用於防止組織樣品中偽像的方法和組合物的製作方法

2023-05-02 17:39:16

專利名稱：用於防止組織樣品中偽像的方法和組合物的製作方法
用於防止組織樣品中偽像的方法和組合物背景1.領域本申請總體地涉及用於固定的組織樣品的方法和組合物。更具體地，本申請涉及用於防止偽像，改善已經使用醛系固定劑保存的組織樣品中的染色，和增加組織染劑的可用使用壽命的方法和組合物。2.背景組織樣品可以包括一種或多種細胞、組織、器官、或其他獲自生物體的材料，以及整個生物體或其一部分。所述組織樣品可以有效用於研究和醫學、組織學、病理學、細胞生物學、和一般的生物科學的實踐。例如，組織樣品可以有助於疾病、病症、功能、結構的研究、 和生物樣本的其他特性。儘管組織樣品可以以許多方式獲得，包括來自屍體剖檢、活組織檢查、手術、屍檢等，一旦獲得，樣品通常經歷蛋白水解酶和其他傾向於分解和降解生物材料的過程。為了保存組織樣品結構或形態學，以及為了保持蛋白穩定性，組織樣品經常通過稱為固定的過程來保存。固定是化學過程，其可以通過終止正在進行的生物反應來防止樣品腐爛。存在許多固定方法以及試劑。例如，組織樣品可以使用交聯固定劑，諸如醛系固定劑來固定。認為醛系、交聯固定劑可以與組織樣品中的蛋白和其他分子反應形成亞甲基橋鍵。亞甲基橋鍵可以生成化學鍵的網絡，所述化學鍵可以防止大分子，諸如蛋白的運動，並基本保持組織樣品的物理結構。固定後，可以防止破壞性酶進一步降解組織樣品。儘管固定可以容許組織樣品在獲得後長時間和否則將發生樣品自然降解的時間段內進行研究，但固定並非沒有缺點。例如，一些醛系固定劑可以導致或增加染色的組織樣品中的視覺偽像。在此類偽像的一個罕見實例中，在固定的組織樣品中的酸性條件下，可由醛系固定劑形成色素。例如，在甲醛固定劑中，可以形成酸性甲醛氧化蘇木精，或甲醛色素。 甲醛色素和來自其他醛系固定劑的色素可以在固定的樣品中形成呈褐色的有色色素沉積物。這樣的色素沉積物不僅可以分散注意力並且還阻止精確的組織樣品分析。在與醛系固定劑相關的偽像的另一個更常見的實例中，一些醛系固定劑可以導致細胞或細胞結構皺縮。例如，使用醛系固定劑，諸如10%福馬林磷酸緩衝液處理的細胞可以在固定後皺縮約15%。該皺縮可以使細胞和細胞結構變形並且，由此，改變細胞形態學。而且，該細胞皺縮還可以引起擴散屏障，該屏障阻止或削弱組織染劑或醛系固定劑適當地進入、染色、或固定樣品的各部分。在與醛系固定劑相關的潛在偽像的另一個實例中，在使用醛系固定劑固定過程中形成的亞甲基橋鍵網絡可以降低免疫反應性，或阻止樣品中分子和用於分析的分子之間所需的相互作用。例如，與醛系固定劑相關的亞甲基橋鍵可以在染色過程中阻止抗體分子穿透樣品和到達目的抗原。因此，可能由於物理障礙阻止抗原的適當視覺化，即使抗原的表位可能沒有被化學修飾。類似地，在使用醛系固定劑固定過程中形成的亞甲基橋鍵可以阻止一些組織染劑與樣品適當的結合。例如，在固定過程中形成的亞甲基橋鍵可以結合與一些組織染劑相同的位點，並由此減少染劑結合併阻止合適的視覺化。
在不受理論限制的條件下，認為已經使用醛系固定劑固定的組織樣品的長時間染色可能複製上述的一些傳統醛系偽像。如所提及地，一些染劑，諸如蘇木精和伊紅，可以與醛系固定劑競爭組織樣品中的結合位點。因此，使用該染劑的長時間染色可以導致一些醛系固定劑由樣品釋放至溶液中。一旦在溶液中，游離的醛系固定劑可以再次結合樣品並導致另外的偽像。這些偽像可以限制組織染色和可視化程序的有效性。因此，開發用於防止使用醛系固定劑製備的組織樣品中的偽像和改善其中的染色的方法和組合物將是本領域中的改進。簡述本發明提供用於防止已經使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的新方法和組合物。一般地，所述方法可以包括使用醛系固定劑，諸如福馬林固定試劑固定組織樣品。醛系固定劑可以導致與組織樣品中的極性胺基酸和類似殘基形成亞甲基橋鍵。隨著時間的過去和在存在水的條件下，認為這些亞甲基橋鍵中的一些可以天然地發生逆轉並將醛系固定劑釋放至溶液中。在不受理論限制的條件下，認為組織樣品中游離的醛系固定劑分子的存在可以與組織染劑反應或幹擾組織染劑。本發明的範圍包括使固定的組織樣品與防止或抑制偽像形成的組合物相接觸。 該防止偽像的組合物可以包括以下列的方式與組織樣品中的游離醛系固定劑分子結合或否則反應的任何化合物，所述方式是防止游離醛系固定劑形成偽像。例如，防止偽像的組合物可以包括一種或多種胺基酸、聚胺和/或在與醛系固定劑反應時形成席夫鹼Gchiff base)的化合物。合適的胺基酸的一些非限制性實例可以包括精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，組氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，和色氨酸殘基。合適的聚胺的一些非限制性實例包括由超過一個單元的單一類型氨基組成的聚合物(「均聚物」)和包含超過一種類型的氨基的聚合物(「雜聚物」)。