基於磁性分離和量子點標記的副溶血性弧菌檢測試劑盒的製作方法

2023-05-03 01:23:01 1

本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及基於磁性分離和量子點標記的副溶血性弧菌檢測試劑盒。

背景技術：

副溶血性弧菌（vibrioparahaemolyticus，vp）是一種嗜鹽性弧菌，存在於近海的海水、海底沉積物和魚類、貝類等海產品或鹽醃漬品中，它是我國沿海地區最為常見的一種食源性致病菌。其引起的食物中毒，主要引起急性胃腸炎甚至敗血症。近年來由副溶血性弧菌引起食物中毒的發生規模以及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，已經超過沙門氏菌，躍居微生物食源性疾病病原菌第一位，成為我國首要的食源性致病菌。因而，加強對食品中副溶血性弧菌的快速準確的檢測技術研究十分必要。

目前對副溶血性弧菌的檢測方法，主要有傳統分離培養及鑑定法、免疫學方法及基於pcr的分子生物學方法等。分離培養及鑑定法是檢測副溶血弧菌的標準檢驗方法，它包括前增菌、選擇性增菌、選擇性培養、生化鑑定和血清學反應等過程。該方法檢測結果相對可靠，但存在分離細菌操作步驟複雜、檢測時間長等缺點，難以滿足當今社會對食源性致病菌快速檢測的需要。免疫學方法是基於抗原和抗體特異反應的原理而進行的一種檢測方法，具有操作簡便、快速等優點，但其檢測靈敏性及特異性易受抗體吸附能力和抗體特異性以及基質背景幹擾等因素的影響，同時存在交叉反應，檢測結果準確性受限。以pcr為基礎的定性、定量分析方法是目前應用較為廣泛的分子生物學檢測方法，該方法具有特異性強、靈敏度高等特點，雖然可以滿足快速檢測的要求，但操作過程中易出現交叉汙染和錯誤信號的放大等缺點，造成假陽性或假陰性結果，影響實驗結果的準確性。pcr應用要求有嚴格的實驗室分區、實驗室管理和質量控制措施，對設備和操作人員的要求較高，不利於在基層日常的檢測工作中普及和應用。此外，由於食品中副溶血性弧菌的檢測，通常需要較複雜的樣本處理及長時間的預增菌過程，尤其在病原菌含量較低情況下難於檢出。因此，採用一種有效的樣品前富集技術，建立一種快速、簡便、靈敏度高、特異性強的副溶血性弧菌檢測方法，對加強食源性疾病的預防和控制具有重要意義。

近年來，一些新的病原體檢測技術迅速發展起來，並逐漸應用於衛生檢驗工作中。免疫磁珠分離(immunomagneticseparation，ims)技術是將免疫學反應與微球的磁性相結合的一種免疫學技術，它可將富集、分離融為一體，在免疫學檢測、細胞分離、蛋白質純化等方面有廣泛應用，具有操作簡便、快速、高效等優點。在食源性致病菌的檢測方面，ims法有效結合抗原-抗體反應的特異性和磁珠的磁場響應性，可實現從複雜基質中對目標菌的快速分離和富集，能夠有效消除基質幹擾，從而提高檢測效率，是有效的樣品前處理方法，具有較好的開發應用前景。雞卵黃抗體（igy）是通過免疫注射產蛋雞，從雞蛋中分離出的抗體，製備技術方法簡單，製備的抗體產量高且性質穩定，可以彌補單克隆抗體製備繁瑣、抗體產量低等缺點，在微生物檢測和疾病治療等方面已廣泛應用。因此，在獲得理想效價及高特異性的igy抗體的基礎上，將其應用於免疫學方法檢測食品中的vp，可有效縮短檢測時間、提高方法準確性。量子點(quantumdots，qds)是一種新型的半導體納米材料，具有較好的光化學特性和光譜特性，作為一種新型的標記材料，與傳統的螢光染料相比，具有螢光壽命長，激發光譜寬，發射光譜窄，對稱性好，易於合成和生物修飾等特點，使量子點作為螢光探針在分析化學、衛生檢測等領域得到了廣泛的應用。本研究擬聯合利用免疫磁珠分離技術、雞卵黃抗體技術和量子點螢光標記技術，依據抗原抗體特異性反應的原理，通過免疫磁珠上的抗體與樣品中目標菌的特異性結合，從樣品中富集分離出目標菌，再利用製備的量子點納米螢光生物探針進行標記，得到磁珠-細菌抗原-量子點「三明治」複合物，通過對複合物的量子點螢光強度進行檢測，從而實現對目標菌的快速、定量的檢測。

