生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法及其菌株的製作方法

2023-05-02 21:26:56

專利名稱：：生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法及其菌株的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法，及其製備過程中所用到的一林新菌才朱-粘質沙雷氏菌(5^ra"amczrcescera)ZJB-09104。(二)
背景技術：
：吡口秦醯胺是一種重要的一線抗結核藥物，主要用於慢性肺結核、發熱、咳嗽、多痰等。它對細胞內結核桿菌有抑制作用，可進人細胞內及透過血腦屏障進人腦組織殺滅結核桿菌；對巨噬細胞緩慢代謝的半休眠菌有獨特的滅菌作用，是結核病短程化療的主要藥物之一。由於吡，秦醯胺具有不同於其它抗結核桿菌藥物的一些優點，因此近年來對吡嗪醯胺的研究逐漸成為熱點。吡溱醯胺除了以抗結核藥物聞名以外，它也是其它醫藥產品的重要中間體。其書於生物2-吡，溱醯胺-4-氧化物是一種抗過每文藥物。吡。秦醯胺可以與金屬離子形成無定形態絡合物，可應用於分析化學領域或元素分析、熱分析、紅外光譜及磁場測定等。吡嗪醯胺還可用於感光材料方面，把含滷化銀光敏性乳液層和非光敏性親水膠體層及吡嗪醯胺類親核試劑的材料處理可成像，這種材料具有很高的感光性和良好的儲藏穩定性。同時，聚吡。秦醯胺也是一種高度透明、具有良好操作性能，並能阻抗水溶解的材料。它有著良好的價格和性能潛力，它還能提供優良的粘合性能和光澤特性，並具有良好的金屬化特性。我國曾採用吡嗪-2，3-二羧酸為原料生產吡嗪醯胺，由於產品質量、成本等因素，20世紀90年代開始改用2-氰基吡溱作原料。由於我國2-氰基吡,合成技術較落後，直到20世紀末2-氰基吡嗪一直依靠進口解決。由於國內尚無能穩定正常生產的廠家，而進口供貨無保障，國內市場價格與國際市場價同步，因產需矛盾突出已經嚴重製約我國抗結核藥吡嗪醯胺的生產。20世紀80年代後期，生物催化在有機合成中的應用日益受到化學家的青睞。腈水合酶是某些微生物在進行坊或脲代謝過程中產生的一種蛋白質，利用其可將丙烯腈(AN)的腈基(-CN)催化水合為醯胺(-CONH2)。1980年，日本的Yamada等人首次發現微生物i^o^cococcwsp.N2774腈水合酶可降解有毒的乙腈，不久該菌種被成功地應用於工業生產丙烯醯胺，該工藝在我國、日本、俄羅斯已實現工業化。而利用腈水合酶生產吡溱醯胺，國內外尚未見工業化報導。本發明旨在篩選得到具有2-氰基吡嗪水合酶活性的菌林，以吡。秦醯胺產率為主要指標，建立一條新的吡嗪醯胺生物合成工藝。生物法生產吡嗪醯胺，為清潔生產吡嗪醯胺提供強有力的技術支持，開發具有自主智慧財產權的利用微生物腈水合酶清潔生產吡嗪醯胺的工藝勢在必行。
發明內容本發明目的是提供一種生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法，及其製備過程中所用到的一抹新菌林一一粘質沙雷氏菌(marcescms)ZJB-09104。本發明採用的技術方案是一種生物催化2-氰基吡溱生產吡嗪醯胺的方法，所述方法包括在以2-氰基p比口秦為底物、以粘質沙雷氏菌(5^radamarcascera)培養獲得的腈水合酶為催化劑的反應體系中，於pH6.08.0、2040。C下進行催化水合反應，製得所述吡"秦醯胺。所迷腈水合酶用量以使2-氰基吡。秦充分反應為宜，也可過量。優選的，所述粘質沙雷氏菌為粘質沙雷氏菌(Serraf/amarcescera)ZJB-09104,保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學430072，保藏日期2008年11月18日，保藏編號CCTCCNo.M208231。優選的，所述反應體系中，所述底物2-氰基吡。秦初始濃度為1050g/L。所述腈水合酶來自粘質沙雷氏菌培養獲得的含酶細胞，所述反應體系中含酶細胞終濃度以含酶細胞溼重計為l50g/L。所述含酶細胞由可如下方法製備得到粘質沙雷氏菌接種至適用於粘質沙雷氏菌的發酵培養基中，在2(TC40。C、初始pH4.08.0條件下震蕩培養至菌體對數生長期，離心分離，得到所述含酶細胞。所述適用於粘質沙雷氏菌的發酵培養基為本領域常規適用於粘質沙雷氏菌的發酵培養基，本發明中，所述發酵培養基組成如下(g/L):葡萄糖5~50,酵母膏卜20，尿素1~20，味精0.15,K2HPO40.120,KH2P040.1~5,MgS040.1-20,CoCl2或FeS040.051，溶劑為水，pH值4.08.0。具體的，所述方法如下(1)粘質沙雷氏菌ZJB-09104接種至種子培養基，2832。C培養1824小時，得到種子液；所述種子培養基組成如下(g/L):蔗糖580,酵母粉卜20,NaCl0.卜5,K2HPO40.1l,MgSO40.1l,溶劑為水，pH值4.08.0;(2)步驟(1)種子液以110。/。體積比接種至發酵培養基，在20。C40。