狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗的製作方法

2023-05-02 19:01:26

專利名稱：狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種在腺病毒E3區攜帶狂犬病病毒糖/核等結構蛋白表達盒的犬2型腺病毒重組疫苗，特別是涉及一種狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗。
背景技術：
目前用於犬狂犬病預防的疫苗主要包括濃縮純化的滅活疫苗和凍幹的弱毒活疫苗。濃縮純化滅活苗製備工藝複雜，成本較高，比較適用於發達國家；弱毒活疫苗製備工藝相對簡單，免疫期也較長，在發展中國家應用較多。但弱毒活疫苗在敏感動物體內具有毒力返祖的潛在危險，曾有動物接種後發生狂犬病的個例報導。
狂犬病病毒由糖蛋白(G)、核蛋白(N)、基質蛋白(M)、磷酸化蛋白(NS)和轉錄酶大蛋白(L)等五種結構蛋白組成，其中，糖蛋白是唯一一種可以誘導機體產生中和抗體的保護性抗原成分；核蛋白主要誘導產生特異性細胞免疫，同時還可以促進中和抗體的產生；其它結構成分尚未發現和免疫功能有關。近年來，以糖蛋白和核蛋白作為目的抗原的疫苗研究比較活躍，先後報導了亞單位疫苗、基因工程疫苗、抗獨特型抗體苗、活載體疫苗以及DNA疫苗等，其中以糖蛋白為基礎的亞單位疫苗和基因工程疫苗雖然製備比較容易，但由於免疫原性較弱，未能得到實際應用；抗獨特型抗體苗在技術上一直沒有成熟，不可能形成規模生產；以痘苗病毒和人5型腺病毒為載體表達糖蛋白或核蛋白的重組活載體疫苗，在北美和西歐等國家經過野生動物的免疫試驗，證明具有很好的免疫保護作用，但前者存在再次免疫排斥問題。後者在歐洲野生動物的狂犬病預防試驗中發揮了重要作用，但在作為人基因治療載體時發現存在一定的安全問題，因此均未被正式批准應用。DNA疫苗方面的研究文章近年來很多，但綜合來看，狂犬病DNA疫苗中抗原蛋白在體內的表達量及其誘導的抗體水平甚低。

發明內容
本發明的目的在於提供一種狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，具體地說，是以犬2型腺病毒為載體，在其基因組E3區內進行部分缺失，並插入由巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子指導，以狂犬病病毒糖/核等結構蛋白cDNA為目的基因，以SV40病毒或牛生長激素基因多聚A(poly A)為終止信號共同組成的表達盒。此種重組病毒疫苗接種動物後可誘導機體產生針對狂犬病病毒的中和抗體和細胞免疫，對狂犬病病毒強毒株的攻擊有保護力。
本發明的技術方案是這樣實現的首先，將狂犬病病毒(RV)糖/核等結構蛋白cDNA克隆在一個由巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子和SV40病毒poly(A)信號序列組成的表達盒中，糖/核等結構蛋白的表達受CMV啟動子的調控，並隨犬2型腺病毒的複製而表達；其次，將狂犬病病毒糖/核等結構蛋白表達盒插入在犬2型腺病毒部分缺失的E3區內，該缺失是通過E3區天然位點和/或人工突變位點的酶切，去除了位點間的序列實現的；E3區的前13個核苷酸是pVIII基因的3』末端序列，不在缺失區內；然後，使狂犬病病毒糖/核等結構蛋白表達盒的啟動子方向和犬2型腺病毒基因組的轉錄方向一致，即為正向插入；第四，狂犬病病毒糖/核等結構蛋白隨重組病毒增殖而表達，在宿主細胞內翻譯出完整的該結構蛋白，並進行正確的翻譯後加工過程，其免疫原性與來源病毒株(狂犬病病毒疫苗株SRV9)糖/核等結構蛋白一致；第五，本重組病毒疫苗的增殖、擴大培養以及免疫接種的方式和載體病毒疫苗株犬2型腺病毒完全一致；第六，動物在接種本重組疫苗以後，將同時獲得針對犬腺病毒感染和狂犬病病毒感染的免疫力，可以抵抗正常致死劑量強毒的攻擊。
