一種異養硝化好氧反硝化細菌及其培養方法和用途的製作方法
2023-05-03 02:01:16
專利名稱：：一種異養硝化好氧反硝化細菌及其培養方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於環境微生物領域，具體涉及一種高效的異養硝化好氧反硝化細菌及其培養方法和用途。
背景技術：
：含氮廢水是目前環境汙染治理中的重大問題。生物脫氮是目前被公認為廢水脫氮中最經濟、最有效的方法之一。傳統的氨氮廢水處理是通過自養硝化菌的硝化作用與異養反硝化菌的反硝化作用的組合工藝使氨氮轉化為氮氣。、,+自養硝化菌、,n—亞硝酸鹽氧化菌、,n—反硝化菌NH4+_^N02_^N03_^N2該工藝冗長，由於硝化和反硝化的工藝條件不同，需分別在兩個系統中完成，造成了兩方面不足。首先是能耗大，氨氮硝化要耗氧，也就是要耗能供氧，前置反硝化系統需設置回流比較大的混合液內回流，這也增加了能耗。其次，反硝化反應要有碳源作為電子供體，若汙水中碳源不足(C/N過低)，則需投加甲醇等有機碳，這不僅增加了運行費用，還增加了運行管理和後續處理的難度。因此廢水處理工程投資大，運行成本高。而且硝化細菌通常是自養硝化菌，增殖緩慢，容易在廢水生物處理系統中被淘汰，由此影響廢水生物處理系統脫氮效果的穩定性。因此國內外學者一直在尋找高效低耗的脫氮工藝。近幾十年來，從土壤、深海火山口、汙泥、湖水等處分離得到了多種具有硝化活性的異養微生物，包括有細菌、放線菌和真菌等，被稱為異養硝化菌。這是一類具有重要應用價值的微生物資源，它們可以利用很多基質，包括無機N和有機N:如銨、胺、醯胺、N一垸基羥胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等。由於許多異養硝化菌也具有好氧反硝化作用，在氧化過程中形成多種無機和有機N化合物，包括一些氣態N產物如氧化亞氮等直接脫出水溶液系統，這為研究開發簡捷的含氮廢水處理新工藝提供了基礎，而具有好氧反硝化作用的異養硝化菌就是簡捷脫氮新工藝的關鍵菌株。異養硝化菌易於培養，增殖較快，底物利用範圍廣，在廢水生物脫氮系統中可以穩定存在。因此採用異養硝化菌開發設計簡捷的廢水脫氮新工藝，可實現生物脫氮工藝的快速啟動和穩定運行，提高脫氮效率，降低運行成本。有望克服傳統處理工藝在處理效率與經濟適用兩方面的矛盾，實現廢水高效經濟的脫氮，為解決日益嚴重的含氮化合物對環境的汙染問題作出貢獻。
發明內容針對以上問題，本發明的目的是提供一株具有異養硝化和好氧反硝化活性的細菌，該細菌具有脫除水體中氮素的能力。本發明的另一個目的是提供一種培養條件，使該細菌能表現出更強的異養脫氮能力。本發明的另一個目的是提供一種培養條件，使該細菌能表現出自養脫氮能力。本發明的另一個目的是提供新的細菌在水體生物脫氮中的應用，單獨使用該細菌便可有效脫除水體中的氮素。通過本發明可達到以上各目的。本發明可以通過以下方式得以實現1.本發明中的菌株是一種具有脫氮生物活性的細菌，可以單株脫除水體中的氨氮，還可以通過好氧反硝化脫除水體中的亞硝酸氮和硝酸氮。該菌株既可以異養生長，又能自養生長；既能在有機碳源條件下脫氮，又能在無機碳源條件下脫氮。在脫氮過程中，沒有檢測到亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累。更具體地，該菌株屬於惡臭假單胞菌屬的惡臭假單胞菌(屍seWowomwDN1.2)，保藏登記號為CCMCCNO.207075,保藏地點中國典型培養物保藏中心，保藏時間2007年5月25日。2.本發明菌株的分離鑑定(1)培養基-A.自養硝化培養基(g/L):(NH4)2S042，K2HP041，MgS04'7H200.5，FeS04'7H200.4，NaCl2。裝瓶後按質量百分比為0.5%的比例加入CaC03，最後用1%的NaOH溶液調pH到7.2，121'C滅菌20分鐘。B.矽膠平板的製作將Na2Si(V9H20配成比重為1.10的溶液，並過濾澄清。將等體積的上述溶液緩慢倒入比重為1.09的鹽酸中，不斷攪拌，使其混合均勻。在溶液混合均勻的情況下倒平板。靜置24小時，待其凝固。用緩慢流水衝洗2~3天，以便除去Cr。加AgN03檢測，直到無白色產生為止。