C、初始pH4.08.0條件下震蕩培養至菌體對數生長期，6離心分離，得到菌體含酶細胞；所述發酵培養基組成如下(g/L):葡萄糖550,酵母膏120,尿素1~20,味精0.1~5,K2HP040.120,KH2P040.1~5,MgS040.1~20，CoCl2或FeS040.05~1,溶劑為水，pHl直6.07.0;(3)步驟(2)菌體含酶細胞添加至含有2-氰基吡口秦的反應體系中，轉化體系的溶劑選擇純水或磷酸鹽緩沖液，所述反應體系中菌體含酶細胞以含酶細胞溼重計濃度為l~20g/L,2-氰基吡。秦濃度為10~30g/L，於pH6.08.0、2040°C下進行催化水合反應2030h,製得所述吡溱醯胺。反應液中吡噪醯胺濃度的測定採用高效液相色譜方法對步驟(4)獲得的反應液中的吡嗪醯胺含量的測定lmL轉化液，離心，上清液進行氣相色譜分析GC-14C氣相色語儀，不鏽鋼填充柱，填料為PorapakQ,長2m,內徑4mm,柱溫220。C,進樣溫度160。C,檢測溫度220。C,載氣為氮氣，流速30ml/min，進樣量為0.8pl。其中，吡口秦醯胺出峰時間為4.2min-5.2min,確定樣品中p比溱醯胺的含量。本發明還涉及篩選到的一林新菌林——粘質沙雷氏菌(6^ra"awarc^cew)ZJB-09104，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學430072,保藏日期2008年11月18日，保藏編號CCTCCNo.M208231。該菌4^由如下方法篩選得到從浙江省杭州市某藥廠附近取土樣10份，取完後在12h之內迅速篩選菌種，篩選的具體方法是將樣品在富集培養基中富集培養24h後，再塗布於篩選培養基平板上；經過平板篩選，共分離獲得5抹可生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的菌抹；經進一步復篩，最終得目標菌株ZJB-09104。本發明篩選得到的菌抹ZJB-09104，按《常見細菌系統鑑定手冊》以及《伯傑氏細菌鑑定手冊(第八版)》的生理生化鑑定，菌林的形態呈近似為5求形的短杆狀，寬1.15(im~1.26(am,長1.15pm1.73(am,菌體運動，革蘭氏陰性，周身生有鞭毛，在LB平板上30。C培養24h，菌落呈圓形,邊緣整齊，稍突起，白色，不透明，無光澤、易挑取，於30。C恆溫培養24h，單菌落直徑約l2mm;16SrDNA序列分析以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物:pl6S-8:5'-agagtttgatectggetcag-3'和pl6S-1541:5'-aaggaggtgatecagccgca-3'擴增菌株的16SrDNA基因，將基因產物同T載體連接，經測序確認該片段實際長度為1534bp，將該序列(已提交GenBank,GenBank登記號為FJ479790)與GenBank中相關數據進行相似性分析發現，該菌與粘質沙雷氏菌(5^ra"c;wa/r"cera)的同源性最高(homology,99%/1543bps,basedon16SrDNA)。根據以上微生物學特徵鑑定，該新菌抹ZJB-09104屬於粘質沙雷氏菌(&rra"amwcesce似)，該林微生物不屬於現己公開菌種的任何一種，該抹微生物具有生物催化2-氰基吡。秦生產吡溱醯胺的能力，可以用於吡。秦醯胺的生產。本發明的有益效果主要體現在(1)、本發明從微生物群中篩選得到可生物催化生產吡。秦醯胺的粘質沙雷氏菌(5^ra^jfmwcwcera):CCTCCNo.M208231。，其在適合條件下，能有效生產吡口秦醯胺；(2)、本發明將粘質沙雷氏菌菌林ZJB-09104用於生物催化生產吡。秦醯胺實驗，結果表明，該菌可有效生物催化生產吡溱醯胺，12h內2-氰基吡溱轉化率達到83.80/。(見實施例3、4),因此該菌在生物催化生產吡。秦醯胺的領域中具有廣泛的應用前景。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1:新菌抹ZJB-09104的篩選本發明從浙江省杭州市某藥廠附近取得土樣10份，在12h之內迅速從中篩選菌種；篩選的具體方法是先將樣品在富集培養基中富集培養24h後，再塗布在含2-氰基吡。秦的篩選培養基平板上；經過平板篩選，共分離獲得5林可生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的菌株；將該5抹菌抹先分別按5%接種量4殳入發酵培養基培養24h後，離心獲得菌體。將0.1g溼菌體加入終濃度為10g/L的2-氰基吡。秦的反應液中，反應24小時後，分別測定吡嗪醯胺的含量，從中篩選出生產吡嗪醯胺能力最強的菌株ZJB-09104,作為進一步研究的出發菌抹。所述富集培養基配方為蔗糖2g,酵母粉10g,NaCl2g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g，以自來水補足至1000mL,pH值4.08.0。所述篩選培養基為蔗糖20g，酵母粉10g,NaCl2g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,2-氰基吡。