一、狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的重組犬2型腺病毒的構建過程包括1.首先通過PCR克隆犬2型腺病毒基因組(31.3kb)上下遊兩末端各1.0kb的片段，正向、串聯連接克隆到質粒pPolyII的多克隆位點，形成重組質粒pPoly-CAV53end(4.1kb)。上遊片段的5』端有ClaI位點，下遊片段的3』端有AscI位點，兩片段中間形成單一酶切位點NotI，可以線性化，兩個片段在質粒中的排列方式如

圖1所示。
2.利用犬2型腺病毒疫苗株培養液提取病毒的全基因組，和經NotI酶切線性化的pPoly-CAV53end共轉化E coli SURE，塗布氨苄青黴素抗性瓊脂平板，過夜培養後挑取重組菌落，擴大培養，鹼裂解法提取質粒，酶切鑑定，獲得重組有犬2型腺病毒全基因組的質粒克隆，命名為pPolyII-CAV2(33.3kb)；以SalI和NruI雙酶切，回收29.2kb大片段A備用。
3.以狂犬病病毒SRV9株糖/核等結構蛋白cDNA為目的基因，通過SalI/NotI酶切質粒pTX，並經Klenow和dNTPs補平，獲得其cDNA片段B；同時，通過EcoRV酶切pIRES1neo，牛小腸鹼性磷酸酶(CIAP)脫磷，獲得載體片段C，B、C二片段以T4DNA連接酶連接過夜，轉化JM109大腸桿菌，鑑定獲得正向連接的糖/核等結構蛋白表達載體pIX-neo。
4.通過NotI和XbaI雙酶切pIX-neo，Klenow和dNTPs補平後回收大片段D，D片段以T4DNA連接酶自連過夜，轉化大腸桿菌JM109，鑑定，獲得neo基因缺失的糖/核等結構蛋白表達載體pIX-neoΔ。
5.以NruI和XhoI雙酶切糖/核等結構蛋白表達載體pIG-neoΔ，以Klenow和dNTPs補平後回收含外源基因的片段E，作為糖/核等結構蛋白的表達盒待用。
6.提取犬2型腺病毒基因組，KpnI酶切，回收4.861kb片段F(在全基因組中的位置為23303-28164bp)，其中含有E3區。將片段F克隆到pVAX1載體的KpnI位點，獲得pVAX-E3。
7.以DraIII和SspI雙酶切pVAX-E3，Klenow和dNTPs補平並經CIAP去磷後回收6.76kb片段G。片段E、G以T4 DNA連接酶連接過夜，轉化JM109大腸桿菌，鑑定獲得糖/核等結構蛋白表達盒與E3轉錄方向一致的重組質粒pVAX-E3X。
8.利用SalI和NruI酶切pVAX-E3X，回收含外源基因表達盒的片段H，定向克隆到片段A中，轉化JM109，鑑定重組質粒，獲得正確插入目的基因的重組病毒基因組質粒pPolyII-CAV2-X。
9.鹼裂解法製備5微克重組病毒基因組質粒pPolyII-CAV2-X，以ClaI和AscI雙酶切，游離重組全基因組，乙醇沉澱酶切產物，通過脂質體轉化法將該重組全基因組轉化犬腎傳代細胞系MDCK，每兩天傳代一次，直至細胞出現典型的葡萄串狀細胞病變。
10.病變MDCK細胞部分上清收集保存，餘下部分提取病毒基因組，以HindIII和XhoI分別酶切分析鑑定，獲得重組有糖/核等結構蛋白表達盒的犬2型腺病毒。
二.狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的重組犬2型腺病毒的免疫原性
1.在MDCK細胞上大量製備狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的重組犬2型腺病毒，測定TCID50。以無免疫史的家犬為受試動物，每條犬肌肉注射0.2ml TCID50為10-6.0的重組病毒；同時以犬2型腺病毒疫苗株免疫犬作為對照組。
2.免疫後1周開始每隔1周採集和分離免疫犬及對照犬血清一次。
3.採用間接ELISA方法，即以純化的狂犬病病毒作為抗原包被酶標板，待檢免疫犬血清與之反應，再以辣根過氧化物酶標記的羊抗犬二抗結合併顯色。結果表明，重組病毒免疫後狂犬病病毒(糖/核等結構蛋白)特異性抗體顯著升高。