用煮沸的蒸餾水衝洗3次滅菌。C.分離培養基在每一個矽膠平板培養皿中加入培養基A2mL，輕輕轉動培養皿，使培養液均勻分布，打開烘箱在5(TC烘箱烘至無水流動為止。D.牛肉膏培養基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白月東10.0，NaCl5.0,調pH7.2~7.4，121°C滅菌20分鐘。E.有機碳源脫氮培養基(g/L):KH2P040.7，MgS04'7H200.5，CaCl2'2H200.5，(NH4)2S040.3~2.5，葡萄糖0.5~4.0，NaOH調pH7.2~7.4，121。C滅菌20分鐘。上述培養基如製成固體培養基，則添加加瓊脂1.5%~2.0%。(2)惡臭假單胞菌菌株DN1.2的分離純化以發明人實驗室長期運行的廢水脫氮生物反應器中的汙泥為樣品，取100mL汙泥，靜置IO分鐘，去掉上清液，用剩下的汙泥作為原液進行梯度稀釋為10Q、10"、l(T2。採用(1)中所述的分離培養基C平板培養，用移液槍在每個平板中加入10Q、10"、l(T2樣品各0.2mL，然後用滅菌玻璃珠均勻塗布。倒置放入加了水的乾燥器中，以防矽膠平板乾裂，30'C培養直至矽膠平板上長出單菌落。挑取單菌落採用培養基A平板劃線，進一步純化得到本發明中的菌株PwMctomomwspDN1.2。後來發現該細菌能在培養基D中生長，於是採用培養基D進行菌種保藏。(3)惡臭假單胞菌菌株DN1.2菌落形態特徵在培養基A平板上培養2d後，解剖鏡下觀察到菌落直徑約0.5mm，乳白色，菌落呈圓形、半透明，表面溼潤、邊緣較整齊。在培養基D上培養3d後，菌落淺黃色，近圓形，直徑23mm，邊緣較光滑。(4)惡臭假單胞菌菌株DN1.2菌體形態特徵透射電鏡的觀察表明菌體呈橢球或短杆狀，500600nmX800900nm。(5)惡臭假單胞菌菌株DN1.2的生理生化特徵最適培養溫度3030'C,pH7.0~7.5，革蘭氏染色陰性。主要的生理生化特性見表1。表lDN1.2菌株的主要生理生化特性試驗項目結果試臉項目結果試驗項目結果試銓項目結果對照-D-蜜二糖+Wp-苯乙醇酸-L-組氨酸-a-環糊精-甲基葡糖苷+衣康酸-羥基脯氨酸糊精+D-阿洛酮糖+a-氧代丁酸+L-亮氨酸+糖原+D-棉子糖-a-氧代戊二酸+L-鳥氨酸-Tween40+L-鼠李糖-a-氧代戊酸+L-苯丙氨酸—Tween80+D-山梨醇-D，L-乳酸+L-脯氨酸+N-乙醯半乳糖胺+應糖+丙二酸+L-焦穀氨酸N-乙醯葡萄糖胺+D-海藻糖-丙酸+D-絲氨酸核糖醇-松二糖-奎尼酸-L-絲氨酸+L-阿拉伯糖-木糖醇-D-己糖酸-L-蘇氨酸+D-阿糖醇-丙酮酸甲酯+葵二酸-D，L-肉鹼一D-纖維二糖+丁二酸一甲酯+丁二酸+g-氨基丁酸一i-赤蘚醇-乙酸+溴代丁二酸+尿刊酸D-果糖順-阿康酸+琥珀醯胺酸-肌苷+L-果糖-檸檬酸+葡糖醛醯胺-尿苷+D-半乳糖-甲酸-L丙氨醯胺+胸苷龍膽二糖+D-半乳糖酸內酯-D-丙氨酸+苯基乙胺a-D-葡萄糖+D-半乳糖醛酸-L-丙氨酸+腐胺m-肌醇-D-葡糖酸+L-丙氨醯甘氨酸+2-氨基乙醇a-D-乳糖-b-甲基葡糖苷-L-天冬醯胺+2，3-丁二醇-Lactulose-D-葡糖醛酸-L-天冬氨酸-甘油一麥芽糖+a-羥基丁酸+L-穀氨酸+D,L-甘油磷酸鹽一D-甘露醇-b-羥基丁酸+甘氨醯天冬氨酸+D-葡糖-l-磷酸D-甘露糖+g-羥基丁酸-甘氨醯穀氨酸+D-葡糖-6-磷酸一注+表示陽性反應或能利用；一表示陰性反應或不能利用(6)16SrDNA的PCR擴增與測序實驗儀器BIO-RADMJMiniThermalCycler(PCR儀)，BIO-RADPowerPac3000穩壓電泳儀，GDS8000,GeneCompanyLimited凝膠成像儀實驗方法熱裂解菌懸液，以基因組DNA為模板擴增16SrDNA，擴增引物採用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1505R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，分別對應於大腸桿菌(Eyc/^/cW"co//)16SrDNA8~27位和14871505位的核苷酸，引物合成由寶生物公司(TAKARA)完成。