秦10g,瓊脂粉20g，以自來水補足至lOOOmL,pH值7.0。所述發酵培養基配方為葡萄糖30g,酵母膏20g，尿素10g,味精3g,K2HP040.5g,KH2P043g,MgS045g,CoCl20.5g,以自來水補足至1000mL，pH值7.0。9實施例2:新菌抹ZJB-09104的鑑定對實施例1篩選得到的菌株ZJB-09104按《伯傑氏細菌鑑定手冊(第八版)》，以及《常見細菌系統鑑定手冊》進行生理生化特性鑑定(見表l):該菌林菌落呈圓形，邊緣整齊，稍突起，白色，不透明，無光澤、易挑取，於30。C恆溫培養24h,單菌落直徑約l2mm,菌體呈短杆狀；在上述基礎上，進一步將菌林ZJB-09104按精編分子生物學實驗指南方法提取染色體DNA,以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物pl6S-8:5'-agagtttgatectggetcag-3'禾口pl6S-1541:5'-aaggaggtgatccagccgca-3'擴增菌林的16SrDNA基因，將基因產物同T載體連接後，委託大連寶生物科技厶司對該菌16SrDNA擴增及測序，得到該菌一朱的16SrDNA序列後，在NCBI網站上用BLAST檢索GenBank中相關菌林的16SrDNA基因序列，並進行同源性比對；基於形態、生理生化特徵和16SrDNA序列及系統發育學分析等方面的鑑定，將菌林ZJB-09104鑑定為粘質沙雷氏菌，擬命名為粘質沙雷氏菌(5ferra"a)ZJB-09104,此菌林已於2008年11月17日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNo.M208231。。表1:菌抹ZJB-09104與沙雷氏菌屬部分成員生理生化特性的鑑定對照tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11注+90%以上陽性，-90%以上陰性。菌抹ZJB-09104CCTCCNo.M208231的16SrDNA序列如下:CGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCT。實施例3:利用菌抹ZJB-09104生物催化生產吡溱醯胺按以下步驟進行(1)斜面培養基的配製蔗糖10g,酵母粉10g，NaCl5g,K2HP040.1g，MgSO40.3g，瓊脂粉20g，以自來水補足至1000mL,pH值6;種子培養基的配製(g/L):蔗糖10,酵母4分5，NaCll,K2HPO40.5,MgSO40.1,溶劑為水，pH值4.08.0。(2)菌種的活化培養採用步驟(1)斜面培養基，將粘質沙雷氏菌(Se/ra"amarcesce"s)新菌林ZJB-09104CCTCCNo.M208231，在30°C活化、培養18h後，備用；(3)種子液的製備將步驟(2)活化後的微生物2環接入(1)中所述種子培養基中，在培養條件30。C，200r/min下培養24h。(4)菌種的發酵培養將步驟(3)菌種液按5%體積比接種量接入發酵培養基中，在培養條件30。C，在200r/min下培養36h,至菌體對數生長期後，進行離心分離，得到菌體；發酵培養基配方為葡萄糖20g，酵母膏10g,尿素15g,味精lg,K2HPO40.2g,KH2P042g,MgS043g,CoCl20.2g，以自來水補足至1000mL，pH值7.0。(5)生物催化2-氰基吡口秦生產吡。秦醯胺將步驟(4)得到的溼菌體O.lg加入到10ml含有0.2g2-氰基吡。秦的0.1M磷酸鹽緩衝液(pH8.0)反應體系中，30°C,150r/min反應24h,;(6)轉化液中吡嗪醯胺含量的測定lmL轉化液，離心，上清液進行氣相色譜分析GC-14C氣相色譜儀，不鏽鋼填充柱，填料為PompakQ，長2m，內徑4mm，柱溫220。C,進樣溫度160。C,檢測溫度220。C,載氣為氮氣，流速30mL/min，進樣量為0.8(iL。其中，吡嗪醯胺出峰時間為4.2min~5.2min,確定樣品中吡溱醯胺的含量為16.7g/L,轉化率為71.4%。實施例4:利用菌一朱ZJB-09104生物催化生產吡。秦醯胺(1)斜面培養基的配製該培養基的組分與各組分的重量百分比含量為蔗糖1.5%，酵母粉0.5%,NaCl0.5%,K2HP040.01%,MgS040.03%,瓊脂粉2%,以自來水補足至100%,pH值6;(2)菌種的活化培養採用步驟(1)培養基，將粘質沙雷氏菌(5^ra^warc^cera)新菌林ZJB-09104CCTCCNo.M208231，30。C活化、培養18h後，備用；(3)種子液的製備將步驟(2)活化後的微生物2環接入(1)中所述種子培養基中，在培養條件30。C,在200r/min下培養24h。(4)菌種的發酵培養將步驟(3)菌種液按5%體積比接種量接入發酵培養基中，在培養條件28。