4.採集核蛋白重組苗免疫後4周犬的抗凝血液，按2×0.1ml分裝入2個離心管中，加入紅細胞裂解液，感作後離心，沉澱用0.2mlPBS懸浮，將FITC標記的羊抗犬CD4+和CD8+抗血清分別與PBS懸浮的白細胞4℃感作1h，經PBS洗滌2次後懸浮進行FACS檢測。結果表明，免疫犬CD4+數量較對照組顯著增高，CD4+/CD8+比值顯著增加。說明，重組苗中核蛋白誘導了水平較高的細胞免疫。
三.狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的重組犬2型腺病毒誘導產生抗體的中和試驗作用及免疫保護作用取前一試驗中對照組及免疫組犬血清各100μl，各與35LD50狂犬病強毒CVS細胞毒混合，室溫孵育3h後，後肢皮下注射BALB/c乳鼠各40隻，每隻10μl，觀察4周。結果顯示，與對照組犬血清共孵育的CVS造成全部40隻乳鼠發病死亡，而重組病毒免疫犬血清孵育組無發病致死。說明該重組CAV-2誘發機體產生的糖/核等結構蛋白抗體具有顯著的中和作用。
從以上結果可以得出，本發明的積極效果在於重組病毒是通過將攜帶狂犬病病毒糖/核等結構蛋白表達盒的重組全基因組DNA序列轉染犬2型腺病毒E3區易感細胞(即MDCK細胞系)中獲得的。其無需進行大量複雜的病毒分離、鑑定和純化工作。同時本重組疫苗除了具有犬2型腺病毒的生物學和免疫學特徵以外，還展現了狂犬病病毒糖蛋白或核蛋白的免疫學特性，即除了可刺激機體產生針對犬腺病毒的免疫力以外，還可產生針對狂犬病病毒的免疫力，實現了外源基因的持續穩定表達。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述實施例1CAV-2可複製性全基因組的克隆參照CAV-2DNA首、尾端核苷酸序列，設計如下2對引物F55』-CCATCGATGCATCATCAATAATATACAGGACAAAGR55』-GCGGCCGCTTCGGCAAGGGCCTTTAGATAGCF35』-GCGGCCGCACTCATAGAAGTAGGCAGCTCCGR35』-CGGCGCGCCATCATCAATAATATACAGGACAAAG其中F5內引入ClaI位點(ATCGAT)，R5、F3內引入NotI位點(GCGGCCGC)，R3內引入AscI位點(GGCGCGCC)。
以CAV-2基因組DNA為模板，以F5R5、F3R3引物對分別進行PCR擴增，反應混合物成分如下10×PCR Buffer5μl25mM MgCl 4μlCAV-2DNA 1μl(200ng)10mM引物 各5μl
2.5mM dNTP 3μlPfu DNA聚合酶 1μl(1U)加水補足至總體積50μlPCR條件如下96℃預變性5min後進入循環95℃40sec55℃40sec72℃120sec25個循環後，PCR產物以DNA回收試劑盒回收。引物對F5R5的擴增產物以ClaI和NotI雙酶切，引物對F3R3的擴增產物以NotI和AscI雙酶切，載體pPolyII以ClaI和AscI雙酶切，酶切反應參照如下體系進行10×Buffer 5μlPCR產物或質粒500ng限制性內切酶 5U加水補足至總體積 50μl酶切條件為37℃水浴1h，反應完成後，於1％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下切取酶切後的條帶，以DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，溶於20μl去離子水中備用。
上述3個酶切產物在如下體系內，12℃進行連接反應過夜10×ligation Buffer 2μlDNA片段 各約100ngT4DNA連接酶 1μl加水補足至總體積 20μl
取過夜連接產物5μl，轉化E.coli JM109，塗布氨苄青黴素抗性LB-瓊脂平板，鑑定重組菌落，正確重組質粒命名為pPoly-CAV53end(4.1kb)。
以NotI酶切pPoly-CAV53end，質粒線性化後，取約200ng，與CAV-2基因組DNA 1000ng混合，共轉化E.coli SURE感受態細菌，塗布氨苄青黴素抗性LB-瓊脂平板，鑑定重組菌落。經細菌內同源重組，CAV-2 DNA完整重組入質粒pPoly-CAV53end，該重組質粒命名為pPolyII-CAV-2(33.3kb)。以AscI和ClaI雙酶切該重組質粒可游離出CAV-2全基因組。