因此，合適的聚胺的非限制性實例包括化學品或聚合物，其包括聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚組氨酸，聚賴氨酸，腐胺，和聚乙烯亞胺，和/或帶正電胺基酸的均聚物或雜聚物。在無約束力的理論下，認為聚胺和/或胺基酸與已經由組織釋放的醛系固定劑結合或否則反應，並可以，由此，防止或阻止固定劑結合組織和/或染劑而產生偽像。在類似的無約束力的理論下，認為添加一種或多種形成席夫鹼的化合物容許組織中的一部分，如果不是全部，游離固定劑通過被形成席夫鹼的化合物捕獲和/或與形成席夫鹼的化合物反應而形成席夫鹼，並由此防止或阻止游離醛系固定劑與組織樣品反應而形成偽像。在一些情形中，游離固定劑、聚胺、和/或形成席夫鹼的化合物之間的反應在熱力學方面是有利的。因此，添加一種或多種胺基酸、聚胺、和/或形成席夫鹼的化合物可以有效地防止組織樣品中的游離醛系固定劑形成新的或另外的偽像。固定的組織樣品可以在任意時刻與防止偽像的組合物相接觸。例如，固定的組織樣品可以在組織樣品與組織染劑溶液相接觸之前、之後、或同時與防止偽像的組合物接觸。 類似地，防止偽像的組合物可以單獨地或與含有一種或多種組織染劑的溶液組合地與固定的組織樣品合併。然而，在一些實施方案中，防止偽像的組合物和組織染劑合併在一起，隨後它們與組織樣品同時相接觸。事實上，因為防止偽像的組合物可以意外地增加組織染劑的有用保存期，所以將組織染劑和防止偽像的組合物在溶液中混合在一起之後再將一部分該溶液與組織樣品合併會是有益的。
附圖簡述以下說明可以根據若干附圖更好地理解，其中

圖1包含蘇木精和伊紅染色的骨髓樣品的照片，所述樣品未經使用防止偽像的組合物處理；圖2包含蘇木精和伊紅染色的骨髓樣品的照片，所述樣品已經使用防止偽像的組合物的代表性實施方案處理；圖3包含蘇木精和伊紅染色的人輸卵管組織樣品的照片，所述樣品未經使用防止偽像的組合物處理；圖4包含蘇木精和伊紅染色的人輸卵管組織樣品的照片，所述樣品已經使用防止偽像的組合物處理；圖5包含蘇木精和伊紅染色的人子宮內膜組織樣品的照片，所述樣品未經使用防止偽像的組合物處理；和圖6包含蘇木精和伊紅染色的人子宮內膜組織樣品的照片，所述樣品已經使用防止偽像的組合物處理。所述附圖與下列說明一起，可以有助於證明和解釋所述方法和組合物的原理。詳述可以參照下列的說明來理解所述發明的目前優選的實施方案。應該理解所述方法和組合物，如本文中一般公開地，可以以廣泛多樣的方式排列和設計。因此，本發明的實施方案的下列更詳細的描述不意欲限制本發明所要求保護的範圍，而僅代表本發明的目前優選的實施方案。本申請一般地公開用於減少、逆轉、阻止或否則防止固定的組織樣品中的偽像的方法和組合物。更具體地，本申請公開了利用防止偽像的組合物來防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像和改善其中的染色。為了更好地解釋所述的方法和組合物，本申請首先討論了醛系固定並然後討論了通過使樣品與防止偽像的組合物相接觸來防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像。如所提及地，醛系固定劑可以用於化學地保存組織樣品。而且，已知的或新型的多種醛系固定劑可以用作所述固定劑。合適的醛系固定劑的一些實例包括甲醛，戊二醛，多聚甲醛，等。然而，為了更好地解釋防止偽像的組合物的應用，本申請討論了一些非限制性實施方案，其中防止偽像的組合物用於已經使用甲醛固定的組織樣品中。儘管在使用防止偽像的組合物處理前可以使用其他已知的或新型的甲醛溶液來固定組織樣品，但是甲醛經常基於通常稱為福馬林的標準化甲醛水溶液來描述和使用。 甲醛，在室溫和1大氣壓下，是氣體。然而，甲醛通常作為水溶液來銷售。所使用的最常見水性濃度是37重量％ (40體積％ )溶液。該溶液包含37克甲醛氣體，至100克溶液中。 當單獨保持在水中時，甲醛傾向於聚合。為了抑制甲醛溶液的聚合，加入甲醇直至約10體積％ -約15體積％的濃度。術語「福馬林」指定為這樣的溶液，即在水中的約37重量％ 甲醛氣體，通常具有約10體積％ -約15體積％甲醇。常用的甲醛固定試劑可以包括約10% 福馬林。因此，固定劑(或含有處於適合於組織樣品固定的濃度的固定劑或其他所需物質的溶液)，即約10%福馬林可以包含約3. 7重量％ -約4重量％甲醛。在福馬林作為固定劑使用時，不同類型的福馬林或包含福馬林的固定試劑可以應用於組織樣品。例如，組織樣品可以使用常規鋅-福馬林固定試劑、福馬林-乙酸固定試劑、或福馬林-醇固定試劑來固定。如本領域中已知地，所用的福馬林的形式可以取決於被固定的組織樣品的類型以及固定的樣品所需要的用途。合適濃度的固定劑可以用於固定試劑中，以化學保存組織樣品。事實上，固定試劑中的固定劑的濃度可以取決於所需的應用。例如，如所述，常規福馬林固定試劑可以具有約3. 7重量％ -約4重量％甲醛的濃度。在另一個實例中，固定試劑具有約0. 