C，在200r/min下培養36h,至菌體對數生長期後，進行離心分離，得到菌體；發酵培養基配方為(g/L):葡萄糖15，酵母膏20,尿素10，味精3，K2HPO40.5,KH2P041,MgS045，FeSO40.5,以自來水補足至1000mL,pH值7.0。(5)生物催化2-氰基吡,生產吡。秦醯胺將步驟(4)得到的溼菌體O.lg加入到10mL含有0.2g2-氰基吡。秦的0.1M磷酸鹽緩衝液(pH8.0)反應體系中，30°C，150r/min反應24h,;(6)轉化液中吡。秦醯胺含量的測定同實施例3。經測定轉化液中的吡溱醯胺含量為19.6g/L,轉化率為83.8%。13序列表—ST25.txtSEQUENCELISTING浙江工業大學生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法及其菌株<160〉3<170〉Patentlnversion3.4120DNAUnknown人工序列1agagtttgatcctggctcag20220DNAUnknown人工序列2aaggaggtgatccagccgca2031534DNASerratiamarcescens3aaggaggtgatccagccgcaggttcccctacggttaccttgttacgacttcaccccagtc60atgaatcacaaagtggtaagcgccctcccgaaggttaagctacctacttcttttgcaacc120cactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtagcatt180ctgatctacgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccgg240序列表一ST25.txtactacgacgtactttatgaggtccgcttgctctcgcgaggtcgcttctctttgtatacgc300cattgtagqacgtgtgtagccctgctcgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccac360cttcctccagtttatcactggcagtctcctttgagttcccggccgaaccgctggcaacaa420aggataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatttcacaacacgagctgacga480cagccatgcagcacctgtctcagagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttct540ctggatgtcaagagtaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccac600cgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccagg660cggtcgatttaacgcgttagctccggaagccacgcctcaagggcacaacctccaaatcga720catcgtttacagcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgca780cctgagcgtcagtcttcgtccagggggccgccttcgccaccggtattcctccagatctct840acgcatttcaccgctacacctggaattctacccccctctacgagactctagcttgccagt900ttcaaatgcagttcccaggtt眺cccggggatttcacatctgacttaacaaaccgcctg960cgtgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattaccgcggctg1020ctggcacggagttagccggtgcttcttotgcgagtaacgtcaattgatgaacgtattaag1080ctcaccaccttcctcctcgctgaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgc1140ggcatggctgcatcagacttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtag1200gagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctggtcatcctctcagaccagctagggat1260cgtcgcctaggtgagccattaccccacctactagctaatcccatctgggcacatctgatg1320gcaagaggcccgaaggtccccctctttggtcttgcgacgttatgcggtattagctaccgt1380ttccagtagttatccccctccatcaggcagtttcccagacattactcacccgtccgccgc1440tcgtcacccagggagcaagctcccctgtgctaccgctcgacttgcatgtgttaagcctgc1500cgccagcgttcaatctgagccaggatcaaactct15341權利要求1.