實施例2含CAV-2E3區片段的克隆、改造和狂犬病病毒糖/核等結構蛋白表達盒的構建參照實施例1中的酶切反應體系，取CAV-2DNA 1μg，以KpnI酶切，電泳，切膠，以試劑盒回收其中的4.8kb片段；再以KpnI酶切質粒pVAX1，以鹼性磷酸酶(CIAP)去磷酸化後，回收線性化片段(3.0kb)。按照實施例1中的連接反應體系將4.8kb的含E3區的片段和3.0kb的pVAX1連接，重組質粒命名為pVAX-E3(7.8kb)。對pVAX-E3以DraIII和SspI進行雙酶切，以Klenow補平末端，CIAP去磷酸化後回收6.76kb片段備用。
以SalI和NotI雙酶切含狂犬病病毒糖蛋白基因的質粒pTG，Klenow補平後回收1.6kb片段，連入經EcoRV酶切並回收的線性化質粒pIRES1neo，轉化E.coliJM109，正確重組質粒命名為pIG-neo(6.8kb)；以NotI和XbaI雙酶切pIG-neo，Klenow補平，回收5.4kb片段，並以T4 DNA連接酶自連，轉化E.coli JM109，鑑定獲得去除IVS、IRES、neo等元件的表達質粒pIG-neoΔ(5.0kb)。以NruI和XhoI雙酶切質粒pIG-neoΔ，Klenow補平後回收2.5kb片段並與上一步驟回收的6.76kb片段連接，轉化E.coli JM109，獲得正向重組質粒pVAX-E3-G(9.3kb)。
核蛋白(N)等狂犬病病毒結構蛋白以同樣的步驟和不同的限制性內切酶分別重組到E3區內，獲得正向的重組質粒。
實施例3狂犬病病毒糖/核等結構蛋白-CAV-2重組基因組的構建和重組病毒的包裝重組質粒pVAX-E3-G或pVAX-E3-N等和pPolyII-CAV-2分別以NruI和SalI雙酶切，並分別回收5.5kb和29.2kb片段，兩片段連接，轉化E.coli JM109，鑑定重組質粒，將糖/核等結構蛋白表達盒插入CAV-2 E3區的重組質粒分別命名為pPolyII-CAV-G(34.7kb)和pPolyII-CAV-N(34.5kb)等。
重組基因組轉染細胞前18h，MDCK細胞傳代入50ml細胞培養瓶，以無抗生素培養基培養。
重組基因組pPolyII-CAV-G或pPolyII-CAV-N(34.5kb)等6μg，以AscI和ClaI雙酶切，酶切產物經等體積氯仿抽提後，2倍體積乙醇沉澱，沉澱物溶於500μl DMEM培養基；另取20μl脂質體Lipofectamine(Invitrogen)，溶於500μl DMEM培養基；DNA溶液與脂質體溶液混合，室溫感作20min後，加入前1日傳代的MDCK細胞瓶內，6h後棄去細胞上清，換新鮮培養基。隔日傳代，直至細胞出現聚集、變圓、呈葡萄串樣改變。細胞及培養上清凍融3次後收集分裝。電鏡觀察，有大量典型的腺病毒粒子。
實施例4狂犬病病毒糖/核等結構蛋白-犬2型腺病毒重組病毒的鑑定1.重組病毒的基因組鑑定取50ml培養瓶內已呈葡萄串狀病變的單層MDCK細胞，傾棄培養基，以PBS洗滌2次，加入800μl新鮮配製的細胞裂解液(0.6％SDS，10mM EDTA，100μg/ml蛋白酶K)，37℃溫育1小時，加入200μl 5M NaCl，輕柔混勻後，冰水浴1小時。將全部混合物移入離心管，於4℃，12000rpm離心40min，上清移入另管，以等體積酚∶氯仿抽提2次，加入終濃度0.25M醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10min，DNA沉澱以70％乙醇洗滌1次，無菌風乾後，溶於50μl去離子水。DNA完全溶解後，取1μg於20μl體系內，分別以HindIII、XhoI和SacI進行酶切，鑑定外源基因及其表達盒的插入大小、方向等。
2.TCID50測定將1×107MDCK細胞傳入96孔細胞培養板，每孔內細胞約1×105，補加培養基至100μl。次日，接入待測病毒樣品。在1-11孔內，進行10-1，10-2→10-11稀釋，A-H列同濃度重複。7天後，以Karber法計算待測重組病毒的TCID50。