2重量％ -約 6重量％甲醛的濃度。然而，在目前優選的實例中，固定試劑具有約0.2重量約2重量％ 甲醛的濃度。在一個非限制性實例中，福馬林固定試劑具有約500毫滲摩爾-約2，000 毫滲摩爾的克分子滲透壓濃度和優選約500毫滲摩爾-約1，200毫滲摩爾的克分子滲透壓濃度。然而，本公開內容的教導可以關於不同合適濃度的不同固定劑來使用。醛系固定試劑，諸如福馬林固定試劑，可以另外包含適合於固定試劑的所需應用的任何其他物質。例如，固定試劑可以包含溶劑(例如，二甲基亞碸(「DMS0」)和水)、 去汙劑、醇、緩衝液(例如，磷酸鹽緩衝液)、聚合物等。另外，醛系固定試劑可以包括可以起核酸，諸如DNA或RNA的穩定劑作用的任何物質。固定試劑，諸如含有福馬林和其他所需物質的固定試劑，可以以任何合適的方式應用於組織樣品中。例如，組織樣品可以浸沒於固定試劑中，用固定試劑灌注，用固定試劑噴灑，用固定試劑燻蒸，或否則與固定試劑接觸。在一個實例中，組織樣品可以完全浸沒於固定試劑中一段任何需要的時間量。然而，在另一個實例中，固定試劑可以注射至生物體，如斑馬魚(Danio rerio)的心臟中，注射體積與生物體心輸出量相匹配。在該實例中， 固定試劑可以然後灌注整個生物體。此外，可以遵從用於組織樣品固定的任何所需方法或方案。固定方法的實例參見 2007年12月10日提交的美國實用新型專利申請號11/953，670，其標題為製備用於顯微鏡分析的樣本的組合物和方法；將其全部內容通常引用結合於此。用於使用醛系固定劑，諸如福馬林固定試劑固定組織樣品的方案可以包括有助於固定組織樣品的任何步驟或程序。例如，組織樣品可以以多種方法來漂洗或洗滌。另外， 方案可以需要將組織樣品浸沒在固定試劑中一段合適的時間量。在一個非限制性實例中， 方案可以需要組織樣品浸沒在固定試劑中短至約30分鐘或長至約72小時以上，其取決於樣品尺寸、類型、試劑溫度等。固定方案還可以包括加熱或冷卻樣品。方案還可以需要樣品通過一系列浴液(baths)脫水，所述一系列浴液可以逐漸增加醇濃度。而且，固定方案還可以包括將樣品包埋在石蠟中或甚至應用第二固定劑。事實上，技術人員應該認識到固定方案可以包括許多另外的程序。此外，技術人員應該認識到已經使用醛系固定劑固定的組織樣品可以以任何合適的方式來處理。例如，組織樣品可以冷凍，由低溫恆溫器切片，冷卻，保存，染色等。如前所述，一旦組織樣品已經使用醛系固定劑固定，則與固定相關的偽像可以通過使組織樣品與防止偽像的組合物相接觸來防止，如本文中所述。防止偽像的組合物基於這樣的無約束力理論，即醛系固定劑與組織樣品中的極性胺基酸和類似殘基結合併與其形成亞甲基橋鍵。亞甲基橋鍵可以由亞甲醇或席夫鹼中間物形成。亞甲醇或席夫鹼中間物可以在醛系固定劑(例如，甲醛)與胺基酸殘基的N端或與賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸、和組氨酸殘基上存在的氨基和/或硫醇基反應時產生。亞甲醇和席夫鹼中間物可以然後與精氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、色氨酸、胞嘧啶、和/或酪氨酸殘基反應形成亞甲基橋鍵。(為了更完全討論通過甲醛和合成肽中的極性胺基酸和類似殘基反應形成亞甲基橋鍵，參見 Bernard Metz 等，Identification of Formaldehyde-induced Modifications in Proteins =Reactionswith Model Peptides (鑑定蛋白中甲酸誘導的修飾與模型肽反應)，279J. BIOL. CHEM.(生物化學)，6235-43 (2004年2月20日))。而且，在醛系固定過程中形成亞甲基橋鍵的化學反應可以具有天然逆轉到一定程度的趨勢。例如，當已經使用醛系固定劑固定的樣品，即使以痕量暴露於水中，固定劑和組織之間的一些亞甲基橋鍵可以逆轉並且一些量的固定劑可以釋放至溶液中。經過一段時期，亞甲基橋鍵的逐漸逆轉以釋放醛系固定劑可以促進固定和染色的樣品中一些偽像的形成。在不受理論約束下，目前認為醛系固定劑可以通過使組織樣品與防止偽像的組合物接觸而被阻止或防止形成偽像，所述防止偽像的組合物包括一種或多種以這樣的方式與醛系固定劑競爭和/或反應的化合物，所述方式是為釋放的或游離的固定劑提供備選的結合或反應機會。另外，如果所述化合物呈現比組織樣品中的極性胺基酸或類似殘基更有利的結合條件，則由固定劑形成亞甲基橋鍵可以在熱力學上以有利於這些另外的化合物的方式被驅動。所述化合物可以包括以這樣的方式與醛系固定劑反應的任何化學品，所述方式是防止固定劑在組織樣品中形成偽像。與醛系固定劑結合、競爭、和/或否則反應的防止偽像的組合物中的化合物的一些實例可以包括一種或多種胺基酸、聚胺、和/或在與醛系固定劑反應時形成席夫鹼的化合物。在一些實施方案中，防止偽像的組合物包括一種或多種游離胺基酸，或不彼此結合形成聚合物的胺基酸。