雜交支持體和固定雜交體的方法
2023-07-06 10:58:01 1
專利名稱：雜交支持體和固定雜交體的方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠在其上固定核酸且在分子生物學和基因工程相關的技術中有用的雜交支持體，以及一種固定寡核苷酸、cDNA或gDNA的雜交體的方法。
對於基因分析，最近已經開發了基因晶片以大大加快分析的速度。然而，常規的DNA晶片是通過將多聚體如聚賴氨酸置於玻璃載玻片或矽基質的表面並隨後在其上固定DNA而製備的。除此之外，也採用的是根據半導體技術如光刻法在玻璃基質上合成寡核苷酸的方法。
然而，在將多聚體如聚賴氨酸置於玻璃載玻片或矽基質的表面以在其上固定DNA的方法中，DNA的固定是不穩定的，且該方法存在DNA在雜交步驟或洗滌步驟中剝落的問題。另外，根據半導體技術製作的DNA晶片存在的問題在於它們因為生產過程複雜而極其昂貴。
為了解決這些問題，必須將DNA密集且牢固地固定在固體支持體的表面。
另一方面，已知的是一種表面已被化學修飾的固體支持體。然而，當目的DNA通過醯胺鍵直接結合到化學修飾的部分時，DNA的末端部分可在化學鍵合等處理中被破壞。因此，期望改進該支持體。
本發明的一個目的是提供核苷酸固定的支持體，該支持體使得能夠進行有效的DNA分析而不如上文所述損害DNA的末端部分，且在分子生物學和基因工程技術等領域是有用的。
發明內容
本發明者發現當將雜交的寡核苷酸固定在化學修飾的支持體上進行固定時，寡核苷酸在垂直於固定支持體表面的方向固定並使得易於讀取單鹼基多態性(monobasic polymorphism)的DNA信息。
特別地，權利要求1的發明提供了一種雜交支持體，其特徵在於在其上固定了雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA。優選地，雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。同樣優選地，具伯胺的核苷酸是脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸或脫氧鳥苷酸。同樣優選地，具伯胺的核苷酸存在於5』-末端一側。同樣優選地，寡核苷酸具有5』-突出端。cDNA可以通過用寡核苷酸作為引物而合成，該寡核苷酸在5』-末端一側包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。gDNA特徵在於它是用限制性元件進行切割以在5』-末端一側包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。gDNA特徵在於它是用限制性元件進行切割以在5』-突出端一側包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。更進一步地，期望將脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸或脫氧鳥苷酸固定在雜交支持體的一面以進行固定。同樣優選地，雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA在用於固定的末端含有1到10個具伯胺的核苷酸。
權利要求11的發明是固定寡核苷酸、cDNA或gDNA雜交體的方法，它包含化學修飾支持體以進行雜交，在其上固定雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA，然後將沒有固定在支持體上的互補寡核苷酸、cDNA或gDNA去雜交(dehybridizing)。優選地，對雜交支持體的化學修飾包含對支持體表面依次的氯化、氨基化和羧基化。
實現本發明的最佳模式在本發明的雜交支持體上，通過化學修飾固定了雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA，且該支持體特徵在於寡核苷酸、cDNA或gDNA是垂直地固定在支持體上的。該支持體從而使得易於讀取單鹼基多態性的cDNA信息。
在將雜交的寡核苷酸固定在支持體上之後，使互補的寡核苷酸去雜交，然後讀取保持在支持體上的寡核苷酸信息。
在那種作用下，該寡核苷酸不可避免地是雙鏈的核酸如DNA等。該寡核苷酸包括那些衍生自高等動物、真菌、細菌、病毒等的天然的寡核苷酸以及那些通過人工修飾其結構而衍生自天然寡核苷酸的修飾的寡核苷酸和合成的寡核苷酸。優選地，該寡核苷酸可根據下面提到的方法以簡化的方式合成。
期望構成寡核苷酸的鹼基數目為10到50。
本發明的雜交支持體可根據下面提到的方法以簡化的方式製作。
(1)雜交支持體的化學修飾在本發明中，如上所述的寡核苷酸是固定在化學修飾的雜交支持體上的。
雜交支持體包括玻璃、金剛石；金屬如金、銀、銅、鋁、鎢、鉬；上面提到的玻璃、金剛石或金屬與陶瓷製品的薄片製品；以及塑料如聚碳酸酯、氟樹脂。
