝液。在冰水浴中超聲波破碎細胞，破碎液於4℃以12000轉/分離心20分鐘，所得上清即為粗酶液。
粗酶液用Ni-NTA Agarose(QIAGEN)親合柱層析除去不帶6His標記的雜蛋白，然後用DEAE Sepharose Fast Flow柱層析得到了電泳純α-半乳糖苷酶。
實施例6B.breve ATCC 15700重組α-半乳糖苷酶的基本酶學特性(1)酶的分子量酶蛋白分子量的測定採用聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。根據樣品和標準蛋白的PAGE圖，測定樣品和標準蛋白的相對遷移值Rf，用標準蛋白的Rf值對分子量的對數作標準曲線。再根據純酶樣品的Rf值，就可求得其分子量。SDS-PAGE採用垂直板式不連續系統電泳方式，電泳分離膠濃度為12％，濃縮膠為4％；Native gradient PAGE(非解離梯度聚丙稀醯胺凝膠電泳)採用5～20％線形梯度垂直板狀聚丙烯醯胺凝膠，4℃電泳。
Native gradient PAGE顯示酶蛋白的分子量約為160kD，SDS-PAGE顯示酶蛋白單亞基分子量約為80kD，表明該酶為一個雙亞基蛋白。
(2)酶的動力學參數酶的動力學參數的測定採用雙倒數法。
將30μL純酶(1.42U/mL)與150μL不同濃度(濃度範圍0.24～1.75mmol/L)的pNPG溶液混合，於37℃反應3分鐘，加1.05mL 0.2mol/L、pH 10.5硼酸緩衝液終止反應，測定OD400，計算水解速率，用雙倒數作圖法測得酶對pNPG的Km值為0.17mmol/L，Vmax為4.43μmol/(L·min)。
將30μL純酶(2.5U/mL)與150μL不同濃度(濃度範圍0.072～0.35mol/L)的蜜二糖溶液混合，於37℃反應30分鐘，用葡萄糖試劑盒(上海豐匯醫學科技有限公司)測定水解的葡萄糖含量，計算水解速率，用雙倒數作圖法測得酶對蜜二糖的Km值為0.66mmol/L，Vmax為0.58μmol/(L·min)。
將30μL純酶(2.5U/mL)與150μL不同濃度(濃度範圍0.072～0.35mol/L)的棉子糖溶液混合，於37℃反應30分鐘，用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法測定水解反應產物中的還原糖含量，計算水解速率，用雙倒數作圖法測得酶對棉子糖的Km值為2.20mmol/L，Vmax為0.65μmol/(L·min)。
(3)溫度和pH對酶活性的影響在適當的溫度範圍(20℃～70℃)內，每5℃為一個梯度測定酶在該溫度下的相對酶活。結果表明酶適宜反應的溫度為37℃～40℃，最適反應溫度為37℃。將酶在上述溫度梯度下保溫2小時後測定相對酶活。結果表明酶在40℃以下比較穩定，60℃以上失活很快，70℃失去所有的酶活。
用不同pH的緩衝液配製酶反應體系，測定相對酶活，結果表明酶適宜反應的pH為5.5～6.5，最適反應pH為5.5～6.0；酶在不同pH的緩衝液中4℃保存24小時，測定相對酶活，結果表明酶在pH 5.5～9.5範圍內穩定。
上述酶活測定方法為30μL適當稀釋的純酶與150μL2mmol/L的pNPG溶液混合，於37℃反應10分鐘，加1.05mL 0.2mol/L、pH 10.5的硼酸緩衝液終止反應，測定OD400。
上述不同pH緩衝液分別為醋酸—醋酸鈉緩衝液pH3.5～6.0；磷酸氫二鉀—磷酸二氫鉀緩衝液pH5.5～8.0；硼酸—氫氧化鈉緩衝液pH8.0～10.0。
(4)部分金屬離子和化合物對酶活性的影響以pNPG為底物，在酶活測定反應體系中分別加入終濃度為1mmol/L的各種金屬離子、10mmol/L的EDTA、DTT，測定相對酶活。結果顯示，Hg2+、Cu2+、Ag+強烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、DTT、EDTA對酶的活性沒有抑制作用。
實施例7B.breve ATCC 15700重組酶以蜜二糖及棉子糖為底物的轉糖基反應將20μL pH7.0磷酸鉀緩衝液配製的100mmol/L蜜二糖和棉子糖溶液，分別與4μL純酶於37℃反應2小時，100℃煮沸5分鐘滅活酶液，然後進行薄層層析(Thin-LayerChromatography，TLC)分析。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)點樣後，在展層劑(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展層，霧噴顯色劑(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羥基甲苯)，於120℃烘烤10分鐘，糖斑點顯色。如圖1、圖2，底物糖斑點以下生成了新的大分子寡糖斑點，是轉糖基產物。該酶在蜜二糖反應體系中的主要轉糖基產物結構為Galα(1→4)Galα(1→6)Glc，而國際上現有的α-半乳糖苷酶的報導中，將半乳糖基轉至蜜二糖的鍵型全部為α(1→6)鍵。
實施例8B. breve ATCC 15700重組酶廣泛的受糖體底物特異性B.breve ATCC 15700重組酶具有廣泛的受糖體底物特異性，能以pNPG為糖基供體，將半乳糖基轉移到多種糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等。
