一種KDM1A小分子抑制劑在抑制腫瘤細胞生長和轉移中的應用的製作方法
2023-05-02 19:19:31 2
本發明涉及腫瘤治療領域，尤其涉及一種KDM1A小分子抑制劑在抑制腫瘤細胞生長和轉移中的應用，特別是在製備抑制腫瘤細胞生長和轉移藥物中的應用。
背景技術：
肺癌是世界範圍內，增長速率最快，患者人數最多，也是死亡率最高的癌症之一。目前，常用的肺癌治療的手段主要包括：手術切除，放療和化療，靶向藥物治療，以及剛剛興起的免疫細胞治療等。儘管如此，由於早期肺癌不易被發現，大多數患者的肺癌被發現時已經是中晚期了，導致肺癌治療的效果十分有限，患者因無法控制肺癌的復發和轉移而去世。因此，深入研究肺癌細胞增殖，遷移，和轉移的分子機制，將有助於發現新的治療肺癌的藥物靶點。
表觀遺傳是調控腫瘤細胞產生，增殖和轉移的重要機制之一。表觀遺傳調控主要包括以下幾個方面：組蛋白修飾，DNA甲基化和去甲基化，非編碼RNA等。其中，很多參與組蛋白修飾的酶，包括組蛋白H3K4me2去甲基酶KDM1A,組蛋白H3K27me3甲基轉移酶EZH2等，在腫瘤細胞中表達異常升高。但其作用機制還不十分清楚，且目前尚無KDM1A小分子抑制劑在抑制腫瘤細胞生長和轉移中的應用報導。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術中的缺陷，提供一種KDM1A小分子抑制劑在製備抑制腫瘤細胞生長和轉移藥物中的應用。
本發明採用如下技術方案：
一種KDM1A小分子抑制劑在製備抑制腫瘤細胞生長和轉移藥物中的應用。
優選的，所述KDM1A小分子抑制劑為2-PCPA。
優選的，所述腫瘤細胞為癌症細胞。
優選的，所述腫瘤細胞為肺癌細胞。
優選的，所述腫瘤細胞為人NSCLC細胞系中的PC9和A549。
優選的，所述小分子抑制劑2-PCPA的細胞給藥量為2μm～20μm。
2-PCPA，全稱為Tranylcypromine hydrochloride，是不可逆的單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)抑制劑。它可以增加血清中去甲腎上腺素的活性(noradrenergic activity)和增強多巴胺的傳遞，用於鎮靜和抗抑鬱藥。此外，2-PCPA還可以抑制組蛋白去甲基酶KDM1A(又稱為：LSD1，BHC110)的活性，並抑制組蛋白H3K4me2的去甲基化(IC50＝>50μM)
本發明研究了組蛋白H3K4me2去甲基酶KDM1A在腫瘤細胞的生長和轉移中的作用機制。KDM1A主要是通過抑制TIMP3(一種基質金屬蛋白酶抑制因子)的表達，來促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。細胞外基質中的基質金屬蛋白酶MMP2在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中發揮了重要作用，而TIMP3可以抑制MMP2的活性或蛋白水平，從而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。
本發明還研究了採用KDM1A小分子抑制劑2-PCPA，可抑制細胞內KDM1A的活性，並抑制組蛋白H3K4me2的去甲基化，從而導致TIMP3表達上調，促使細胞外MMP2表達的下調，同時抑制細胞內JNK激酶活性，有效地抑制了腫瘤細胞的侵襲和轉移。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明明確闡明了小分子抑制劑2-PCPA抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，尤其是抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，並在此基礎上研究其治療肺癌的效果，填補了用表觀遺傳藥物治療肺癌領域的空白，小分子抑制劑2-PCPA可用於製備抑制肺癌細胞增殖和轉移的小分子藥物，從而提高肺癌的治療效果，延長肺癌患者的生命；
附圖說明
圖1為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞增殖能力的影響結果圖；
圖2為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞侵襲能力的影響結果圖；
圖3為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞遷移能力的影響結果圖；
圖4為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞凋亡的影響結果圖；
圖5為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對體內肺癌細胞增殖能力的影響結果圖；
圖6為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞中JNK信號通路的影響結果圖；