3.蛋白表達鑑定(Western blotting)取含犬2型腺病毒、糖/核等結構蛋白-犬2型腺病毒重組病毒及狂犬病病毒SRV9株的細胞裂解液各50μl，加等量2×SDS-PAGE上樣緩衝液，沸水浴10min，冷卻至室溫，短時離心後進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣品電轉移到硝酸纖維素膜上，先後與兔抗狂犬病病毒多抗、HRP標記羊抗兔二抗反應，最後以DAB/H2O2顯色，根據顯色帶出現與否及其位置判定糖/核等結構蛋白-犬2型腺病毒重組病毒是否表達狂犬病病毒糖蛋白或核蛋白。
4.毒力鑑定取4-5月齡犬腺病毒和狂犬病病毒抗體陰性犬40條，分8組，每組5條，分別肌肉注射含有106TCID50和107TCID50的狂犬病病毒糖/核結構蛋白-重組腺病毒細胞培養液。注射後，觀察注射犬的飲食、精神等表現、測量體溫、計數白細胞數量和其它臨床表現等，並在4周後各取5條106TCID50和107TCID50注射犬解剖，觀察大體病理變化，並進行肝等組織切片進行觀察。
5.穩定性鑑定1×106MDCK細胞連續傳入25cm2細胞培養瓶內，每次細胞長滿後接種，按培養瓶內培養基體積的0.5％接入重組病毒，接種後3-4天收毒，連續傳代40次，標記並保存每次的培養液，同時每隔5代，提取感染細胞中的腺病毒基因組，分別以HindIII、XhoI和SacI進行酶切，鑑定外源基因及其表達盒的大小、方向並進行DNA測序等。
結果1.重組病毒基因組內正確插入了糖/核等結構蛋白的完整表達盒，且該表達盒處在部分缺失的E3區內，啟動子方向與病毒基因組轉錄方向一致；2.0.1ml狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重組病毒的TCID50為10-5.6-10-6.8；0.1ml狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重組病毒的TCID50為10-6.0-10-7.0；3.犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重組病毒表達了狂犬病病毒糖蛋白，其分子量約66kD，狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重組病毒表達了狂犬病病毒核蛋白，其分子量約55kD，與狂犬病病毒SRV9株相應蛋白的分子量一致；4.毒力檢測結果顯示，注射犬未出現飲食和精神表現等異常，體溫在正常範圍內(37.5℃-39.0℃)波動變化。體內白細胞計數顯示，白細胞總數(7.5-16.0×109/L)分類計數均在正常範圍之內，注射犬未出現藍眼或厭食等臨床表現。
解剖未見主要組織器官出現異常變化，重組病毒注射犬肝和腎組織切片與對照犬的組織切片無明顯區別。
5.穩定性鑑定結果表明，重組病毒經過40次傳代，重組病毒的基因組，包括糖/核等結構蛋白的表達盒大小和方向均保持不變，糖/核等結構蛋白DNA序列均未發生改變。
實施例5狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重組疫苗的免疫效果實驗動物未經免疫接種的4-5月齡幼犬40條，隨機分為2組，每組20條；動物免疫分別以TCID50為10-6.0的CAV-2弱毒疫苗及狂犬病病毒糖蛋白重組CAV-2疫苗對甲乙組免疫，劑量均為每條0.5ml，後肢內側皮下注射。
免疫檢測免疫前及免疫後第7d、14d、21d、28d、35d和42d分別採少量靜脈血，分離血清，以間接ELISA法檢測被免疫犬的糖蛋白抗體產生水平，即以純化狂犬病病毒SRV9株包被反應板，以50倍稀釋的待檢血清與之反應，再以辣根過氧化物酶標記的抗犬IgG與血清抗體結合，最後鄰苯二胺(OPD)/H2O2為顯色劑進行顯色反應，測定490nm處的紫外吸收值，以評價和比較受試犬體內抗體水平的變化。