在這樣的實施方案中，組合物可以包括任何合適的胺基酸，所述合適的胺基酸能夠對游離醛系固定劑提供備選的結合或反應位點，或否則能夠防止與醛系固定劑相關的偽像。所述游離胺基酸的一些非限制性實例包括游離的賴氨酸、精氨酸、酪氨酸殘基、組氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、和色氨酸殘基。事實上，在一些實施方案中，精氨酸、酪氨酸，和在更小的程度上，組氨酸、天冬醯胺，穀氨醯胺，和色氨酸殘基可以與由甘氨酸和甲醛形成的席夫鹼加合物反應，從而進一步防止固定劑偽像。在一些實施方案中，防止偽像的組合物包括一種或多種聚胺。事實上，所述組合物可以包括任何聚胺，所述聚胺可以結合醛系固定劑(例如，甲醛)，可以對游離的醛系固定劑提供備選的結合或反應位點，或可以以其他方式防止與醛系固定劑相關的偽像。防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的聚胺的一些非限制性實例可以包括均聚物(例如，含單一氨基的單體的有機聚合物)或雜聚物(例如，含混合氨基的單體的有機聚合物)。 均聚物的一些非限制性實例可以包括由聚賴氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亞胺、聚色氨酸、腐胺、 屍胺、亞精胺、精胺、或任何其他合適的由單一氨基構成的天然或合成聚合物組成。類似地， 雜聚物的一些非限制性實例包括這樣的聚合物，所述聚合物包含賴氨酸、聚賴氨酸、精氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亞胺、聚色氨酸、腐胺、屍胺、亞精胺、精胺、和/或任何其他合適的天然或合成氨基，以任何合適的組合方式的組合。在防止偽像的組合物包括聚胺時，所述聚胺可以具有這樣的任何特性，即容許其防止游離醛系固定劑導致組織樣品中產生偽像。例如，防止偽像的組合物可以包括任何長度的聚胺，所述長度容許聚胺與溶液中的醛系固定劑結合或以其他的方式反應。通過舉例說明，合適的聚胺可以包括容許聚胺與游離醛系固定劑結合或否則反應的任何數量的胺基酸單體或殘基。例如，合適的聚賴氨酸或聚精氨酸可以分別包含約2-約1，500個賴氨酸或精氨酸殘基。另外，防止偽像的組合物可以包含任何分子量的聚胺，所述分子量適合於容許聚胺與醛系固定劑結合。在一個非限制性實例中，組合物包含分子量大於約20，000統一原子質量單位的聚胺。然而，在另一個實例中，組合物包含分子量小於約20，000統一原子質量單位的聚胺。在再一個實例中，組合物包括分子量在約4，000-約15，000之間的統一原子質量單位的聚胺。雖然一些胺基酸和聚胺在與醛系固定劑反應時可以形成席夫鹼，但是在一些實施方案中，防止偽像的組合物包含一種或多種另外的在與醛系固定劑反應時形成席夫鹼的化合物。提出這樣的理論，即包含所述形成席夫鹼的化合物的組合物可以以防止不需要的偽像的方式與組織樣品中的游離固定劑競爭或為其提供備選的結合和反應機會。雖然所述組合物可以包含任何在與醛系固定劑反應時形成席夫鹼的化合物，但是合適的形成席夫鹼的化合物的一些非限制性實例可以包括甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亞胺；包含甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、聚乙烯亞胺的肽；和/或在與醛系固定劑反應時形成席夫鹼的任何其他天然或合成的化合物。形成席夫鹼的化合物的一些另外的非限制性實例可以包括在與甲醛反應時形成席夫鹼的任何其他胺基酸。當防止偽像的組合物包括包含形成席夫鹼的化合物(例如，甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，和/或聚乙烯亞胺)的肽時，所述肽可以是天然的(例如，蛋白或其一部分)或合成的。另外，包含形成席夫鹼的化合物的肽可以是僅包含單一類型的形成席夫鹼的化合物的均肽(homop印tide)和/或所述肽可以是包含超過一種類型的形成席夫鹼的化合物的雜肽 (heteropeptide)。在另一個實例中，所述肽中的氨基可以處於適合於防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的任何組合中。在再一個實例中，所述肽可以是任意長度。例如， 所述肽可以短至約2個胺基酸或長至約2，000個胺基酸以上。然而，在一些實例中，所述肽長度範圍是約5-約200個胺基酸。在其他實例中，所述肽長度範圍是約10-約50個胺基酸。在再一個實例中，所述組合物包含多個不同長度的肽。防止偽像的組合物可以包括與游離醛系固定劑結合或反應從而防止已經使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的化學品或化合物的任意組合。事實上，在一些實施方案中，所述組合物包含一種或多種類型的聚胺。例如，所述組合物可以包含聚賴氨酸，聚精氨酸，或二者。