PCR反應體系採用50pl反應體系10x緩衝液(含Mg2+)5td，4[ildNTP(各2.5mmol/L)，10pmol/L引物各lpl，rTaq酶(5U/W)0.5nl，lOng/^ilDNA模板lpl，去離子水37.5^1。PCR擴增條件94。C預變性5min;94°Clmin，53°Clmin,72°Clmin30s,共30個循環；最後72°C延伸10min，4'C放置。擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，驗證後切下膠條，用DNA膠回收試劑盒(杭州V-gene)純化PCR產物。回收產物與載體pMD18-T(TAKARA)16'C連接過夜，轉化感受態大腸桿菌JM109，在含氨節青黴素Amp(100ng/L)的LB平板上塗板，挑取單菌落培養並篩選陽性克隆，送公司測序，測序工作由上海英俊生物公司完成。(7)16SrDNA序列分析與系統發育分析測序後得到DN1.2的16SrDNA序列1498bp，提交NCBI進行BLAST序列比對(登陸號:EF682071)，發現DN1.2與多株惡臭假單胞菌CPwMcfomo"^/^Wa)的16SrDNA序列相似性水平達到99%，結合菌株的形態學和生理生化鑑定特徵，可初步確定DN1.2為i^ewfitomo"as77W油,命名為i^ewi/o附o"os/M"f/asp.DN1.2。(8)惡臭假單胞菌菌株DN1.2的脫氮活性菌株DN1.2同時具有自養脫氮和異養脫氮的能力，並且在兩種脫氮過程中都不積累硝酸鹽和亞硝酸鹽。以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，DN1.2能去除氨氮。在初始氨氮濃度為80~100mg/L的有機碳源培養基中(初始CODcr約1000mg/L),DN1.2經過10.5小時的培養，氨氮去除率可達50%~60%。並且培養體系中始終沒有檢測出硝酸氮、亞硝酸氮的積累。以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源。在初始CODa濃度在20003000mg/L，初始氨氮濃度為80~100mg/L時，培養24h後氨氮和CODcr都同步得到了較好的去除，去除率分別為75%~88%和75%~85%。以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源。初始CODcr濃度2000mg/L，初始氨氮濃度約為90~100mg/L時，培養24h後檢測氮元素的分布情況。系統中氨氮的去除率可達90%，水體中總氮去除率可達88%，所殘餘的總氮幾乎全為菌體細胞。以碳酸鈣為碳源，硫酸銨為氮源。在初始氨氮濃度約為60mg/L的無機碳源脫氮培養基中，經過IO個小時的振蕩培養，DN1.2對氨氮去除率可達60。/。以上。並且在整個培養過程中，沒有檢測出硝酸氮和亞硝酸氮。本發明菌株還可以NaN02、NaN03、及其混合物為底物的進行好氧反硝化作用。以亞硝酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉+硝酸鈉(摩爾比l:1)為氮源，氮元素濃度均為50mg/L，碳源為0.1%葡萄糖，培養24h後對以上各氮源的氮去除率可達70%~85%。本發明中的菌株DN1.2在存在氮素如氨態氮和/或硝酸鹽氮和/或亞硝酸氮的水體中，均有脫除氮素的活性，並且在較高的C/N比條件下，脫氮活性更強。這樣，本發明菌株可用於多種含氮廢水的處理。3.本發明中惡臭假單胞菌菌株DN1.2的培養(1)所使用的培養基A.牛肉膏培養基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白腖10.0，NaCl5.0,調pH7.2~7.4，121'C滅菌20分鐘。B.有機碳源脫氮培養基(g/L):KH2P040.7，MgS04'7H200.5，CaCl2'2H200.5，(NH4)2S040.5，葡萄糖0.5~4.0，NaOH調pH7.2~7.4，121'C滅菌20分鐘。上述培養基如製成固體培養基，則添加加瓊脂1.5%~2.0%。(2)本發明中惡臭假單胞菌菌株DN1.2培養條件將牛肉膏培養基斜面上保存的i^wfitomo"os戸WaspDN1.2用接種環刮取一環菌分別接種於牛肉膏液體培養基或有機碳源脫氮液體培養基中，30~35°C，170200rpm振蕩培養，在1016小時內可收穫菌液。4.本發明中惡臭假單胞菌菌株DN1.2的使用方法