17μL 10mmol/L pH7.0磷酸鉀緩衝液配製的100mmol/L糖或醇受體溶液、3μL100mmol/L pNPG和5μL純酶，於37℃進行反應，在5小時取樣。同時做對照實驗，不加糖基供體pNPG，0小時、5小時取樣。然後進行TLC分析，結果表明，pNPG為糖基供體時，原有的糖受體(醇因不能顯色除外)和水解產生的半乳糖斑點以下出現了新的糖斑點，是轉糖基生成的α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。在對照實驗中，未生成新的糖斑點，說明上述受體分子不能在酶的作用下發生自轉。重組酶廣泛的受糖體底物特異性，可用以合成多種α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。
序列表SEQ ID No.1110山東大學120一種轉糖基α-半乳糖苷酶基因1412005-9-26160221012112226212DNA213短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700221短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700轉糖基α-半乳糖苷酶基因222(1)…(2226)4001atg gct ata atg gat ttc cac ggg agt tcg agc cgg ggc gaa gat ata cac gtg gtg tag 60Met Ala Ile Met Asp Phe His Gly Ser Ser Ser Arg Gly Glu Asp Ile His Val Val Tyr1 5 10 15 20gtc gag cag cgg gac gcg cgg tcc gcg ttc gct ttc gcg att gtg gat cgc gag ctg cca 120Val Glu Gln Arg Asp Ala Arg Ser Ala Phe Ala Phe Ala Ile Val Asp Arg Glu Leu Pro25 30 35 40cgc ata gtg cat tgg ggc cgg cca ctc tcc gac cca cgc aca ctc gtg gct gcg gtg gat 180Arg Ile Val His Trp Gly Arg Pro Leu Ser Asp Pro Arg Thr Leu Val Ala Ala Val Asp45 50 55 60gcg ctg cgc cca cag cgg gtg tcc ggc gcg ctc gac gag acg gcc tgg cca agc ata ctg 240Ala Leu Arg Pro Gln Arg Val Ser Gly Ala Leu Asp Glu Thr Ala Trp Pro Ser Ile Leu65 70 75 80ccc acg cag gcc gaa gct tgg acc ggc gcg cca cgc ttc gtg gtg cgc gcc ggc ggc gtg 300Pro Thr Gln Ala Glu Ala Trp Thr Gly Ala Pro Arg Phe Val Val Arg Ala Gly Gly Val85 90 95 100gag ctg ttc tgc cgc ttc acc gtg acc gat gtg cgc ata gac gat ggc ggc gct acg gtg 360Glu Leu Phe Cys Arg Phe Thr Val Thr Asp Val Arg Ile Asp Asp Gly Gly Ala Thr Val105 110 115 120agc gcc gag gac gcc gag cag ggc gtg cgc gtg ctg tgg cgg tgc gaa ctg cgg gaa agc 420Ser Ala Glu Asp Ala Glu Gln Gly Val Arg Val Leu Trp Arg Cys Glu Leu Arg Glu Ser125 130 135 140ggc ctc gtg cgc caa cgc atg tcg gtt gtg aac atg cgc gcc gag gaa ctg gaa ata ggc 480Gly Leu Val Arg Gln Arg Met Ser Val Val Asn Met Arg Ala Glu Glu Leu Glu Ile Gly
145 150 155 160acg gtg gag ctc gct ttc ccc gtg ccc gcg gac atg acc gag ata ctc acg acg acc ggc 540Thr Val Glu Leu Ala Phe Pro Val Pro Ala Asp Met Thr Glu Ile Leu Thr Thr Thr Gly165 170 175 180cac cac ctg cgc gaa cgc tcg cca cag cgc cag cca ttc acg ata ggc cgg ttc cag aag 600His His Leu Arg Glu Arg Ser Pro Gln Arg Gln Pro Phe Thr Ile Gly Arg Phe Gln Lys185 190 195 200gcg agc ctc gtg gga cgc ccc gat ttc gat tcg tcg ctg ctg ctg aac gtg ggc cgc ccc 660Ala Ser Leu Val Gly Arg Pro Asp Phe Asp Ser Ser Leu Leu Leu Asn Val Gly Arg Pro205 210 215 220ggc ttc ggt ttc acg cac ggc gac gtg tac tcc