然而，在其他實施方案中，所述組合物包含一種或多種形成席夫鹼的化合物。 例如，所述組合物可以包含甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亞胺；和/或包含甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，和/或聚乙烯亞胺的肽。在一些優選的實施方案中，所述組合物包含至少一種聚胺和至少一種形成席夫鹼的化合物。在這樣的實施方案中，所述組合物可以包含任何合適數量的聚胺和形成席夫鹼的化合物或它們的任何合適組合。在一個實例中，所述組合物包含聚賴氨酸、聚精氨酸、天冬醯胺、甘氨酸、和聚乙烯亞胺中的兩種或更多種的混合物。在另一個實例中，所述組合物包含聚賴氨酸和甘氨酸。在再一個實例中，所述組合物包含聚精氨酸和甘氨酸。防止偽像的組合物中的多種化合物也可以具有容許它們防止已經使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的任何特性。例如，所述化合物(例如，一種或多種聚胺和/或形成席夫鹼的化合物)可以具有多種不同官能團、殘基數目、分子量、化學亞群，等。防止偽像的組合物還可以包含容許所述組合物防止已經使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的任何其他元素或化學品。例如，所述組合物可以包含水和/或一種或多種緩衝液、醇、溶劑(例如，水或DMSO)、pH調節劑、去汙劑、組織染劑、等。防止偽像的組合物的終溶液或用於處理固定的組織樣品的組合物的終溶液中的化合物可以具有容許該組合物防止已經使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的任何濃度或濃度組合。例如，所述組合物的終溶液可以包含任何合適濃度的聚胺。在其中所述組合物包含一種或多種聚胺的一些實施方案中，所述組合物的終溶液中的一種或多種聚胺的濃度是約2重量％ -約IX 10,重量％。在其他實施方案中，所述組合物的終溶液中的各聚胺的濃度是約1X10_4重量％ -約1X10_8重量％。在其他實施方案中，所述組合物的終溶液中的各聚胺的濃度是約IX 10_6重量％ -約8. 3X IO-7重量％。例如，儘管防止偽像的組合物的終溶液可以包含不同濃度的不同聚胺，在一些情形中，所述終溶液包含終濃度為約3. 3 X ΙΟ"7重量％的聚胺(例如，聚賴氨酸和聚精氨酸)。在另一個實例中，防止偽像的組合物的終溶液可以包含任何合適濃度的形成席夫鹼的化合物。在其中所述組合物包含一種或多種形成席夫鹼的化合物的一些實施方案中， 所述終溶液中的一種或多種形成席夫鹼的化合物的濃度是約1X10_2重量％ -約1X10, 重量％。在其他實施方案中，所述終溶液中各形成席夫鹼的化合物的濃度是約1X10—4重量％ -約1X10—8重量％。在其他實施方案中，所述終溶液中各形成席夫鹼的化合物的濃度是約IX 10_5重量％ -約9. 9X 10_7重量％。在一些優選的實施方案中，形成席夫鹼的化合物以約1 X IO-7重量％ -約9. 9 X IO-7重量％的濃度存在於所述終溶液中。儘管防止偽像的組合物的終溶液可以包含具有大致相同濃度的多種形成席夫鹼的化合物，但是在一些情形中，所述組合物的終溶液包含濃度為約3X 10_6重量％的一種形成席夫鹼的化合物(例如， 天冬氨酸)，濃度為約3X 10_5重量％的另一種形成席夫鹼的化合物(例如，甘氨酸)，和濃度為約3X 10_7重量％的再一種形成席夫鹼的化合物(例如，聚乙烯亞胺)。所述組合物的終溶液可以以任何合適的方式製備，所述方式是為該溶液提供足夠濃度的聚胺和/或形成席夫鹼的化合物，從而防止與醛系固定劑相關的偽像。例如，防止偽像的組合物可以以終濃度或作為濃縮的儲液來製備和分配，所述儲液可以然後稀釋形成終溶液。事實上，因為以低濃度防止偽像的組合物開始並然後增加濃度直至獲得所需的結果是有益的，所以在一些實施方案中，濃縮的儲液可以是優選的。在這樣的實施方案中，所述儲液可以具有任何合適濃度的醛反應性化合物。另外，多種醛反應性化合物的濃度可以逐個樣品而變化，其取決於諸如組織厚度、組織類型、溫度、處理時間期限等。濃縮的儲液可以以任何合適的方式添加至溶劑(例如，水、醇、組織染劑溶液等)， 以形成所述組合物的終溶液。例如，儲液可以藉助於微量吸移管、滴管、量筒等添加至溶劑。 然而，在一些實施方案中，將儲液逐滴稀釋至溶劑中可以是有益的。例如，當儲液包含約 0. 02%聚賴氨酸，約0. 02%聚精氨酸，約0. 01 %天冬醯胺，約0. 1 %甘氨酸，和約0. 001 %聚乙烯亞胺時，1滴(約40-約50微升)儲液可以添加至約600微升溶劑。可以然後向溶劑中添加額外滴數的儲液，直至在組織樣品中獲得所需的結果。例如，可以將2，3，4，5，或更多滴加入至600微升溶劑中。事實上，本領域中技術人員應該認識到組織類型、固定方法、組織染劑、組織厚度等在應用和實驗室之間可以變化很大。