技術領域：
：本發明提供細菌在水體的生物脫氮應用，使用本發明提供的細菌可有效的脫除水體中的氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮。(1)使用前用有機碳源脫氮培養基活化菌株從牛肉膏培養基斜面上刮取一環菌苔，接種入裝有30mL50mL有機碳源脫氮液體培養基的250mL錐形瓶中，30~35°C，170~200rpm振蕩培養10~16小時，即可完成菌株活化。(2)將活化後的菌液按2%~10%比例接種於待處理含氮廢水中，30~35°C,170~200rpm振蕩培養或曝氣，定時取樣檢測NH4+-N、N02—-N、N03:N、TN、CODc^等去除情況。(3)檢測方法NH4+-N:採用水楊酸-次氯酸鹽分光光度法N02_-N:採用N-(l-萘基)-乙二胺光度法N03_-N:採用DMP分光光度法TN:採用鹼性過硫酸鉀法消解紫外分光光度法CODCr:採用重鉻酸鉀消解分光光度法以上方法均參照中國環境科學出版社出版的《水和廢水檢測分析方法》(第四版)。NH4+-N、N02—-N、NOf-N、TN、CODo等的測定採用德國WTW多功能水質分析儀(TheSpectroquantAnalysisSystemPhotoLabS12)，型號PhotoLabS12，工作電壓12V。消煮使用WTW公司產CR2200加熱器。測試試劑為默克公司生產的配套試劑。O.D值採用北京普析通用公司產紫外-可見分光光度計，型號新世紀T6,波長600nm下測定培養液的OD值。(4)一種培養惡臭假單胞菌0>11.2體現更強的脫氮活性的方法，該方法包括A.有機碳源條件下a)碳源為葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉，氮源均為硫酸銨，按照C/N(質量比)為2:1~16:1分別配製不同的有機碳源的培養基；pH為6.0-8.5;溫度為2537'C條件下培養細菌。b)優選的方法組合包括碳源為葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉，按照C/N(質量比)為4:112:1分別配製不同的有機碳源的培養基；pH為7.0-7.5;溫度為3034'C條件下培養細菌。c)最佳的方法組合包括碳源為乙酸鈉、葡萄糖，按照C/N(質量比)為8:112:1分別配製不同的有機碳源的培養基；pH為7.5;溫度為3(TC條件下培養細菌。B.無機碳源條件下a)碳源為碳酸鈣，氮源為硫酸銨，配方見菌株分離鑑定中的培養基A，配製自養硝化培養基；pH為6.08.5;溫度為2537'C條件下培養細菌。b)優選的方法組合包括碳源為碳酸鈣，氮源為硫酸銨，配方見菌株分離鑑定中的培養基A,配製自養硝化培養基；pH為7.0-7.5;溫度為3034'C條件下培養細菌。c)最佳的方法組合包括碳源為碳酸鈣，氮源為硫酸銨，配方見菌株分離鑑定中的培養基A，配製自養硝化培養基；pH為7.5;溫度為30'C條件下培養細菌。5.本發明中惡臭假單胞菌菌株DN1.2用於含氮廢水處理的脫氮條件(1)惡臭假單胞菌DN1.2用於氨氮廢水處理的脫氮條件本發明菌株可用於CODcr為53000mg/L、氨氮含量為5500mg/L、pH710的含氮廢水的處理，25-37°C，曝氣。其最佳脫氮條件為CODo為20003000mg/L、氨氮含量為100300mg/L、pH7.07.5，30°C，曝氣。(2)惡臭假單胞菌DN1.2用於含硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮及其混合物的廢水處理的脫氮條件本發明菌株可用於CODa為《000mg/L、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮及其混合物氮元素含量為Sl50mg/L、pH710的含氮廢水的處理，25~37'C，曝氣。