任何其他的材料只要它們是化學穩定的就可以使用，如石墨、金剛石樣的碳等。上面提到的材料的混合物或薄片製品也是可用的。例如用金剛石樣的碳包被的玻璃載玻片在此處就是可用的。
在那些材料中，優選的是金剛石或金剛石樣的碳，這是因為在其上的DNA固定密度是極其高的。
金剛石可以是任何合成的金剛石、高壓澆鑄的金剛石或天然的金剛石等。其結構可具有單晶體或多晶體的任意一種形式。從其生產力的觀點看，那些通過氣相合成的金剛石是優選的，如通過微波等離子體輔助的CVD生產的。
金剛石或金剛石樣的碳可用任何已知的方法形成。例如，這些方法包括微波等離子體輔助的CVD、ECRCVD、IPC、DC濺射法、ECR濺射法、離子電鍍法、電弧離子電鍍法、EB蒸汽沉積、電阻加熱蒸汽沉積等。關於金屬粉末、陶瓷粉末等，可以通過使用壓力機將這些材料壓進新鮮壓塊(green compact)中，且可在高溫下使其燒結。
優選地，有意使支持體的表面變粗糙。粗糙的表面由於其表面積增加而有利於固定大量的DNA等。支持體的形狀沒有特別地定義，可以為扁平的、紗狀的、球形的、多角形的、粉狀的等。
包含金剛石或金剛石樣的碳的雜交支持體可為金剛石或金剛石樣的碳與任何其他物質的複合材料(例如一種二相的複合材料)。
化學修飾是為了使多核苷酸結合到修飾的支持體上的，且是通過用烴基基團取代固體支持體的表面而獲得的，該烴基基團在其末端有一個功能基團如羥基、羧基、環氧基或氨基。優選地，該烴基基團的烴基部分具有0到12個碳原子，更優選地為0到6個碳原子。其實施例為單羧酸如甲酸、乙酸、丙酸；二元羧酸如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸；和多元羧酸如偏苯三酸。在這些羧酸中，草酸和琥珀酸是優選的。
優選地，烴基基團是通過醯胺鍵結合到固體支持體的表面的。該醯胺鍵結合促進並增強了化學修飾。
該化學修飾可通過用UV射線照射雜交支持體的表面以使其氯化，在氨氣中進一步用UV射線照射以使其氨基化，且其後用適當的醯基氯或多元羧酸酸酐使其羧基化來獲得。
(2)雜交的寡核苷酸的固定其次，將雜交的寡核苷酸(在下文中稱為寡核苷酸H)通過醯胺鍵固定在化學修飾的部分。將含有寡核苷酸H(參見序列列表中的SEQ ID NO 5)的液體點樣在雜交支持體上並藉此使在寡核苷酸的5』-末端含有的伯胺結合到支持體上。在固定之前，化學修飾的烴基基團末端是優選地用脫水縮合劑活化的，因為這可以促進固定。具體而言地，碳二亞胺是優選地作為脫水縮合劑的。
除方法之外，其上用於固定寡核苷酸的支持體表面可被氯化和氨基化(但不羧基化)，並且這樣形成的初級氨基基團可通過與活化的二酯的一個酯基脫水而縮合，該二酯是通過用N-羥基琥珀醯亞胺對二元羧酸進行預活化而製備的。
考慮到在通過醯胺鍵結合到化學修飾的雜交支持體上的容易程度，期望固定的側面有1到10個鹼基的伯胺如脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸或脫氧鳥苷酸。由於寡核苷酸H是以垂直於支持體表面的方向固定在雜交支持體上的，因此其DNA信息易於讀取。
更優選地，期望位於固定側面(5』-末端)的1到20個鹼基是脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸或脫氧鳥苷酸。
(3)寡核苷酸H是去雜交的。
將在其上固定了寡核苷酸的雜交支持體浸在約96℃的熱水中，然後用水洗滌以去雜交。實施例實施例1(在其上固定了EcoRI-切割的gDNA的雜交支持體)(1)雜交支持體的化學修飾將金剛石晶片在氯氣中用UV射線照射以使其表面氯化，進一步在氨氣中用UV射線照射以使其氨基化。然後，將其浸在含有重量比為10％的醯基氯的二噁烷中進行羧基化以獲得化學修飾的晶片。
(2)用EcoRI對λ噬菌體DNA的切割將λ噬菌體DNA用EcoRI切割以回收21-kbp的片段。
將在(1)中獲得的化學修飾的晶片用氫化氨腈(hydrogencyanamide)和N-羥基琥珀醯亞胺進行活化和酯化，然後浸入前面獲得的λ噬菌體21-kbp片段的水溶液中(濃度，1μg/μl)，藉此使gDNA固定在支持體上。
通過PCR證實了那個片段的500-bp片段的擴增，這支持gDNA在與晶片垂直的方向上固定。
(3)雜交的gDNA的去雜交將在(2)中獲得的晶片浸入96℃的熱水中並洗滌以進行去雜交。
(4)對λ噬菌體21-kbp片段的Cy3標記將在(2)中獲得的21-kbp的λ噬菌體通過使用Label ITTM(由PanVera提供)而進行Cy3-標記，並形成水溶液(1μg/μl)。將該溶液在96℃加熱5分鐘，藉此將雙鏈結構轉變為單鏈結構。將在(3)中去雜交的晶片浸入到結果所得的溶液中以進行雜交，並且用螢光掃描儀測量其中的螢光亮度。結果，21-kbp的λ噬菌體是以30fmol/mm2的程度固定的。
實施例2(用固定了寡核苷酸的雜交支持體對單鹼基突變的探測)(1)雜交支持體的化學修飾將用軟金剛石包被的玻璃載玻片在氯氣中用UV射線照射以使其表面氯化，然後將其進一步在氨氣中用UV射線照射以使其氨基化。然後，將其浸在含有重量比為10％的醯基氯的1，4-二噁烷中進行羧基化以獲得化學修飾的晶片。