固定的組織樣品可以使用防止偽像的組合物，在容許所述組合物防止偽像的任何時刻來處理。例如，在組織樣品已經被固定後但在該樣品被染色前，它可以與所述組合物接觸。在另一個實例中，樣品可以在該樣品被固定後，與染劑和所述組合物接觸。在該實例中， 所述組合物可以在染色過程中的任何合適時刻與樣品接觸。例如，所述組合物可以與組織染劑合併形成可以與組織樣品相接觸的溶液。然而，在其他實例中，染劑可以與組織樣品相接觸並然後可以將所述組合物加入至樣品周圍的染劑溶液中。事實上，在一些實施方案中，在染色過程中使用防止偽像的組合物處理樣品是有益的。例如，一些組織染劑可以與醛系固定劑競爭組織中的結合位點，並由此，起防止偽像的作用。類似地，一些染劑可以逆轉由醛系固定劑形成的亞甲基橋鍵，從而將固定劑釋放至溶液中並增加與防止偽像的組合物中的聚胺和/或形成席夫鹼的化合物結合或否則反應的固定劑的量。在一些實例中，在染色過程中添加防止偽像的組合物也可以通過修飾組織樣品中結合位點起改善染色的作用。例如，防止偽像的組合物可以起修飾組蛋白尾部中的結合位點的作用，其可以增加與所述位點結合的染劑的量。在其他實施方案中，在組織樣品已經固定和染色後使組織樣品和防止偽像的組合物相接觸可能是有益的。在一個實例中，樣品可以固定並使用第一染劑染色，隨後與包含防止偽像的組合物的第二染劑溶液接觸。例如，在樣品已經固定並使用蘇木精染劑染色後，該樣品可以與包含防止偽像的組合物的伊紅染劑溶液相接觸。在另一個實例中，組織樣品可以在該樣品已經固定並染色後使用防止偽像的組合物來處理。例如，固定、染色並隨後置於儲藏器中的組織樣品可以從儲藏器中移出並然後使用防止偽像的組合物來處理，以減少、 逆轉、或否則防止組織中的偽像。防止偽像的組合物可以與容許所述組合物防止已經使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的任何組織染劑或任何數量的染劑一起使用。例如，所述組合物可以在使用簡單染劑，包括但不僅限於蘇木精和/或伊紅染色的組織樣品上使用。合適的簡單染劑的一些另外的實例包括嚇Rg橙、俾斯麥棕、洋紅、考馬斯藍、結晶紫、DAPI、溴化乙錠、品紅、 Hoechst染劑、紅海蔥(rodine)、孔雀石綠、甲基綠、亞甲基藍、中性紅、尼羅藍、尼羅紅、四氧化鋨、羅丹明、safanin等。在另一個實例中，所述組合物可以在使用複雜染劑，諸如免疫過氧化物酶、鹼性磷酸酶、和/或免疫螢光染色的樣品上使用。例如，所述組合物可以在已經使用一種或多種螢光團，諸如綠色螢光蛋白染色的組織樣品上使用。在這樣的實例中，組織樣品可以使用任何合適數量諸如2、5、10、20、30或更多個螢光團來染色。在另一個非限制性實例中，所述組合物可以用於防止已經在原位雜交過程中染色或使用考馬斯藍染色的組織樣品中的偽像。防止偽像的組合物可以以任何方式添加至固定的組織樣品，所述方式是容許該組合物防止所述樣品中的偽像。例如，固定的組織樣品可以被防止偽像的組合物浸沒，被防止偽像的組合物噴灑，用防止偽像的組合物漂洗，或否則與防止偽像的組合物接觸。在一些實施方案中，在包含適當濃度的一種或多種醛反應性化合物和其他所需物質的組合物的終溶液中浸沒樣品是有益的。在與組織樣品接觸後，防止偽像的組合物的終溶液可以保持與所述樣品相接觸持續足以防止與醛系固定劑相關的偽像的任意時間段。例如，樣品可以保持與所述組合物相接觸一段短至數秒或長至數日的時期。例如，所述組合物的終溶液可以保持與固定的組織樣品相接觸小於約25分鐘。然而，在其他實例中，固定的組織可以與所述組合物的終溶液相接觸約10秒-約5分鐘的時間段。在其他實例中，組織樣品可以保持與所述組合物相接觸約2. 5分鐘-約3分鐘。一旦組織已經與防止偽像的組合物接觸，來自所述組合物的聚胺和/或形成席夫鹼的化合物可以通過本領域中已知的任何方法或技術從樣品中除去。例如，組合物的聚胺和/或形成席夫鹼的化合物以及任何反應的醛系固定劑可以通過衝洗樣品，在一系列浴液中洗滌樣品，等從組織樣品中除去。以這樣的方式，釋放的醛系固定劑可以從組織樣品中除去，從而防止釋放的固定劑導致樣品中增加偽像。使用與已經釋放至溶液中的醛系固定劑結合或否則反應的一種或多種聚胺和/ 或形成席夫鹼的化合物可以提供若干優勢。例如，使用所述的防止偽像的組合物處理固定的樣品可以起容許更多染劑結合組織樣品中的極性胺基酸和類似殘基的作用。因此，防止偽像的組合物可以改善組織染色並增加染色強度。類似地，使用所述組合物的處理可以減少組織樣品中醛系固定劑色素的量。所述組合物還可以起恢復使用醛系固定劑固定的組織的免疫反應性的作用並，由此，增加以免疫組化法染色組織的能力。另外，所述組合物可以起捕獲醛系固定劑的作用，所述醛系固定劑已經通過與染劑諸如蘇木精的延長時間暴露而釋放至溶液中。因此，所述組合物可以防止另外的偽像的形成。而且，防止偽像的組合物可以使細胞和細胞結構恢復至它們固定前的尺寸和形狀。以這樣的方式，所述組合物可以改善組織形態學和染色特徵。另外，混合防止偽像的組合物和組織染劑(例如，蘇木精，伊紅，等)可以提供若干優勢。