其最佳脫氮條件為CODcr為20003000mg/L、氮元素含量為50~100mg/L、pH7.07.5，3(TC，曝氣。本發明中的銨態氮或氨態氮是指可溶性的銨根離子NH4+—NH3;氮氧化物是指NO和N20。本發明中的異養硝化作用廣義上是指有機和無機氮化合物從還原態經生物氧化為多種氧化態的過程，狹義上是指異養微生物在好氧條件下將還原態一3價的氨氮或有機氮氧化為羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程。本發明中的反硝化是指微生物將N03—還原為N02—，繼而再還原為N20、NO或N2的過程。本發明中的脫氮是指水體中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH4+、N02-和NOr。在本發明中的碳/氮比，又稱C/N是指碳元素的質量與氮元素的質量之比。本發明中，惡臭假單胞菌是從廢水生物脫氮反應器中分離篩選得到的，並作了專利程序的保藏，保藏號為CCMCCNO.207075,在本發明中，惡臭假單胞菌DN1.2等同於CCMCCN0.2歸75。本發明具有以下優點(1)本發明菌株既可自養生長，又可異養生長，基質利用範圍廣，易於培養。(2)本發明菌株既能在異養條件下脫氮，也能在自養條件下脫氮。並且在脫氮過程中沒有硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累。(3)本發明菌株可同時去除有機廢水中氨氮和CODcr。(4)本發明菌株還可以NaN02、NaN03及其混合物為底物進行好氧反硝化脫氮。(5)本發明菌株在異養條件下主要進行異化性脫氮。(6)本發明菌株適用於高濃度有機含氮廢水、無機含氮廢水的處理，而且在脫氮過程中，不會產生亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累，可以在一個處理系統中完成快捷脫氮，不同於傳統的硝化一反硝化脫氮途徑。使用該菌株處理廢水工藝簡單，脫氮效果穩定。附圖1惡臭假單胞菌DN1.2在牛肉膏培養平皿上生長的菌落圖附圖2惡臭假單胞菌DNL2菌體透射電鏡顯微照片附圖3惡臭假單胞菌DN1.2菌體生長曲線附圖4惡臭假單胞菌DN1.2培養前後體系中氮元素分布的變化下面結合具體實施例進一步闡明本發明，應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍。具體實施例方式實施例l:本發明菌株的培養(1)牛肉膏培養基和有機碳源脫氮培養基，12rC，滅菌20分鐘。(2)將菌株惡臭假單胞菌DN1.2接種至滅菌的牛肉膏斜面上，35'C活化培養10~16h備用o(3)將活化後的菌種分別接種於牛肉膏液體培養基或有機碳源脫氮液體培養基中，250mL三角瓶中裝量50mL培養基，35°C，170~200rpm振蕩培養10~16h。DN1.2在牛肉膏培養基中的生長曲線見附圖3。從圖中可以看出，0\1.2在牛肉膏培養基中生長很好，延滯期很短，在310小時內為對數生長期，IO小時後即可達到穩定期。(4)4000rpm，10min離心收穫菌體或直接將菌懸液轉接於待處理的廢水樣品中。實施例2:本發明菌株在無機碳源條件下脫氮自養硝化培養基(g/L):(NH4)2S042，K2HP041，MgS04'7H200.5，FeS04'7H200.4，NaCl2。裝瓶後按質量百分比為0.5。/。的比例加入CaCO3，最後用1%的NaOH溶液調pH到7.2，12rC滅菌20分鐘。使用自養硝化培養基，接種10%的菌懸液(培養方法見實施例l)，對照用同體積滅菌水代替，3(TC，170rpm振蕩培養IO個小時，定時取樣測定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮濃度的變化。實驗結果見表2。從表2中可看出，在初始氨氮濃度為56.6mg/L的無機碳源脫氮培養基中，經過10個小時的振蕩培養，DNL2將體系中的氨氮降到了20.8mg/L,氨氮去除率為63.3%。並且在整個培養過程中，沒有檢測出硝酸氮和亞硝酸氮的積累，說明DN1.2具有在自養條件下去除氨氮的能力。