技術實現要素：

本發明的目的在於為解決針對現有副溶血性弧菌檢測方法存在的問題，而提供了一種基於磁性分離和量子點標記的副溶血性弧菌檢測試劑盒。

基於磁性分離和量子點標記的副溶血性弧菌檢測試劑盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子點標記的抗副溶血性弧菌的納米螢光生物探針；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用edc和nhs活化後，再與兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體igg共價偶聯；所述的納米螢光生物探針是羧基化的螢光量子點活化後，與副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy偶聯；

所述的兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體igg的蛋白濃度為1mg/ml；

所述的副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy是以副溶血性弧菌全菌為抗原，經滅活後，免疫spf級健康高產蛋雞，採用peg6000法對所述的免疫後雞蛋中的卵黃抗體igy進行純化；蛋白濃度為1mg/ml；

所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是由下述方法製備的：

①取羧基化磁珠100μl至1.5ml離心管中，置於磁力架上磁性分離後棄去上清，加入mest緩衝溶液400μl清洗3次；所述mest緩衝液各成分含量如下：0.1mol/l2-(n-嗎啡啉)乙磺酸，0.5ml/l吐溫-20；所述的mest緩衝液ph為5.0；

②依次加入濃度為10mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亞胺鹽酸鹽mest緩衝液的溶液200μl，濃度為10mg/ml的n-羥基琥珀醯亞胺mest緩衝液的溶液200μl，利用垂直混合儀在25℃下活化30min；反應結束後用pbst清洗3遍；所述的pbst緩衝液各成分：8gnacl，0.2g/lkcl、1.44g/lna2hpo4、0.24gkh2po4，0.5ml/ltween-20；所述的pbst緩衝液ph為7.4；

③活化後的磁珠，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，向各離心管中加入用pbst緩衝液稀釋的副溶血性弧菌兔多克隆抗體igg孵育2h漩渦混勻後，利用垂直混合儀在25℃下反應2h；偶聯反應結束後，置於磁力架上磁性分離後棄去上清，400μlpbst溶液清洗3遍，加入1ml1%的bsa封閉；封閉結束後，置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，用400μlulpbs緩衝液洗滌3遍後，重懸於400μl的pbs溶液中，4℃保存；所述的pbs緩衝液各成分含量如下：8gnacl，0.2g/lkcl、1.44g/lna2hpo4、0.24gkh2po4；所述的pbs緩衝液ph為7.4；

所述的量子點標記的抗副溶血性弧菌的納米螢光生物探針由下述方法製備的：取10ul羧基化的螢光量子點於1.5ml棕色進樣瓶中，加入用mest緩衝液配製的5mg/mledc和5mg/mlnhs各200μl，漩渦混勻後，利用垂直混合儀在25℃下活化30min；活化結束後將溶液轉移至微量離心管中，12000rpm離心5min；棄去上清並用pbst清洗1遍，活化後的量子點重懸於400μl的pbst中；加入副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy120μg，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下避光反應2h；將量子點溶液移至微量離心管中，12000rpm離心5min，棄去上清並用pbst清洗1遍；加入1ml1%的bsa，渦旋混勻後利用垂直混合儀在25℃下繼續避光孵育1h進行封閉；封閉結束後，將量子點溶液轉移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，棄去上清並用pbst清洗1遍；重懸於400μl的pbs溶液中，4℃保存；

所述的基於磁性分離和量子點標記的副溶血性弧菌檢測試劑盒，還包括陰性質控品、陰性質控品，所述的陽性質控品為含有滅活的副溶血性弧菌的pbs溶液；所述陰性質控品為無菌pbs溶液。

本發明提供了基於磁性分離和量子點標記的副溶血性弧菌檢測試劑盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子點標記的抗副溶血性弧菌的納米螢光生物探針；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用edc和nhs活化後，再與兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體igg共價偶聯；所述的納米螢光生物探針是羧基化的螢光量子點活化後，與副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy偶聯；利用本發明製備的試劑盒進行副溶血性弧菌的檢測具有特異性強、重複性好、靈敏度高的優點，可用於對食品中副溶血性弧菌的快速檢測。

附圖說明

圖1免疫磁珠最佳加入量結果；

圖2為免疫磁珠富集時間的確定結果；

圖3量子點標記的納米螢光生物探針最佳標記時間的確定結果；

圖4量子點標記的納米螢光生物探針最佳標記量的確定結果；

圖5檢測方法的檢出限確定結果；

圖6檢測方法的特異性結果；

圖7模擬樣檢測結果。

具體實施方式

本發明是根據免疫學中的抗體抗原特異性反應原理，利用免疫磁珠對樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優點，結合量子點螢光標記技術，建立的一種具備多重信號放大、靈敏度高、特異性好、簡便快速檢測副溶血性弧菌的方法，具有較好的市場應用前景。