在與混合所述組合物和組織染劑相關的出人意料的優勢的一個實例中，所述組合物可以起增加組織染劑的有效保存期的作用。例如，其中無防止偽像的組合物的染劑溶液在其開始沉澱或否則失去其反應性之前，僅可以在室溫和無細菌汙染的條件下下維持幾天 (例如，一周)。具有防止偽像的組合物的相同組織染劑溶液可以維持2、3、4、5、6、7、8或更多倍更長的時間而不發生沉澱且不過度降低反應性。在一個非限制性實例中，在無防止偽像的組合物的染劑溶液的有效保存期為約7天的情況下，組織染劑的保存期可以增加選自約6-約8周的一段時期。該延長的保存期可以通過在所述組合物的效力耗盡時，添加防止偽像的組合物1次，或2、3、4或更多次來實現。當然，由防止偽像的組合物增加的組織染劑的保存期的倍數可以根據許多因素，諸如所用的染劑、組織厚度、組織類型、固定方法、防止偽像的組合物的濃度、組合物加入至染劑的次數等而變化。
實施例關於本公開內容提供的附圖包括三種不同類型的固定的和染色的人組織樣品的比較圖像。具體地，圖1和2包含人骨髓組織的圖像，圖3和4包含人輸卵管組織的圖像， 且圖5和6包含人子宮內膜組織的圖像。在各附圖中，樣品利用類似的固定劑介質和技術製備。例如，在圖1-6中，組織樣品使用固定試劑，即約5%福馬林來固定。而且，圖1-6 中的樣品分別使用類似的方法和組合物來染色。例如，圖1-6中的樣品分別使用靶向組蛋白末端尾部(細胞核中)的蘇木精和靶向蛋白(細胞質中)的伊紅來染色。另外，每幅照片均使用LEICA 光學顯微鏡，以1250X放大倍數拍攝。儘管圖1-6中的樣品以實質上相同的方式固定和染色，但是僅一半樣品使用防止偽像的組合物處理。具體地，圖2、4和6中的樣品使用防止偽像的組合物處理，而圖1、3、5 中的樣品沒有。為了更好地說明防止偽像的組合物的效力，沒有使用防止偽像的組合物處理的多種組織樣品，或未處理樣品，與相應的處理的組織樣品，或使用該組合物處理的組織樣品進行比較。在一個比較實施例中，圖1和2圖示圖1中的未處理的骨髓組織樣品100具有若干偽像，這些偽像在圖2所示的處理的樣品200中減少或不存在。例如，圖1的樣品中的細胞核102的邊界(boarder)趨向於模糊和輪廓不分明，而圖2的樣品中的細胞核202趨向於清楚和輪廓分明。而且，在圖2中，核仁204與圖1中的核仁104相比似乎輪廓更分明和
更明顯。另外，圖1中的細胞質106似乎具有空泡偽像，其中細胞質106中充滿小泡，這使細胞質106呈現大理石狀的外觀並使其輪廓不分明。相反，圖2中的細胞質206似乎無任何明顯的細胞質空泡化。因此，圖2中的細胞質206似乎是平滑的並與圖1中的細胞質邊界108相比似乎具有輪廓更分明的細胞質邊界208。在另一個比較實施例中，圖3和4顯示圖3中未處理的輸卵管組織樣品300具有若干偽像，這些偽像在圖4中處理的輸卵管組織樣品400中減少或不存在。例如，圖3和 4的樣品300和400的比較顯示圖4中處理的樣品400中的纖毛402與圖3中未處理的樣品300中的纖毛302相比似乎輪廓更分明。類似地，圖4中通過細胞膜406的纖毛錨 (anchoring)404與圖3中的纖毛錨304相比似乎更明顯和輪廓分明。另外，圖4的處理的樣品400中的細胞質408和細胞核410與圖3中未處理的樣品的細胞質308和細胞核310 相比似乎更清楚和輪廓更分明。在最後的比較實施例中，圖5和6圖示圖5中未處理的子宮內膜組織樣品500具有若干偽像，這些偽像在圖6中處理的子宮內膜組織樣品600中減少或不存在。例如，圖5 中的基質細胞502和子宮內膜管狀腺細胞504與圖6中的基質細胞602和子宮內膜管狀腺細胞604相比似乎更加顯著地靠在一起。類似地，處理的樣品600(圖6)中的細胞核606和細胞質608與圖5的未處理樣品500中的細胞核506和細胞質508相比似乎更輪廓分明， 並包括圖5的未處理樣品500中的細胞核506和細胞質508中不存在的細微特徵。簡言之，圖1、3、和5中的未處理的樣品和圖2、4、和6中的處理的樣品的比較顯示在圖2、4、和6中向樣品加入防止偽像的組合物可以極大地減少固定的和染色的組織樣品中的偽像。本方法和組合物可以具體表現為其他特定形式，而不偏離如在本文中廣泛所述和下面要求保護的其結構、方法、或其他基本特徵。所述的實施例和實施方案在所有方面僅被認為是舉例說明性的而非限制性的。本發明的範圍因此通過所附的權利要求而非通過前述說明來指定。在權利要求的含義和等價範圍內的所有變化包括在權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種用於防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的固定劑偽像的方法，所述方法包括獲得使用醛系固定試劑固定的組織樣品；使所述組織樣品與防止偽像的組合物相接觸，所述防止偽像的組合物與游離醛系固定試劑反應，從而防止偽像形成；和使所述組織樣品與組織染劑相接觸。
2.根據權利要求1的方法，其中所述防止偽像的組合物包含聚胺。