gtg cat gtg gcc tgg agc ggc aac tca 720Gly Phe Gly Phe Thr His Gly Asp Val Tyr Ser Val His Val Ala Trp Ser Gly Asn Ser225 230 235 240ctc atg gcc gcg gaa cgg ctg cca tac acc tcc ggc ctg ata ggc ggc gcg gaa gcg ctt 780Leu Met Ala Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Thr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Glu Ala Leu245 250 255 260tcc ggc ggg gaa gtg acg ttg tgt gcg gac ggg gac gat aac cgc tac acg aca cca tgg 840Ser Gly Gly Glu Val Thr Leu Cys Ala Asp Gly Asp Asp Ash Arg Tyr Thr Thr Pro Trp265 270 275 280ctg tac ggc tcg tac ggc gaa ggg ttc aac gag gtg gct tca cgc ttc cac aac gaa ctg 900Leu Tyr Gly Ser Tyr Gly Glu Gly Phe Asn Glu Val Ala Ser Arg Phe His Asn Glu Leu285 290 295 300cgc gcg acg cac gcg cag tgg cgc gcc gaa ctc ggt gtg gcc gaa aaa cca cgc ccc gtg 960Arg Ala Thr His Ala Gln Trp Arg Ala Glu Leu Gly Val Ala Glu Lys Pro Arg Pro Val305 310 315 320atc ctc aac aca tgg gag gcg gtg tag ttc cag cat gat ttc gac acg ttg aag gcg ctc1020Ile Leu Asn Thr Trp Glu Ala Val Tyr Phe Gln His Asp Phe Asp Thr Leu Lys Ala Leu325 330 335 340gcc gac aag gcc gcc gct agc ggc gtg gaa cgc ttc gtg gtg gac gac ggg tgg ttc ggc1080Ala Asp Lys Ala Ala Ala Ser Gly Val Glu Arg Phe Val Val Asp Asp Gly Trp Phe Gly345 350 355 360gcc cgg cgc gac gat acc gct ggg ctg ggc gac tgg cac ata gct cag gac gtg tgg cca1140Ala Arg Arg Asp Asp Thr Ala Gly Leu Gly Asp Trp His Ile Ala Gln Asp Val Trp Pro365 370 375 380gac ggc gac cat tca ctc aag gcg ctc gcc gac tac gtg cac gcc aaa ggc atg gag ttc1200Asp Gly Asp His Ser Leu Lys Ala Leu Ala Asp Tyr Val His Ala Lys Gly Met Glu Phe385 390 395 400ggc ttg tgg ttc gag cca gag atg gtg aat ccc gat tcg gac atg tac cga gag cac ccc1260Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asp Ser Asp Met Tyr Arg Glu His Pro405 410 415 420gac tgg gtg ctg cgc ccc acg gcg cat cgc ctg cca atg cag ggc cgc aac cag cag gtg1320
Asp Trp Val Leu Arg Pro Thr Ala His Arg Leu Pro Met Gln Gly Arg Asn Gln Gln Val425 430 435 440gtc gac ctg acg aac cca cag gcc tac ggc tag gtg tac ggc tgc atg gat gcg ctt gtg1380Val Asp Leu Thr Asn Pro Gln Ala Tyr Gly Tyr Val Tyr Gly Cys Met Asp Ala Leu Val445 450 455 460agc gaa ctc ggc ata gac tac ata aag tgg gac cac aac aaa tag gtg acc gaa gcg gtg1440Ser Glu Leu Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Trp Asp His Asn Lys Tyr Val Thr Glu Ala Val465 470 475 480tcg cca cgc acc ggc cga cca gcc gtg cat ggg cag aca ctc gcc gtg tac cgc ata ttc1500Ser