表2DNL2在無機碳源條件下對氨氮的去除tableseeoriginaldocumentpage10實施例3:本發明菌株在有機碳源條件下脫氮有機碳源脫氮培養基(g/L):KH2P040.7，MgS04'7H200.5，CaCl2'2H200.5，(NH4)2S040.5，葡萄糖1.0~4.0,NaOH調pH7.2~7.4，121。C滅菌20分鐘。(1)有機碳源條件下對氨氮的去除使用有機碳源脫氮培養基(配製CODcr約1000mg/L，氨氮約80mg/L)，接種6.7%的菌懸液(培養方法見實施例1)，對照用同體積滅菌水代替，30°C，170rpm振蕩培養12個小時，定時取樣測定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮濃度的變化。結果見表3。從表3中可以看出，在培養基中存在有機碳源時，DN1.2也能去除氨氮。在初始氨氮濃度為82.3mg/L的有機碳源培養基中(初始CODcr約1000mg/L)，DN1.2經過10.5小時的培養，將體系中的氨氮降到了37.5mg/L，氨氮去除率為54.5%。並且培養體系中始終沒有檢測出硝酸氮、亞硝酸氮的積累。表3DN1.2在有機碳源條件下對氨氮的去除tableseeoriginaldocumentpage11(2)在有機碳源條件下對氨氮和CODo的同時去除使用有機碳源脫氮培養基，配製初始CODcr濃度分別為1000、2000、3000、4000(mg/L)的培養基,分別對應於葡萄糖濃度1%。，2%。，3%o，4%。，氨氮均為80mg/L左右，接種2%菌懸液(培養方法見實施例1)，對照用同體積滅菌水代替，30°C，200rpm振蕩培養24小時後測定CODa和氨氮的降解率。實驗結果見表4。從表4可看出，DN1.2在初始CODCr為1000mg/L時對葡萄糖碳源的利用率最高，可以去除96.1%的COD&，而在初始CODa為3000mg/L左右時有最大的氨氮去除率，可以達到86%以上，在初始CODCr濃度在2000-3000mg/L時，氨氮和CODcr都同步得到了較好的去除，去除率分別為76.4%~86.1%和78.4%~82.6%。在CODcr小於等於3000mg/L時，氨氮去除率隨著碳源濃度的增加而增加，氨氮的去除率與碳源的濃度大小呈一定的正相關性，而當初始CODcr濃度超過4000mg/L後，菌株對氨氮的去除受到明顯的抑制。所有培養液中均未檢出硝酸氮和亞硝酸氮的積累。因此，DN1.2能利用外加有機碳源進行異養生長，並同步去除碳源CODcr和氨氮。表4DNL2在有機碳源條件下對氨氮和C0Da的同時去除tableseeoriginaldocumentpage12實施例4:本發明菌株以NaN02、NaN03及其混合物為底物的好氧反硝化脫氮培養基(g/L):KH2P040.7，MgS04.7H200.5，CaCl2'2H200.5，NaN03或NaN02按需濃度配製，葡萄糖1.0，NaOH調pH7.2~7.4，121'C滅菌20分鐘。以亞硝酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉+硝酸鈉(摩爾比1:1)為氮源分別配製三種不同的反硝化培養基1#、2#、3#(配方見表5)，氮元素濃度均配為50mg/L,其他培養基成分相同(碳源均為0.1%葡萄糖)，接種菌懸液量均為2%(培養方法見實施例1)，30°C，200rpm振蕩培養24h後測定氮的去除率。實驗結果見表6。從表6中可看出，DNL2在好氧條件下對亞硝酸氮和硝酸氮都能進行反硝化，反硝化率可達67.3%~82.5%。表明DN1.2具有好氧反硝化能力。表5反硝化培養基1#、2弁、3#中氮源的組成1#2#3#NaN023.6mM01.8mMNaN0303.6mML8mM表6DN1.2的好氧反硝化脫氮作用1#2#3#N02——NN03__NN02——NN03——NN02_—NNO—N0h(mg/L)429.1*05224.532.2524h(mg/L)6.752.20.0816.95.511.5去除率％83.975.8—67.577.664.3N去除率。/。82.567.370*1#培養基中出現硝酸氮估計是由於亞硝酸鈉藥品在空氣中部分氧化的原因實施例5:本發明菌株在有機碳源條件下對氨氮和總氮去除使用上述有機碳源脫氮培養基(配製初始CODa約2000mg/L，氨氮約90mg/L)，接種2%的菌懸液(培養方法見實施例1)，對照用同體積滅菌水代替，30°C，200rpm振蕩培養，24h後分別測定培養液和離心後上清液的總氮，計算細胞同化和異化脫氮的比例。