下面將結合附圖，對本發明的實施例進行具體的描述。實施中未註明具體條件的實驗方案，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件進行。

實施例1副溶血性弧菌兔克隆抗體igg的製備

取濃度為1×109cfu·ml-1滅活菌液與等量的弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑乳化完全，製備滅活疫苗。首次免疫取濃度為1×109cfu·ml-1弗氏完全佐劑疫苗免疫健康紐西蘭大白兔（由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供），採用背部皮下多點注射法，每隻免疫2ml，在第二周、第三周採用同等劑量的弗氏不完全佐劑疫苗對兔進行第二次免疫、第三次免疫。10天後，用滅活菌液加強免疫兩次。每次免疫前兔耳緣靜脈取血，測定血清效價。達到分離標準，兔心臟採血，分離血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。採用飽和硫酸銨鹽析沉澱法對所述的抗血清中的多克隆抗體igg進行純化；採用間接elisa法對純化後抗體的效價和特異性進行測定，表1為免疫前後兔血清及抗體效價測定結果，結果顯示，隨著免疫次數的增加，血清抗體效價逐漸升高，最終獲得的副溶血性弧菌兔多克隆抗體效價可以達到1:1024000；表2為兔多克隆抗體igg特異性結果，結果顯示，製備的抗體特異性較好；採用bca蛋白定量試劑盒對純化後的igg抗體的濃度進行測定，並用pbs緩衝液將其蛋白濃度調整為1mg/ml，-20℃保存備用。

表1免疫前後兔血清及抗體igg效價測定結果

實施例2副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy的製備。

按實施例1的方法製備副溶血性弧菌弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑疫苗即可用來免疫蛋雞。採用肌肉多點注射的方式將疫苗接種於雞胸。首次免疫採用弗氏完全佐劑疫苗，每隻雞1ml，間隔兩周後採用弗氏不完全佐劑疫苗進行第二次免疫，隨後每隔兩周進行一次強化免疫。收集免疫前後的雞蛋，儲存於4℃冰箱中備用。採用peg6000鹽析法對雞蛋中的卵黃抗體進行提取。採用間接elisa法對純化前後卵黃抗體的效價和特異性進行測定，表3為免疫前後雞血清及抗體igy效價測定結果，結果顯示，隨著免疫次數的增加，雞血清中的抗體效價逐漸升高，最後一次免疫後，抗體效價高達1：64000，經提取純化後，最終獲得的副溶血性弧菌igy抗體效價可以達到1:128000。表4為雞卵黃抗體igy特異性結果，結果顯示製備的igy抗體特異性較好；採用bca蛋白定量試劑盒對純化後的igy抗體的濃度進行測定，並用pbs緩衝液將其蛋白濃度調整為1mg/ml，-20℃保存備用。

表3免疫前後雞血清及抗體igy效價測定結果

表4雞卵黃抗體igy特異性結果

實施例3抗副溶血性弧菌免疫磁珠的製備

取羧基化磁珠（10mg/ml）100μl至1.5ml離心管中，置於磁力架上磁性分離後棄去上清，加入mest緩衝溶液400μl清洗3次；依次加入10mest緩衝溶液配置的濃度為10mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亞胺鹽酸鹽（edc）和n-羥基琥珀醯亞胺（nhs）各200μl，渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下活化30min，活化結束後置於磁力架上磁性分離後棄去上清，將活化後的磁珠重懸於280μl的pbst中，得到活化後的磁珠；然後所製備的副溶血性弧菌兔多克隆抗體igg加入100μg孵育2h孵育2h，用400μlpbst溶液清洗3遍，加入1ml1%的bsa封閉磁珠表面未共價偶聯抗體的羧基官能團；封閉結束後，將離心管置於納米磁分離器中進行磁分離後移除上清，用400μlulpbs緩衝液洗滌3遍後,重懸於400μl的pbs溶液中，4℃保存備用。

實施例4量子點標記的抗副溶血性弧菌的納米螢光生物探針的製備

取10ul羧基化的螢光量子點於1.5ml棕色進樣瓶中，加入用mest緩衝液配製的5mg/mledc和nhs各200μl，漩渦混勻後，利用垂直混合儀在25℃下活化30min。活化結束後將溶液轉移至微量離心管中，12000rpm離心5min。棄去上清並用pbst清洗1遍，活化後的量子點重懸於400μl的pbst中。加入所製備的副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy120μg，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下避光反應2h。偶聯反應結束後，將量子點溶液移至微量離心管中，12000rpm離心5min，棄去上清並用pbst清洗1遍。加入1ml1%的bsa，渦旋混勻後利用垂直混合儀在25℃下繼續避光孵育1h進行封閉。封閉結束後，將量子點溶液轉移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，棄去上清並用pbst清洗1遍。最後重懸於400μl的pbs溶液中，4℃保存備用。