Pro Arg Thr Gly Arg Pro Ala Val His Gly Gln Thr Leu Ala Val Tyr Arg Ile Phe485 490 495 500cgc gac ctc aaa acc gcg cac ccc ggc ctg gag ata gaa agc tgc tcg tcc ggc ggc ggc1560Arg Asp Leu Lys Thr Ala His Pro Gly Leu Glu Ile Glu Ser Cys Ser Ser Gly Gly Gly505 510 515 520cgc gtg gac ctc gcg ata ctc tcg ctc gcc gac cgc ata tgg gcg tcg gat tgc gtg gat1620Arg Val Asp Leu Ala Ile Leu Ser Leu Ala Asp Arg Ile Trp Ala Ser Asp Cys Val Asp525 530 535 540ccg gtg gaa cgc gcg gac ata cag cgc tac acg tcg ctt ctc gtg cca cca gag atg ata1680Pro Val Glu Arg Ala Asp Ile Gln Arg Tyr Thr Ser Leu Leu Val Pro Pro Glu Met Ile545 550 555 560ggc gaa cat gtg ggc gcg agc ccc gcg cat tcc acc cac cgg gcg acg agc cag cag atg1740Gly Glu His Val Gly Ala Ser Pro Ala His Ser Thr His Arg Ala Thr Ser Gln Gln Met565 570 575 580cgc atg gcg atg gcg ttc ttc ggg cat ctg ggc ata gaa tgg aac ctg ctc aag gaa cca1800Arg Met Ala Met Ala Phe Phe Gly His Leu Gly Ile Glu Trp Asn Leu Leu Lys Glu Pro585 590 595 600cag tcg gcg ctc gac gaa ctc ggt gtg tgg gtg gac gcg tac aag cgg cac cgc gcg gac1860Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Gly Val Trp Val Asp Ala Tyr Lys Arg His Arg Ala Asp605 610 615 620ttc gcg cac ggc acc gtg gtg cac ggc gat gcg gcc gat ccc gcg gtg cgc gtg gat ggc1920Phe Ala His Gly Thr Val Val His Gly Asp Ala Ala Asp Pro Ala Val Arg Val Asp Gly625 630 635 640gtc gtg agc gcc agc ggc gaa cgc gcc gtg tac cgc ttc acg caa ttg acg aca tcg cag1980Val Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Ala Val Tyr Arg Phe Thr Gln Leu Thr Thr Ser Gln645 650 655 660acc tac cca gcg gct cca gtg cgc ctg cca gga ctc gcc cca gac gcc gac tag ctg ata2040Thr Tyr Pro Ala Ala Pro Val Arg Leu Pro Gly Leu Ala Pro Asp Ala Asp Tyr Leu Ile665 670 675 680cag cca ctc gct tgc aat ctc gcc agc ggc gag cca ttc aca caa ata ggt aac ggg cag2100Gln Pro Leu Ala Cys Asn Leu Ala Ser Gly Glu Pro Phe Thr Gln Ile Gly Asn Gly Gln685 690 695 700
agc gaa ctc ggc tgg tgg aac agc caa ggc gtg gtg atg aac ggc ggt gcg ctc gac gcg2160Ser Glu Leu Gly Trp Trp Asn Ser Gln Gly Val Val Met Asn Gly Gly Ala Leu Asp Ala705 710 715 720ttc ggc ttg cgc cca cca tgc ata cac cca gcg aac gcc gtg ctg ttc agc gcc acg cgc2220Phe Gly Leu Arg Pro Pro Cys Ile His Pro Ala Asn Ala Val Leu Phe Ser Ala Thr Arg725 730 735 740gtg tga2280Val741SEQ ID No.22102211457212DNA221B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段222(1)…(457)4002gattatccca ctttatgtag tctatgccga gttcgctcac aagcgcatcc