圖7為KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞中組蛋白修飾(H3K4me2)水平的影響結果圖；
圖8為過表達TIMP3對JNK激酶磷酸化和MMP2表達的影響結果圖；
圖9為消減TIMP3對JNK激酶磷酸化和MMP2表達的影響結果圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用於更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護範圍。以下實施例中所用方法，如無特殊說明，均為常規方法。
本發明所述的KDM1A小分子抑制劑，可抑制各類腫瘤細胞的增殖和轉移，包括血癌、骨癌、淋巴癌、腸癌、肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、食道癌等；KDM1A小分子抑制劑包括2-PCPA、環丙胺衍生物等。
以下僅舉例說明KDM1A小分子抑制劑2-PCPA對肺癌細胞的增殖和轉移影響。
1.肺癌細胞的培養、擴增和傳代；
選用人NSCLC細胞系中PC9和A549，在DMEM培養基(HyClone公司)中生長。包括H1650、H292、H1975、95D和HCC827的人NSCLC細胞系在RPMI-1640培養基(Hyclone公司)中生長。所述DMEM培養基和所述RPMI-1640培養基中均含有青黴素(100U/ml)及鏈黴素(100mg/ml)(Life Technologies公司)和10％FBS(Gibco公司)。將上述細胞在37℃、在5％CO2的潮溼氣氛中溫育。
2.小分子抑制劑2-PCPA的使用；
從Selleck公司訂購吉非替尼(#S1025)。從Enzo Life Science公司訂購Tranylcypromine(Parnate或2-PCPA)(#EI-217)。
PC9和A549細胞在6孔板進行培養，直至細胞密度達到30-40％。實驗測試組將細胞密度為30-40％的細胞用不同濃度的2-PCPA處理48小時，濃度包括0μm、2μm、4μm、10μm、15μm、20μm。採用2-PCPA處理後的細胞來製備細胞裂解物並用於Western blotting的分析。另外，採用2-PCPA處理後的細胞也將用於細胞增殖、侵襲和遷移實驗中。
3.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞增殖能力的影響；
採用2-PCPA處理後的細胞以每孔1000個細胞的密度接種到96孔板中。採用不同的條件進行處理，每個條件處理後複製6倍。在不同時間點，根據製造商的說明使用CellTiter96AQueous單溶液細胞增殖測定(MTS)(Promega公司G3580)進行MTS細胞增殖測定。可替代地，細胞數適當稀釋後進行計數。
2-PCPA對肺癌細胞增殖能力的影響結果如圖1所示，通過圖1可知2-PCPA可有效抑制肺癌細胞增殖。
4.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞侵襲能力的影響；
在24孔板(BD Biosciences公司，貨號：353504)中的每個底部具有8微米孔徑的膜(BD353097)的Transwell小室中，加入100微升稀釋(用無血清培養基進行1：8的稀釋)的Matrigel(BD Biosciences公司，貨號：356234)。採用胰蛋白酶消化貼壁的細胞，並將細胞重新懸浮於含有1％FBS的培養基中。將5×104個細胞懸浮在在100微升的培養基中，並把細胞懸液鋪在膜上的小室。膜下的小室部分加入含有20％FBS的600微升的培養基。把細胞在37℃，5％CO2的條件下培養48小時，然後，用棉籤把每個Transwell小室的膜上小室中沒有侵入的細胞除去。而對於附著在膜下表面的侵入的細胞，在含有0.1％結晶紫的甲醇中，在37℃下，染色30分鐘，隨後用1xPBS溶液洗滌兩次。染色的細胞在顯微鏡(放大倍數：100x)下進行觀察，並記錄所有遷移細胞的數目。每個實驗條件重複三次。
2-PCPA對肺癌細胞侵襲能力的影響結果如圖2所示，通過圖2可知與對照組相比，本發明所述的採用2-PCPA處理後的PC9和A549的侵襲細胞數均大幅小於對照組的侵襲細胞數，即2-PCPA可有效抑制肺癌細胞的侵襲。
5.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞遷移能力的影響；
在6孔板中培養細胞，直到細胞的密度達到80％。然後，用一個無菌的10微升的槍頭進行水平方向的劃痕。用磷酸鹽緩衝鹽水(1xPBS)輕微地洗滌細胞以去除細胞碎片。選擇每個培養皿的三個不同的區域進行類似的劃痕，並比較細胞邊界遷移的程度和距離。分別在0，24，48，和72小時對劃痕進行拍攝的，以評估和計算細胞遷移的程度。每個實驗條件重複三次。