3.根據權利要求2的方法，其中所述防止偽像的組合物包含形成席夫鹼的化合物。
4.根據權利要求2的方法，其中所述聚胺選自包含精氨酸、聚精氨酸、賴氨酸、聚賴氨酸、腐胺、聚乙烯胺、色氨酸、聚色氨酸、屍胺、亞精胺、精胺、及其組合的聚合物。
5.根據權利要求3的方法，其中所述形成席夫鹼的化合物選自甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；包含甘氨酸、精氨酸、或天冬氨酸的肽；聚乙烯亞胺；及其組合。
6.根據權利要求1的方法，其中所述醛系固定試劑包含甲醛。
7.根據權利要求2的方法，其中所述聚胺與處於選自以下的濃度的組織樣品相接觸a.約1Χ1(Γ2% -約 IX KT1 重量％ ；b.約1 X 10_4% -約 1 X 1(Γ8 重量 ％ ；c.約1Χ1(Γ6% -約 8. 3X10"重量％ ；d.約3.3X10—7 重量 ％。
8.根據權利要求3的方法，其中所述形成席夫鹼的化合物存在於處於選自以下的濃度的終溶液中a.約1Χ1(Γ2% -約 IX KT1 重量％ ；b.約1 X 10_4% -約 1 X 1(Γ8 重量 ％ ；c.約1Χ1(Γ5% -約 9X10"重量％ ；禾口d.約1X10"% -約 9. 9X10"重量％。
9.根據權利要求1的方法，其中所述組織染劑選自簡單的組織染劑或複雜的組織染劑。
10.根據權利要求9的方法，其中所述組織染劑選自免疫過氧化物酶、螢光團、蘇木精、 伊紅、及其組合。
11.根據權利要求1的方法，其中所述組織染劑和所述防止偽像的組合物在接觸所述組織樣品之前合併在一起。
12.一種防止偽像的組合物，其防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像，所述組合物包含終濃度為約IX 10_2重量％ -約IX 10,重量％的聚胺。
13.根據權利要求12的組合物，還包含形成席夫鹼的化合物。
14.根據權利要求12的組合物，其中所述聚胺選自包含精氨酸、聚精氨酸、賴氨酸、聚賴氨酸、腐胺、聚乙烯胺、色氨酸、聚色氨酸、屍胺、亞精胺、精胺、及其組合的聚合物。
15.根據權利要求12的組合物，其中所述防止偽像的組合物還包含組織染劑。
16.根據權利要求13的組合物，其中所述形成席夫鹼的化合物選自甘氨酸；精氨酸 』天冬氨酸；聚乙烯亞胺；包含甘氨酸、精氨酸、或天冬氨酸的肽；聚乙烯亞胺；及其組合。
17.根據權利要求16的組合物，其中所述形成席夫鹼的化合物包含甘氨酸。
18.根據權利要求12的組合物，其中所述組合物的終溶液包含處於選自以下的終濃度的聚胺a.約1 X 10_4% -約 1 X 1(Γ8 重量 ％ ；b.約1X10-6% -約 8.3X10—7 重量％ ；和c.約3. 3X10〃 重量 ％。
19.根據權利要求13的組合物，其中所述組合物的終溶液包含處於選自以下的終濃度的形成席夫鹼的化合物a.約1Χ1(Γ2% -約 IX KT1 重量％ ；b.約1 X 10_4% -約 1 X 1(Γ8 重量 ％ ；c.約1Χ1(Γ5% -約 9X10"重量％ ；禾口d.約1X10"% -約 9. 9X10"重量％。
20.一種增加組織染劑的有效保存期的方法，所述方法包括 提供組織染劑；和將包含聚胺的防止偽像的組合物加入至所述組織染劑。
21.根據權利要求20的方法，其中所述防止偽像的組合物還包含形成席夫鹼的化合物。
22.根據權利要求20的方法，其中所述組織染劑選自免疫過氧化物酶、螢光團、蘇木精、伊紅、及其組合。
23.根據權利要求20的方法，其中所述聚胺選自包含精氨酸、聚精氨酸、賴氨酸、聚賴氨酸、腐胺、聚乙烯胺、色氨酸、聚色氨酸、屍胺、亞精胺、精胺、及其組合的聚合物。
24.根據權利要求21的方法，其中所述形成席夫鹼的化合物選自甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亞胺；包含甘氨酸、精氨酸、或天冬氨酸的肽；聚乙烯亞胺；及其組合。
全文摘要
描述了用於防止使用醛系固定劑固定的組織樣品中的偽像的方法和組合物。所述方法包括使用醛系固定劑，諸如福馬林固定試劑固定組織樣品。固定後，組織樣品可以與單獨的各自包含防止偽像的組合物或組織染劑的溶液相接觸。然而，因為防止偽像的組合物可以增加染劑的保存期，所以所述染劑和所述組合物優選在加入至樣品前混合。防止偽像的組合物可以包括一種或多種胺基酸、聚胺、和/或形成席夫鹼的化合物。所述組合物的成分可以與游離的固定劑結合或反應，以防止固定劑偽像。另外，防止偽像的組合物和游離的醛系固定劑之間的反應可以是有利的，這歸因於防止偽像的組合物的組分的熱力學、小尺寸、高度擴散能力、和/或高濃度。
文檔編號G01N33/50GK102203604SQ200980141997
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月20日 優先權日2008年10月21日
發明者託馬斯·M·東德林格 申請人:託馬斯·M·東德林格