實施例5緩衝液的配置

pbs緩衝液:取nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo41.44g、kh2po40.24g，溶於800ml蒸餾水中，用naoh調節ph至7.4，在定溶至1000ml。

實施例6菌液標準品的製備

取﹣80℃保存菌種，進行菌株活化。將活化後的菌株在3%氯化鈉胰蛋白腖瓊脂平板上劃線分純，37℃培養18~24h後，挑取單個菌落，接種3%氯化鈉胰蛋白腖液體培養基，37℃振蕩培養12~18h。取1ml菌液10倍倍比稀釋平板傾注法進行活菌計數。剩餘的菌液用1%甲醛在室溫下滅活10min，將滅活的菌液3000rpm離心3min，收集菌體，然後用pbs溶液充分混勻，製成菌懸液並，用pbs溶液調節菌懸液濃度為109cfu·ml-1，存於4℃冰箱中備用。

實施例7質控品的製備

①陽性質控品：陽性質控品由含103~105滅活的副溶血性弧菌的pbs溶液構成；

②陰性質控品：陰性質控品由滅菌後的pbs溶液構成。

實施例8基於磁性分離和量子點標記技術的副溶血性弧菌檢測方法的建立

1.免疫磁珠最佳加入量的選擇

取25、50、75、100、150μl由實施例3所製備好的免疫納米磁珠分別加入到1ml含105cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩衝液中，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下富集反應1h，進行免疫捕獲，反應結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。將沉澱重懸於300μl的pbs中，加入100μl由實施例4所製備的螢光量子點生物探針，漩渦混勻後利用垂直混合儀在室溫25℃下避光孵育1h，進行螢光標記。孵育結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，得到磁珠—菌體抗原—量子點「三明治」夾心複合物。將得到的複合物重懸於1ml的pbs溶液中，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。圖1為免疫磁珠加入量優化結果，結果顯示當隨著磁珠加入量的增加，樣品螢光強度也逐漸增強，當免疫納米磁珠加入量達到50μl時，螢光值達到最大。再繼續增加免疫磁珠的量,螢光值反而降低。故選擇50μl作為免疫磁珠的最佳加入量。

2.免疫磁珠富集時間的選擇

取6份實施例3所製備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含105cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩衝液中，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下分別富集15，30，45，60，90，120min。富集結束後通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，加入100μl由實施例4所製備的螢光量子點生物探針在25℃下避光孵育1h進行標記。孵育結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸於1ml的pbs溶液，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。圖2為免疫磁珠富集時間的確定結果，結果顯示，隨著富集時間的增加，樣品的螢光強度呈上升趨勢。在富集時間為60min之後，隨著時間的延長，螢光強度有所上升，但差異並不明顯。故選擇60min作為免疫磁珠最佳富集時間。

3.量子點標記的納米螢光生物探針最佳標記時間的確定

取6份實施例3所製備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含105cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩衝液中，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結束後通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加100μl量子點探針，在25℃下避光孵育15，30，45，60，90，120min進行標記。孵育結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸於1ml的pbs溶液，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。圖3為量子點標記的納米螢光生物探針最佳標記時間的確定結果，結果顯示，隨著量子點探針標記時間的增加，樣品的螢光強度呈上升趨勢。而當量子點探針的標記時間在90min繼續增大時，樣品的螢光強度增加不明顯，故選擇90min作為量子點探針的最佳標記時間。

4.量子點標記的納米螢光生物探針最佳標記量的確定

取6份實施例3所製備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含105cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩衝液中，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結束後通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加入50、100、200、300、400、500μl量子點探針，在25℃下避光孵育90min進行標記。孵育結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸於1ml的pbs溶液，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。圖4為量子點標記的納米螢光生物探針最佳標記量的確定結果，結果顯示，隨著量子點探針用量的增加，樣品的螢光強度呈上升趨勢。而當量子點探針的量在300μl繼續增大時，樣品的螢光強度增加不明顯，故選擇300μl作為量子點探針的最佳標記量。