2-PCPA對肺癌細胞遷移能力的影響結果如圖3所示，通過圖3可知與對照組相比，本發明所述的採用2-PCPA處理後的PC9和A549的細胞遷移程度均小於對照組的細胞遷移程度，即2-PCPA可有效抑制肺癌細胞的遷移。
6.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞克隆形成能力的影響；
把細胞以每個培養皿1000個細胞的密度接種到10釐米的培養皿中，連續培養12天。然後，將細胞固定在冰冷的甲醇溶劑中，並用結晶紫溶液染色。把培養皿的底部放在上面進行拍照，並對可以肉眼看見的菌落進行計數。每個實驗條件重複三次。
7.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞凋亡的影響；
細胞在冷的磷酸鹽緩衝鹽水(1xPBS)洗滌兩次。然後，再懸浮在1×結合緩衝液中，每毫升含有1×106細胞，將100微升的細胞懸浮液與5微升的FITC和使用FITC膜聯蛋白V凋亡檢測試劑盒5微升的PI(BD556547)中混合，根據製造商的說明。使用Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences公司，美國)染色的細胞進行分析。
2-PCPA對肺癌細胞凋亡的影響結果如圖4所示，通過圖4可知2-PCPA對肺癌細胞凋亡基本無影響。
8.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞周期的影響；
將細胞離心，用PBS洗滌兩次，並在4℃下用冷的70％乙醇溫育過夜。細胞根據製造商的說明用PI-RNA酶染色緩衝液(BD Pharmingen公司，#550825)混合。使用BD Accuri C6流式細胞染色的細胞進行分析。結果採用的FlowJo7.6.1軟體繪製。
9.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對體內肺癌細胞增殖能力的影響；
將懸浮在100微升1xPBS溶液中的2×106個肺癌細胞皮下注射到5周大的裸鼠的右側腋窩區域。然後，每隔5至7天測定腫瘤大小，使用數字儀測量，並基於此公式計算腫瘤組織的體積(V)：V＝0.5*A*B2，其中A＝長徑和B＝短徑。5周後，將異體移植的腫瘤組織進行分離，拍照，並存儲在液氮中。
2-PCPA對體內肺癌細胞增殖能力的影響結果如圖5所示，通過圖5可知，對照組腫瘤的體積變化及重量變化幅度均大於實驗組，從圖5也可看出對照組腫瘤的體積明顯大於實驗組，即2-PCPA能夠較好地抑制體內肺癌細胞的增殖。
10.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞中JNK信號通路的影響；
開展Western blotting檢測2-PCPA對肺癌細胞中磷酸化JNK激酶的表達水平。2-PCPA對肺癌細胞中JNK信號通路的影響結果如圖6所示，由圖6可知，2-PCPA可抑制細胞內JNK激酶活性。
11.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞中MMP2表達的影響；
開展Western blotting檢測2-PCPA對肺癌細胞中MMP2的表達水平。由檢測結果可得2-PCPA可使肺癌細胞中外的MMP2表達下調。
12.檢測KDM1A小分子抑制劑(2-PCPA)對肺癌細胞中H3K4me2水平的影響；
開展Western blotting檢測2-PCPA對肺癌細胞中H3K4me2的表達水平的影響。2-PCPA對肺癌細胞中H3K4me2水平的影響結果如圖7所示，由圖7可知2-PCPA可使肺癌細胞中KDM1A的表達水平降低，TIMP3的表達水平升高，而組蛋白修飾H3K4me2的水平升高。
13.檢測過表達TIMP3對JNK激酶磷酸化和MMP2表達的影響；
開展Western blotting檢測過表達TIMP3對肺癌細胞中JNK激酶磷酸化和MMP2的表達水平的影響。其結果如圖8所示，由圖8可知過表達TIMP3可使肺癌細胞中JNK激酶磷酸化減弱，細胞外的MMP2表達下調。
14.檢測消減TIMP3對JNK激酶磷酸化和MMP2表達的影響
開展Western blotting檢測消減TIMP3對肺癌細胞中JNK激酶磷酸化和MMP2的表達水平的影響。其結果如圖9所示，由圖9可知消減TIMP3可使肺癌細胞中JNK激酶磷酸化升高，細胞外的MMP2表達增強。
由上述實施例可知，KDM1A的小分子抑制劑2-PCPA，可抑制細胞內KDM1A的活性，並抑制組蛋白H3K4me2的去甲基化，從而導致TIMP3表達上調，促使細胞外MMP2表達的下調，同時抑制細胞內JNK激酶活性，有效地抑制了肺癌細胞的侵襲和轉移，填補了用表觀遺傳藥物治療肺癌領域的空白，同時也為其他腫瘤細胞的治療提供依據。
以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對該實用進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。