強毒攻擊試驗免疫後6周的甲組犬，隨機分為甲A、甲B兩組，乙組犬，隨機分為乙A、乙B兩組，每小組10條犬。甲A、乙A兩組以CAV-2及CAV-1強毒混合物接種；甲B、乙B兩組以狂犬病病毒強毒株接種。各犬接種劑量均為100 LD50。隔離觀察各犬至接種後40d，詳細記錄各小組犬的發病及死亡情況。
結果1.所有犬只，免疫前血清內檢不出抗CAV-2及抗狂犬病病毒的特異性抗體；2.所有犬免疫後21d，其血清中皆可檢出抗CAV-2抗體，至第42d，抗體仍維持在較高水平；3.乙組犬免疫後21d，其血清中還可檢出抗狂犬病病毒糖蛋白的抗體，抗體消長規律與抗CAV-2抗體相當；4.甲A乙A兩組被免疫犬皆能抵抗CAV-2和CAV-1強毒攻擊，存活率為95％(19/20)；5.甲B小組不能抵抗狂犬病病毒強毒攻擊，存活率為0(0/10)，乙B小組能抵抗狂犬病病毒強毒攻擊，存活率為90％(9/10)。
結論狂犬病病毒糖蛋白重組犬2型腺病毒疫苗可誘發機體產生針對犬腺病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護作用。
實施例6狂犬病病毒糖蛋白主要抗原區-犬2型腺病毒重組疫苗免疫犬試驗實驗動物未經免疫接種的4-5月齡幼犬40條，隨機分為2組，每組20條；動物免疫分別以TCID50為10-6.0的CAV-2弱毒疫苗及狂犬病病毒糖蛋白主要抗原區重組CAV-2疫苗對甲、乙組免疫，劑量均為每條0.5ml，頸部皮下注射。
免疫檢測免疫前及免疫後第7d、14d、21d、28d、35d和42d分別採少量靜脈血，分離血清，以間接ELISA法檢測被免疫犬針對糖蛋白主要抗原區的抗體產生水平。首先以純化狂犬病病毒SRV9株包被酶聯板，然後加入50倍稀釋的待檢血清，感作、洗滌後，以辣根過氧化物酶標記的抗犬IgG與之反應，最後以鄰苯二胺(OPD)/H2O2進行顯色反應，測定490nm OD值，以評價並比較免疫前後和不同組間受試犬的抗體水平。
強毒攻擊試驗免疫後6周的甲組犬，隨機分為甲A、甲B兩組，乙組犬隨機分為乙A、乙B兩組，每組10條犬。甲A、乙A兩組以CAV-2及CAV-1混合強毒肌肉注射；甲B、乙B兩組以狂犬病病毒強毒CVS株注射，注射劑量均為100 LD50。隔離觀察40d，詳細記錄各組犬的發病及死亡情況。
結果1.所有犬只，免疫前血清內檢不出抗CAV-2及抗狂犬病病毒的特異性抗體；2.所有犬免疫兩周後，血清中均可檢出很高水平的抗CAV-2抗體，至第42d，抗體仍維持在較高水平；3.乙組犬免疫兩周後，血清中除了可以檢出抗CAV-2抗體以外，還可檢出較高水平的抗狂犬病病毒抗體，抗體消長規律與抗CAV-2抗體一致；4.甲A、乙A兩組免疫犬均能抵抗CAV-2和CAV-1強毒攻擊，存活率為100％(20/20)；5.甲B組不能抵抗狂犬病病毒強毒攻擊，存活率僅為20％(2/10)，乙B組能抵抗狂犬病病毒強毒株的攻擊，存活率為90％(9/10)。
結論狂犬病病毒糖蛋白主要抗原區-犬2型腺病毒重組疫苗可誘發機體產生針對犬腺病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒強毒攻擊具有保護作用。
實施例7狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重組疫苗免疫犬的試驗實驗動物未經免疫接種的4-5月齡幼犬40條，隨機分為2組，每組20條；動物免疫分別以TCID50為10-6.0的CAV-2弱毒疫苗及狂犬病病毒核蛋白-CAV-2重組疫苗對甲、乙組進行免疫，劑量均為每條0.5ml，頸部皮下注射。
免疫檢測免疫前及免疫後第7d、14d、21d、28d、35d和42d分別採少量靜脈抗凝血，分離白細胞並懸浮於PBS中。以螢光標記的羊抗犬CD4+和CD8+抗血清與懸浮白細胞4℃感作1h，PBS洗滌後進行FACS檢測，比較甲乙組CD4+數量與CD4+/CD8+比值的大小與相互關係，以評價狂犬病病毒核蛋白重組CAV-2疫苗免疫後受試犬細胞免疫水平的變化。
強毒攻擊試驗免疫後6周的甲組犬，隨機分為甲A、甲B兩組，乙組犬，隨機分為乙A、乙B兩組，每小組10條犬。甲A、乙A兩組以CAV-2及CAV-1強毒混合物接種；甲B、乙B兩組以狂犬病病毒強毒株接種。各犬接種劑量均為100 LD50。隔離觀察各犬至接種後40d，詳細記錄各小組犬的發病及死亡情況。