atgcagccgt 60acacctagcc gtaggcctgt gggttcgtca ggtcgaccac ctgctggttg cggccctgca 120ttggcaggcg atgcgccgtg gggcgcagca cccagtcggg gtgctctcgg tacatgtccg 180aatcgggatt caccatctct ggctcgaacc acaagccgaa ctccatgcct ttggcgtgca 240cgtagtcggc gagcgccttg agtgaatggt cgccgtctgg ccacacgtcc tgagctatgt 300gccagtcgcc cagcccagcg gtatcgtcgc gccgggcgcc gaaccacccg tcgtccacca 360cgaagcgttc cacgccgcta gcggcggcct tgtcggcgag cgccttcaac gtgtcgaaat 420catgctggaa ctacaccgcc tcccatgtgt tcaaatc 480
權利要求
1.一種轉糖基α-半乳糖苷酶基因，具有如下特徵(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全長2226鹼基；(2)由於遺傳密碼的簡併性，具有不同於SEQ ID No.1所示核苷酸序列但與SEQID No.1所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；(3)該基因編碼741個胺基酸，序列如SEQ ID No.1所示。
2.如權利要求1所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，將所述基因克隆到pET-22b質粒表達載體上，在大腸桿菌中表達重組α-半乳糖苷酶；其中上述基因在大腸桿菌中表達的重組酶為雙亞基蛋白，聚合體分子量約為160kD，單亞基分子量約為80kD；酶對對硝基苯酚α-D-半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)的Km為0.17mmol/L，Vmax為4.43μmol/(L·min)，對蜜二糖和棉子糖的Km值分別為0.66mmol/L，2.20mmol/L，Vmax分別為0.58μmol/(L·min)，0.65μmol/(L·min)；酶對pNPG適宜反應的溫度為37℃～40℃，適宜反應的pH為5.5～6.5；酶於4℃保存時，在pH5.5～9.5範圍內至少穩定保存24小時；Hg2+、Cu2+、Ag+強烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、DTT、EDTA對酶活性沒有抑制；酶在水解蜜二糖或棉子糖的反應體系中具有轉糖基活性，反應中有轉糖基產物生成，其中，酶在蜜二糖反應體系中的主要轉糖基產物結構為Galα(1→4)Galα(1→6)Glc；酶在以pNPG為糖基供體時，能將半乳糖基轉移到多種糖、醇化合物上。
3.如權利要求2所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，所述酶對pNPG的最適反應溫度為37℃。
4.如權利要求2所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，所述酶對pNPG的最適反應pH為5.5～6.0。
5.如權利要求2或4所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，在所述pH5.5～9.5的緩衝範圍中，pH5.5～8.0範圍使用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩衝液，pH8.0～10.0範圍使用硼酸-氫氧化鈉緩衝液。
6.如權利要求2所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，所述糖、醇化合物是半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇。
7.如權利要求2或6所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，所述酶具有廣泛的受糖體底物特異性，酶將半乳糖基轉移到所述糖、醇化合物上，可用以合成多種α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。
8.權利要求1所述轉糖基α-半乳糖苷酶基因的應用，其特徵是，將所述基因克隆到pET-22b質粒表達載體上，可用於基因改造，即對酶基因進行定點突變，在酶催化中心用非親核胺基酸殘基取代親核催化胺基酸殘基，以獲得α-半乳糖苷合成酶。
全文摘要
本發明公開了一種轉糖基α－半乳糖苷酶基因，所述基因由短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)基因組DNA藉助PCR擴增獲得高保守DNA片段，然後進行Southern雜交獲得。該基因核苷酸序列全長2226鹼基，編碼741個胺基酸。由該基因表達的重組酶特徵為酶為雙亞基蛋白，聚合體分子量約為160kD，單亞基分子量約為80kD；酶對對硝基苯酚α－D－半乳糖苷的K
文檔編號C12N9/38GK1778928SQ200510044898
公開日2006年5月31日 申請日期2005年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者肖敏, 趙晗, 王勤鵬, 王鵬 申請人:山東大學