實驗結果見表7。根據表7的結果繪製體系中氮元素分布比例圖，見附圖4。從表7和附圖4中可以看出，系統中氨氮的去除率為89.8%，去除的氨氮中有38.5%被同化為細胞內氮，有58.75%被完全去除(即表7中的脫氮率)，另有2.75%轉化為了水體中的其它氮存在形式，推測可能是羥胺。在此培養條件下，水體中總氮去除率為87.4%，系統總氮去除率為52.8%。DN1.2在有機碳源脫氮培養基中主要進行異化性脫氮。異化性脫氮過程去除的氨氮從水體中完全去除，避免了硝酸鹽、亞硝酸鹽等帶來的危害，真正實現了水體的完全脫氮。菌體在脫氮過程中同化的氨氮所佔比例不高，這意味著在此過程中菌體生物量的增長並不高。菌體對底物的高去除率和生物量的低增長率在廢水處理中有很大的優點，一方面既高效去除了汙染物，另一方面也減少了二次汙染，降低了處理成本。表7DN1.2在有機碳源脫氮培養基中對氨氮和總氮的去除初始氨氮濃度(mg/L)24h後氨氮濃度(mg/L)24h後NOx-N濃度(mg/L)24h後培養液總氮(mg/L)24h後細胞內氮(mg/L)24h後離心上清液總氮(mg/L)系統氨氮去除率(％)=(89.0-9.0)/89.0xl00%水體總氮去除率(％)=(89.0-11.2)/89.0x100%系統總氮去除率(％)=(89.0-42.0)/89.0xl00%脫氮率(％)=(89.0-42.0)/(89.0-9.0)xl00%89.09.0042.030.811.289.887.452.858.8權利要求1.一種異養硝化好氧反硝化細菌，其特徵在於該細菌是惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaDN1.2)，保藏登記號為CCMCCM207075。2.—種培養權利要求1中所述細菌的方法，其特徵在於該方法中碳源為葡萄糖、乙酸鈉或檸檬酸鈉三者中任意一種，氮源為硫酸銨，按照C/N質量比為2:116:1配製有機碳源培養基，在pH為6.0-8.5，溫度為2537i:條件下培養細菌。3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於按照C/N質量比為4:112:1配製有機碳源培養基，在pH為7.0-7.5，溫度為3034'C條件下培養細菌。4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於該方法中碳源為乙酸鈉或葡萄糖，按照C/N質量比為8:112:1配製有機碳源培養基，在pH為7.5，溫度為3(TC條件下培養細菌。5.—種培養權利要求1所述細菌的方法，其特徵在於該方法中碳源為碳酸鈣，氮源為硫酸銨，在pH為6.08.5，溫度為2537'C條件下培養細菌。6.根據權利要求5所述的方法，其特徵是在pH為7.07.5，溫度為3034'C條件下培養細菌。7.根據權利要求6所述的方法，其特徵是在pH為7.5，溫度為3(TC條件下培養細菌。8.—種在水體中脫氮的細菌培養物，含有效量的一種如權利要求1中所述的細菌。9.一種權利要求1中所述的細菌在水體生物脫氮中的應用。全文摘要本發明屬於環境微生物領域，涉及一種高效的異養硝化好氧反硝化細菌及其培養方法和用途。該細菌是惡臭假單胞菌種(PseudomonasputidaDN1.2)，保藏登記號為CCMCCM207075，能夠有效脫除水體中的氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮及其混合物，還可同時去除有機廢水中的CODCr，適用於高濃度有機含氮廢水、無機含氮廢水的處理，脫氮過程中，不產生亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累。使用該菌株處理廢水工藝簡單，脫氮效果穩定。文檔編號C12N1/20GK101338282SQ20071004943公開日2009年1月7日申請日期2007年7月2日優先權日2007年7月2日發明者李毅軍,航楊,鈞黃申請人:中國科學院成都生物研究所