結果1.所有犬只，免疫後21d，其外周血CD4+數量及CD4+/CD8+比值較免疫前均有增加；2.乙組犬免疫後21d，其外周血CD4+數量及CD4+/CD8+比值較同時採集的甲組犬外周血增加顯著，但消長趨勢一致；4.甲A乙A兩組被免疫犬皆能抵抗CAV-2和CAV-1強毒攻擊，存活率為100％(20/20)；5.甲B小組不能抵抗狂犬病病毒強毒攻擊，存活率為0(0/10)，乙B小組能抵抗狂犬病病毒強毒攻擊，存活率為70％(7/10)。
結論狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重組疫苗可誘發機體產生針對犬腺病毒和狂犬病病毒的特異性細胞免疫，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護作用。
權利要求
1.狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，其特徵在於以犬2型腺病毒為載體，將犬2型腺病毒基因組E3區進行部分缺失後，插入外源基因或其表達盒，外源基因為狂犬病病毒的結構蛋白基因，即糖蛋白基因或核蛋白基因。
2.根據權利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，其特徵在於所述的對犬2型腺病毒基因組的改造，其具體操作是在克隆有犬2型腺病毒全基因組的質粒上進行的，該質粒可在大腸桿菌(如JM109)內高拷貝複製，能夠大量製備。即在質粒水平上對腺病毒基因進行酶切、連接等操作，改造後的全基因組又可以通過酶切從質粒上釋放下來。
3.根據權利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，其特徵在於所述的犬2型腺病毒E3區部分缺失是通過E3區內的自然酶切位點和/或人為突變的酶切位點酶切後產生的；
4.根據權利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，其特徵在於所述的重組病毒攜帶的狂犬病病毒結構蛋白表達盒由巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子指導，以狂犬病病毒糖蛋白或核蛋白為目的基因，以SV40病毒多聚A(polyA)為終止信號共同組成。
5.根據權利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，其特徵在於所述的重組病毒的獲得是以改造後的全基因組轉染犬2型腺病毒易感細胞即MDCK細胞獲得的。
全文摘要
本發明涉及一種狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的犬2型腺病毒重組疫苗，該重組疫苗是以犬2型腺病毒為載體，將犬2型腺病毒基因組E3區進行了部分缺失並克隆進了狂犬病病毒糖/核等結構蛋白的表達盒；糖/核等結構蛋白表達盒由巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子、糖/核等結構蛋白cDNA和SV40病毒多聚A(poly A)信號序列構成；重組犬2型腺病毒接種易感細胞或動物體後，可表達狂犬病病毒糖/核等結構蛋白，並可誘導機體產生針對狂犬病病毒的中和抗體或細胞免疫，對狂犬病病毒強毒株的攻擊具有保護力。因此，本發明獲得的攜帶狂犬病病毒糖/核等結構蛋白表達盒的重組犬2型腺病毒可作為預防狂犬病病毒感染的疫苗株。
文檔編號A61K48/00GK1718242SQ20041001097
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月7日 優先權日2004年7月7日
發明者張守峰, 扈榮良, 李海濤, 王永志, 袁慧君, 塗長春, 夏鹹柱 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所