檢測方法的評價

（1）檢出限實驗

取7份實施例3所製備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含0，101，102，103，104，105，106cfu/ml副溶血性弧菌的pbs緩衝液中，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結束後通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加300μl量子點探針，在25℃下避光孵育90min。孵育結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸於1ml的pbs溶液，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。圖5為檢測方法的檢出限確定結果，以樣品螢光強度值與空白對照螢光值之比≥2.1為判定該方法的最低檢測限。結果顯示當菌液濃度為102到106cfu/ml時，複合物的螢光強度與菌液濃度呈線性關係，其標準曲線為y=57.06x+13.80(r2=0.989)，該方法的最低檢測限（lod）為102cfu/ml。

（2）特異性實驗

取8份實施例3所製備的免疫磁珠50μl，分別加入1mlpbs和1ml含105cfu/ml的副溶血性弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌的菌液以及副溶血性弧菌和沙門氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌o157：h7、副溶血性弧菌和單增李斯特菌的混合菌液，漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結束後通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加300μl量子點探針，在25℃下避光孵育90min。孵育結束後，通過磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸於1ml的pbs溶液，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。圖6為檢測方法的特異性結果，結果顯示用本方法檢測沙門氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌時，複合物的螢光強度值與空白對照pbs溶液的螢光強度值相近，故該方法不能識別沙門氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌；而使用本方法檢測副溶血性弧菌與沙門氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌的混合菌液時，複合物的螢光強度與陽性對照副溶血性弧菌相近，故本方法特異性較好，能特異性識別副溶血性弧菌。

（3）重複性實驗

取102，104，106cfu/ml三種濃度的待測菌液，每個濃度的菌液設3個平行樣，按照所建立的方法，對待測樣品在同一天進行測定，評價檢測方法的日內重複性。按照所建立的方法，對待測樣品連續三天進行測定，評價檢測方法的日間重複性。表5為檢測方法重複性實驗結果。結果顯示，日內變異係數在4.03%~7.41%、，日間變異係數在2.03%~7.83%，均小於10%，表明建立的檢測方法重複性良好。

表5檢測方法重複性結果

實施例9試劑盒的製備

由實施例3所描述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠、實施4例所描述的量子點標記的抗副溶血性弧菌的納米螢光生物探針、實施例5所描述的緩衝液、實施例6所描述的菌液標準品、實施例7所描述的質控品共同組成基於磁性分離和量子點標記的檢測副溶血性弧菌抗原的試劑盒。

實施例10試劑盒的使用方法

待檢食品樣品研磨後，取5g勻漿，加入試劑盒中的pbs緩衝液10ml，充分混勻後，將1ml浸提液轉入離心管中，向該離心管中加入試劑盒中的抗副溶血性弧菌免疫磁珠50μl,漩渦混勻後利用垂直混合儀在25℃下富集60min,富集結束後將離心管插入磁力架分離，用移液器吸出上清。添加試劑盒中的pbs緩衝液洗滌3遍，磁分離後吸出洗滌液，再加入300μl試劑盒中的量子點標記的抗副溶血性弧菌的納米螢光生物探針，室溫下置於旋轉混合儀上反應,在25℃下避光孵育90min，通過量子點上的抗體與免疫納米磁珠上的副溶血性弧菌抗原的免疫結合，量子點被標記到副溶血性弧菌表面，形成磁珠—副溶血性弧菌抗原—量子點「三明治」複合物。反應完成後，磁吸分離，除去多餘的量子點標記探針，並用pbs緩衝液清洗3遍，複合物重新分散在1mlpbs緩衝液中，利用螢光光譜儀，在激發波長為350nm時，檢測樣品的螢光強度值。按上述同樣的方法檢測試劑盒中提供的陰性質控品及陽性質控品樣品，並利用標準菌液製作標準曲線，若陽性質控品樣品的螢光值小於陰性質控品，則表明試劑盒失效。

實施例11模擬樣品的檢測

將蛤蜊去殼碾磨後，稱取5g溶解於10ml的pbs溶液中4℃浸泡24h，過濾收集浸出液。用該浸出液稀釋副溶血性弧菌，分別配製成濃度為0，101，102，103，104，105，106cfu/ml的菌懸液然後按照所建立的方法，檢測模擬樣品。圖7為模擬樣檢測結果，結果顯示，隨著菌液濃度的增加，反應產物的螢光強度逐漸增大，當菌液濃度為102到106cfu/ml時，複合物的螢光強度與菌液濃度呈線性關係，其標準曲線為y=24.41x+33.50(r2=0.968)。根據樣品螢光強度值與空白對照螢光值之比≥2.1為判定該方法的最低檢測限，則此方法在該樣品中的檢測限為102cfu/ml

綜上，利用本發明製備的試劑盒進行副溶血性弧菌的檢測具有特異性強、重複性好、靈敏度高的優點，可用於對食品中副溶血性弧菌的快速檢測。