(2)寡核苷酸的固定利用點樣器，將被製備得具有濃度為10pmol/μl的寡核苷酸溶液A和B固定在由(1)獲得的雜交支持體上。寡核苷酸A(參見序列表中的SEQ ID NO 1)與寡核苷酸A』(參見序列表中的SEQ ID NO2)進行雜交，而寡核苷酸B(參見序列表中的SEQ ID NO 3)與寡核苷酸B』(參見序列表中的SEQ ID NO 4)進行雜交，均在4℃雜交5小時，然後將它們用作樣品。
(3)雜交將在(2)中獲得的固定了寡核苷酸的雜交支持體置於96℃的熱水中，然後將具有濃度為1pmol/μl的寡核苷酸溶液A(未雜交的)添加於其上，並且這是用玻璃蓋蓋上的。隨即將其在5℃雜交12小時。
(4)螢光觀察將在(3)中獲得的支持體洗滌並乾燥，然後用螢光掃描儀進行觀察。結果，寡核苷酸A固定的斑點顯示了螢光，但寡核苷酸B固定的斑點沒有顯示。
工業適用性在本發明的雜交支持體上，將雜交的寡核苷酸以垂直於支持體的方向固定。因此，該支持體使得能夠容易且準確地讀取DNA信息等。在讀取之前，將支持體去雜交並因此得到更準確的信息。
序列表110Toyo Kohan Co.，Ltd.120雜交支持體和固定雜交體的方法1304083PCT150JP 2000-3446511512000-11-131605210121127212DNA213人工序列4001aaa aaa aaa agt ccg gct cag cta gtc 27210221118212DNA213人工序列4002gac tag ctg agc cgg act 18210321127212DNA213人工序列4003aaa aaa aaa agt ccg tct cag cta gtc 27210421118212DNA213人工序列4004gac tag ctg aga cgg act 18210521127212DNA213人工序列4005aaa aaa aaa agt tca tct cag gta ctc 2權利要求
1.一種雜交支持體，其特徵在於雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA是固定在其上的。
2.權利要求1中所述的雜交支持體，其中雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。
3.權利要求1或2中所述的雜交支持體，其中具伯胺的核苷酸是脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸或脫氧鳥苷酸。
4.權利要求1到3中所述的雜交支持體，其中具伯胺的核苷酸位於5』-末端一側。
5.權利要求1到4中所述的雜交支持體，其中的寡核苷酸具有5』-突出端。
6.權利要求1或2中所述的雜交支持體，其中的cDNA是通過用寡核苷酸作為引物而合成的，該寡核苷酸在5』-末端一側包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。
7.權利要求1或2中所述的雜交支持體，其中的gDNA特徵在於它是用限制性內切酶進行切割以在5』-末端一側包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。
8.權利要求1、2或7中所述的雜交支持體，其中的gDNA特徵在於它是用限制性內切酶進行切割以在5』-突出端一側包含至少兩個連續的具伯胺的核苷酸。
9.權利要求1到8中所述的雜交支持體，其中的脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸或脫氧鳥苷酸是固定在雜交支持體的面上的。
10.權利要求9中所述的雜交支持體，其中固定在雜交支持體上的雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA在用於固定的末端含有1到10個具伯胺的核苷酸。
11.一種固定雜交體的方法，包含化學修飾雜交支持體，在其上固定雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA，然後將沒有固定在支持體上的互補寡核苷酸、cDNA或gDNA去雜交。
12.權利要求11中所述的固定雜交體的方法，其中對雜交支持體的化學修飾包含對支持體表面的氯化、氨基化和羧基化。
全文摘要
意圖是為了提供在分子生物學、生物化學等領域有用的雜交支持體，藉此可有效地闡明DNA而不損害DNA的末端部分。一種在其上固定有寡核苷酸、cDNA或gDNA的支持體，其是通過化學地修飾一種支持體，固定雜交的寡核苷酸、cDNA或gDNA，然後使其去雜交以得到具有固定於其上的寡核苷酸、並用於固定核苷酸的支持體而生產的。
文檔編號C12Q1/68GK1474943SQ01818712
公開日2004年2月11日 申請日期2001年11月9日 優先權日2000年11月13日
發明者岡村浩, 丹花通文, 山川薰, 大場光芳, 高木研一, 一, 文, 芳 申請人:東洋鋼鈑株式會社