一種生物催化2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法，所述方法包括在以2-氰基吡嗪為底物、以粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)培養獲得的腈水合酶為催化劑的反應體系中，於pH6.0～8.0、20～40℃下進行催化水合反應，製得所述吡嗪醯胺。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述粘質沙雷氏菌為粘質沙雷氏菌(5"erraft'amarcescem)ZJB-09104，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期2008年11月18日，保藏編號CCTCCNo.M208231。3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述反應體系中，所述底物2-氰基吡。秦初始濃度為10-50g/L。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述腈水合酶來自粘質沙雷氏菌培養獲得的含酶細胞，所述反應體系中含酶細胞終濃度以含酶細胞溼重計為150g/L。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述含酶細胞由如下方法製備得到粘質沙雷氏菌接種至適用於粘質沙雷氏菌的發酵培養基中，在20。C40。C、初始pH4.08.0條件下震蕩培養至菌體對數生長期，離心分離，得到所述含酶細胞。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述適用於粘質沙雷氏菌的發酵培養基組成如下葡萄糖550g/L，酵母膏120g/L,尿素120g/L,味精0.1~5g/L,K2HPO40.1~20g/L，KH2PO40.15g/L,MgSO40.120g/L，CoCl2或FeS040.051g/L,溶劑為水，pH值4.08.0。7.如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述方法如下(1)粘質沙雷氏菌ZJB-09104接種至種子培養基，2832。C培養18-24小時，得到種子液；所述種子培養基組成如下蔗糖580g/L,酵母粉l~20g/L,NaCl0.1~5g/L,K2HPO40.1lg/L，MgSO40.1~lg/L，溶劑為水，pH^直4.0-8.0;(2)步驟(1)種子液以1~10%體積比接種至發酵培養基，在20。C40。C、初始pH4.0~8.0條件下震蕩培養至菌體對數生長期，離心分離，得到菌體含酶細胞；所述發酵培養基組成如下葡萄糖5~50g/L，酵母膏l~20g/L,尿素l~20g/L，味精0.15g/L，K2HPO40.120g/L,KH2PO40.15g/L,MgS040.1~20g/L，CoCl2或FeS040.05~1g/L,溶劑為水，pH值6.07.0;(3)步驟(2)菌體含酶細胞添加至含有2-氰基吡嗪的0.1M、pH8.0的磷酸鹽緩沖液反應體系中，所述反應體系中菌體含酶細胞以含酶細胞溼重計濃度為l20g/L,2-氰基吡。秦濃度為1030g/L,於pH6.0~8.0、2040。C下進行催化水合反應20~30h，製得所述吡。秦醯胺。8.粘質沙雷氏菌(&rrariam^r"cm)ZJB-09104,保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學430072,保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期2008年11月18日，保藏編號CCTCCNo.M208231。全文摘要本發明提供了一種生物催化生產2-氰基吡嗪生產吡嗪醯胺的方法，及其製備過程中所用到的一株新菌株——粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ZJB-09104。所述方法包括在以2-氰基吡嗪為底物、以粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)培養獲得的腈水合酶為催化劑的反應體系中，於pH6.0～8.0、20～40℃下進行催化水合反應，製得所述吡嗪醯胺。本發明將粘質沙雷氏菌菌株ZJB-09104用於生物催化生產吡嗪醯胺實驗，結果表明，該菌可有效生物催化生產吡嗪醯胺，12h內2-氰基吡嗪轉化率達到83.8％，因此該菌在生物催化生產吡嗪醯胺的領域中具有廣泛的應用前景。文檔編號C12P17/12GK101481713SQ200810163750公開日2009年7月15日申請日期2008年12月30日優先權日2008年12月30日發明者柳志強,沈寅初,薛亞平,鄭裕國,金利群申請人:浙江工業大學